全 文 ：第 51 卷 第 1 期
2 0 1 5 年 1 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 51，No. 1
Jan．，2 0 1 5
doi:10．11707 / j．1001-7488．20150108
收稿日期: 2014 － 04 － 01; 修回日期: 2014 － 09 － 26。
基金项目: 国家自然科学基金项目(31100471) ; 山西省高校重点学科建设专项资金项目 (20111051; 20131008) ; 山西省大学生创新项目
(2013365)。
* 刘辉为通讯作者。
GFP标记溶磷草木樨中华根瘤菌 CHW10B及其定殖*
任嘉红1 刘 辉2 姜 楠1 魏玉宏1 张 冰1 王 莹1
(1．长治学院生物科学与技术系 长治 046011; 2．安徽师范大学环境科学与工程学院 芜湖 241003)
摘 要: 【目的】为有效利用草木樨中华根瘤菌 CHW10B 菌株，对绿色荧光蛋白(GFP)标记的菌株在南方红豆杉
根际及其根部的定殖进行研究。【方法】采用修改的反复冻融转化方法，将穿梭载体 pGFP4412 质粒转化进入草木
樨中华根瘤菌 CHW10B 细胞，对该菌株进行 GFP 标记，筛选荧光表达强烈且稳定遗传的转化子，对转化子的细胞
及菌落形态特征进行观察，并采用钼锑抗比色法对其溶磷能力进行测定。在此基础上，以 GFP 基因标记和抗性标
记作为示踪手段，将 GFP 标记的 CHW10B 菌株接种到南方红豆杉 1 年生盆栽实生苗根表面，借助荧光显微镜及稀
释涂布技术，对根际土壤中 GFP 标记菌株进行定期回收检测。【结果】成功获得 CHW10B 菌株荧光表达强烈且稳
定遗传的 GFP 转化子，该转化子及野生菌株均为革兰氏阴性(G － )，短杆菌，但二者在 LB 固体平板上的菌落形态
有一定差别。野生菌株菌落呈圆形、边缘整齐，表面湿润黏稠，为乳白色;而标记菌株 CHW10B-GFP2 菌落表面为浅
棕色，其他一致;标记菌株溶磷能力与野生菌株接近，发酵液上清液中可溶性磷含量分别为 639． 12 和 656． 57 mg·
L － 1。GFP 标记菌株在南方红豆杉根际的数量变化幅度较大，接种 1 天根际土壤中 CHW10B 转化子菌数为
6. 08 × 107 cfu·g － 1，随后细菌数量迅速减少，15 天后标记细菌数量开始增多，25 ～ 40 天菌体数量升高并呈平稳趋
势。用荧光显微镜对接种 40 天后南方红豆杉的根部进行观察，发现在根系表面及其内部有大量发绿色荧光的
GFP 标记细胞存在。【结论】GFP 基因标记的 CHW10B 菌株在南方红豆杉幼苗根际土壤中具有持久性定殖的能
力;另外，该标记菌株能在根表面和内部定殖，具有内生性。
关键词: 南方红豆杉; 草木樨中华根瘤菌; 定殖; 绿色荧光蛋白基因
中图分类号: : Q939. 99 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2015)01 － 0074 － 06
Sinorhizobium meliloti CHW10B Strain GFP-Labelling and Its Colonization
Associated with Taxus chinensis var． mairei
Ｒen Jiahong1 Liu Hui2 Jiang Nan1 Wei Yuhong1 Zhang Bing1 Wang Ying1
(1 ． Department of Biological Science and Technology，Changzhi College Changzhi 046011;
2 ． College of Environmental Science and Engineering，Anhui Normal University Wuhu 241003)
Abstract: 【Objective】Taxus chinensis var． mairei is an endemic，endangered and first-class protected tree species in
China． This species is considered as an important botanical resource of taxol which is an effective medicinal compound
against various cancers． Phosphate solubilizing bacteria (PSB) Sinorhizobium meliloti CHW10B，which was isolated from
rhizosphere of T． chinensis var． mairei，showed significant growth-promoting effect for T． chinensis var． mairei． Survival
in the environment and efficient colonization are a necessary and vital step for plant-beneficial bacteria to playing a role in
plants． In order to effectively take advantage of S． meliloti CHW10B，the colonization of this strain in rhizosphere and
roots of the seedlings of T． chinensis var． mairei was studied via the green fluorescent protein ( GFP ) gene label
technique． 【Method】The green fluorescent protein (GFP) technique is widely used to study the colonization of target
bacteria in rhizosphere and host plants． The shuttle vector pGFP4412，containing one copy of the constitutively expressed
GFP，neomycin and ampicillin resistance genes in tandem，was transformed into CHW10B strain by using the repeated
freezing and thawing methods with modification． Then the transformants with strong fluorescence expression and stable
hereditary were further screened using fluorescence microscopy． The morphological characteristics of the cell and colony for
CHW10B and CHW10B -GFP were identified and the phosphate-dissolving abilities of the two bacterial strains were
第 1 期 任嘉红等: GFP 标记溶磷草木樨中华根瘤菌 CHW10B 及其定殖
determined with the molybdenum-antimony anti-spectrophotometric method． After inoculation by pouring the bacteria to
root surface of T． chinensis var． mairei， the survival and colonization of strain CHW10B labelled with GFP were
investigated by combining antibiotics plate recovery with fluorescence microscopy． 【Ｒesult】The transformants (CHW10B-
GFP2) were successfully obtained，and the stain had strong fluorescence expression and stable hereditary． The cells of
CHW10B-GFP2 and CHW10B were both Gram-positive，short rod-shaped． The colonies of the two strains were all
circular，entire margin and a sticky． But the colors of colonies were not same，strain CHW10B was milky white，and
CHW10B-GFP was light brown． Phosphate-dissolving abilities of CHW10B-GFP2 and CHW10B were similar and the
content of soluble P in the supernatant was 639． 12 mg· L － 1 and 656． 57 mg· L － 1 in 4 days after inoculation． The
colonization amount of the strain CHW10B-GFP in the rhizosphere soil of T． chinensis var． mairei had big variations
throughout the experiment after inoculation． At the first day after inoculation，the number of the labelled cells reached
6. 08 × 107 cfu· g － 1 in the rhizosphere soil． Thereafter the bacterial population decreased sharply and then began to
increase in 15 days after inoculation． In 25 ～ 40 days after inoculation，the bacterial population subsequently increased
and leveled off． In 40 days after inoculation，many cells of this strain could be observed in the surface and inside of
seedling roots by a Fluorescent microscope． 【Conclusion】This study demonstrated that the marked strain could survive
stably in the rhizosphere of T． chinensis var． mairei． Moreover，CHW10B-GFP could colonize in the root surface and
internal of the seedlings，indicting strain CHW10B was an endophte． The study would provide a scientific basis for the
exploitation and utilization of strain CHW10B．
Key words: Taxus chinensis var． mairei; Sinorhizobium meliloti; colonization; GFP
磷(phosphorus)是植物生命活动必需的营养元
素之一，在能量代谢、碳水化合物代谢、氮代谢及物
质运转过程中起着重要的作用(Khan et al．，2007;
El-Azouni，2008; Zaidi et al．，2009)。我国大约有
74%的耕地土壤缺磷，而且土壤中 95 %的磷为难溶
性磷，植物难以吸收，提高植物对土壤中难溶性磷的
吸收的研究具有重要的应用价值。在土壤中分布有
大量具有溶磷能力的微生物，称为溶磷菌(Chabot et
al．，1996; 朱培淼等，2007; Oliveira et al．，2009)。
溶磷菌可明显提高土壤中可溶性磷的营养水平，增
加植物对磷元素的吸收，从而促进植物的生长
(Mehrvarz et al．，2008; Sharma et al．，2007)。但在
推广应用过程中，溶磷菌等植物有益菌存在田间效
果不稳定的问题 ( Zaidi et al．，2009)。大量研究表
明，有益菌的生理学特征、细胞表面性质以及植物自
身特性与土壤结构、土壤温度和土壤 pH 等因素的
综合作用，决定了有益菌在根部定殖能力的强弱及
其作用的大小。近年来，以植物有益菌引入环境为
内容的定殖微生态研究逐渐成为人们关注的重点，
尤其是现代标记基因技术的建立与发展，为细菌定
殖的微生态学研究提供了有效手段。其中，绿色荧
光蛋白( green fluorescent protein，GFP)标记系统以
荧光性能稳定、检测方便、灵敏度高以及表达不受种
属限制等特性，越来越受到重视，并被广泛用于植物
根部细菌定殖的研究 (吴沛桥等，2009; 彭祎等，
2010; Fan et al．，2012; Kelemu et al．，2013)。
南方红豆杉(Taxus chinensis var． mairei)是国家
一级保护珍稀植物，也是新型抗癌天然药物紫杉醇
(Taxol)的主要来源之一。本实验室从南方红豆杉
根际 筛 选 出 的 高 效 溶 磷 草 木 樨 中 华 根 瘤 菌
(Sinorhizobium meliloti)CHW10B 对南方红豆杉具有
明显的促生长作用，但对其根际定殖规律并不清楚
(任嘉红等，2012)。因此，本研究采用 GFP 标记技
术，对南方红豆杉植株根际上标记菌进行定期回收
检测，明确草木樨中华根瘤菌 CHW10B 在其根际的
定殖动态，为其在生产中应用提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 供试菌株、质粒 菌株: 高效溶磷草木樨中
华根瘤菌 CHW10B，由本实验室保存。
质粒: pGFP4412 质粒 (10. 6 kb)，带有组成型
表达 的 绿 色 荧 光 蛋 白 标 记 基 因 以 及 新 霉 素
(neomycin，7 μg·mL － 1)和氨苄青霉素( ampicilline，
100 μg·mL － 1 )抗性，由中国农业大学陈三凤教授
惠赠。
1. 1. 2 培养基 1) 溶磷细菌活化、保藏固体培养
基(LB): 胰蛋白胨 10. 0 g、酵母提取物 5. 0 g、氯化
钠 10. 0 g、琼脂 15. 0 ～ 20. 0 g、水 1 000 mL，pH
7. 0 ～ 7. 4。2) 溶磷细菌种子及培养液体培养基: 配
方同 LB(不添加琼脂)。3) 溶磷能力测定培养基
(NBＲIP)(Mehta et al．，2001)。
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林 业 科 学 51 卷
1. 1. 3 主要试剂和仪器 试剂: DNA maker、感受
态制备试剂盒、质粒提取试剂盒、酶切产物纯化试剂
盒、PCＲ 产物纯化试剂盒、限制性内切酶 EcoＲ I 和
Hind III 及其 Buffer 均来自大连 Takara 公司; 新霉
素、氨苄青霉素购自 Sigma 公司; 其余常规试剂均
为国产分析纯。所需 GFP 检测通用引物由华大基
因有限公司合成，引物序列为:
GFP-F: CCGTCTAGAATGAGTAAAGGAGAAG;
GFP-Ｒ: CGCAAGCTTTTATTTGTATAGTTCAT。
仪器: 蔡司 Imager A． 2 荧光显微镜、ABI Verti
PCＲ 仪、北京六一电泳仪、BioSpectrum 凝胶成像仪、
核酸蛋白检测仪 ND2000、德国 Eppendorf Centrifuge
5804Ｒ 高速低温离心机、岛津 UV2910 紫外分光光
度计和 Millipore 超纯水系统。
1. 2 方法
1. 2. 1 草木樨中华根瘤菌 CHW10B 感受态细胞的
制备 挑取活化好的单个菌落接种到 25. 0 mL LB
液体培养基中，于 30 ℃、180 r·min － 1振荡培养 18 ～
20 h 后，取 1 mL 接种到 50 mL LB 培养基中，30 ℃、
180 r·min － 1振荡培养。按照试剂盒操作步骤制备
感受态细胞，完成后置于 － 80 ℃保存备用。
1. 2. 2 载体 PGFP4412 的转化 采用修改的反复
冻融方法进行 CHW10B 菌株 GFP 基因的转化。1)
取 1 ～ 100 ng 质粒，加入 100 μL 冰上冻融的感受态
细胞(加前充分混匀); 2) 冰浴 30 min，液氮 1 min，
37 ℃水浴 3 min，冰浴 2 min; 3) 加入 890 μL 不含
抗生 素 的 LB 液 体 培 养 基，轻 轻 摇 匀，30 ℃、
180 r·min － 1振荡培养 4 ～ 6 h; 4) 5 000 r·min － 1离
心5 min，弃 900 μL 上清液后，用枪吹打均匀; 5) 将
上述菌液均匀涂布于含新霉素(7 μg·mL － 1 )和氨苄
青霉素(100 μg·mL － 1 )的 LB 固体平板上，30 ℃培
养 24 ～ 36 h，直至长出单菌落。
1. 2. 3 转化子的筛选及鉴定 1) 荧光显微镜镜检
挑取 1. 2. 2 中长出的单菌落于 1 mL 含新霉素
(7 μg·mL － 1)和氨苄青霉素(100 μg·mL － 1)的 LB
液体培养基中，于 30 ℃、180 r·min － 1摇培 16 ～ 36 h，
取少量菌液制片，在荧光显微镜下观察菌体荧光特
性，选择发光较强转化子进行稳定性检测。
2) 稳定性检测 将上述发光较强阳性转化子
的 LB 液体培养物，按照 1%的接种量接种于 50 mL
含 Amp 的 LB 液体培养基中，30 ℃、180 r·min － 1摇
培 16 ～ 18 h(约繁殖 10 代)后，将 500 μL 培养物接
入新的 1 瓶 50 mL 含 Amp 的 LB 中，并摇培，如此重
复接种和培养 9 次，约繁殖 90 代。每次培养均以上
一次的培养物作为接种液，同时制片，检测其荧光
性。随机选取大约 200 个菌体观察有无荧光特性，
以仍具荧光表型的细菌所占百分比计算转化菌株的
质粒遗传稳定性。
3) PCＲ 检测 选取荧光较强的转化子，提取质
粒，利用 GFP 基因特异引物进行 PCＲ 扩增后，用
2%琼脂糖凝胶电泳检测，观察 750 bp 处是否有特
征条带。将 PCＲ 产物送华大基因有限公司纯化测
序，并将所得序列与 pGFP4412 的 GFP 基因序列用
Bioedit 软件进行 CLUSTAL 多序列分析。
4) 酶切检测 选取荧光较强的转化子，提取质
粒，利用限制性内切酶 EcoＲ I 和 Hind Ⅲ于 37 ℃进
行双酶切。酶切产物用 0. 8%的琼脂糖凝胶电泳检
测，观察其是否有特征条带。
1. 2. 4 标记菌株与原始溶磷菌株的比较 1) 形态
特征的对比 将 CHW10B 野生菌株与相应的 GFP
标记菌株分别过夜活化，按 1% 的接种量接种于
50 mL不含抗生素的 LB 液体培养基中，30 ℃、
180 r·min － 1摇培 16 ～18 h。利用紫外分析仪(365 nm)
照射观察。将上述菌液梯度稀释后，分别涂布于 LB
平板上，30 ℃培养 24 ～ 36 h，观察菌落形态特征。
同时分别将野生及标记菌株接种到 LB 斜面，培养
16 ～ 18 h 后，进行革兰氏染色，记录染色结果。
2) 标记菌株溶磷能力检测 将溶磷菌株活化
后接种于 LB 液体培养基中，30 ℃摇培 18 ～ 24 h 制
成种子液，取 0. 5 mL 种子液接种于含 50 mL NBＲIP
培养液的 100 mL 三角瓶中，以接 0. 5 mL LB 液体培
养基为对照，每处理 3 个重复，30 ℃、180 r·min － 1摇
培 4 天后，4 ℃、12 857g 离心 10 min，采用钼锑抗比
色法测定上清液有效磷含量(鲁如坤，2000)。
1. 2. 5 南方红豆杉根际的接种试验 将 CHW10B
转化菌株在 LB 液体培养基中摇培 24 h(30 ℃、180
r·min － 1)后，10 000 r·min － 1离心5 min，弃上清液，
加适量无菌水冲洗，离心 3 次后，用无菌水将菌体浓
度调整为 105 cfu·mL － 1作为接种剂备用。取 5. 0 mL
接种剂缓慢接种到南方红豆杉 1 年生盆栽实生苗根
表面。每处理 30 株苗，同时以接种 5. 0 mL 无菌水
为对照; 生物学重复 3 次。分别于接种后第 1，5，
10，15，20，25，30 和 40 天取幼苗根际土壤，按照平
板稀释涂布法进行土壤菌量的测定(同时取幼苗根
际土壤 1. 0 g 于 165 ℃烘 2 h 后称重，计算水分系
数)。接种 40 天后，将幼苗的根系用无菌水冲洗干
净，进行徒手切片(纵切); 在载玻片上滴一滴无菌
水，将切片铺展其中，盖上盖玻片，用荧光显微镜察
GFP 标记菌株在根表面及其内部的定殖状况。
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第 1 期 任嘉红等: GFP 标记溶磷草木樨中华根瘤菌 CHW10B 及其定殖
2 结果与分析
2. 1 GFP 标记 CHW10B 的筛选
2. 1. 1 GFP 转化子的筛选 采用反复冻融的转化
方法获得的 GFP 标记菌株可通过抗性进行筛选; 对
在含 Amp 抗生素的平板培养基上生长的转化菌株，
利用荧光显微镜进行荧光检测。结果表明: 在蓝光
激发下，标记菌株可发出明显的绿色荧光，说明含有
绿色荧光蛋白的质粒已经在目标菌株中成功表达;
但是，不同的转化子之间荧光强弱存在明显的差异
(图版 I － 1)。选择 CHW10B 荧光表达强烈的标记
菌株做进一步的研究。
2. 1. 2 PCＲ 检测 提取强荧光转化子的质粒作为
模板，利用 GFP 基因的特异性引物(GFP-F 和 GFP-
Ｒ)进行 PCＲ 扩增。2%琼脂糖凝胶电泳检测分析，
可见有一条大小约为 750 bp 的特异性片段，这与预
期的片段大小一致(图 1)。将 PCＲ 产物送测序公
司纯化测序后，将测序结果与已知的 GFP 基因序列
进行多序列分析，二者一致，这进一步证实 GFP 基
因已成功标记 CHW10B 菌株。挑选一个 PCＲ 检测
过的阳性克隆 CHW10B-GFP2 做后续试验。
2. 1. 3 遗传稳定性检测 由图 2 可知，连续培养 90
代后，GFP 基因标记 CHW10B-GFP2 菌株仍具有很高
的遗传稳定性。这说明 pGFP4412 质粒在 CHW10B
菌株中遗传稳定性较高，该标记菌株可进一步用于在
南方红豆杉根际的定殖规律等相关研究。
图 1 GFP 基因 PCＲ 电泳检测
Fig． 1 Ｒesult of 2% agarose gel eletrophoresis of
GFP gene in strain CHW10B
M: 2 000 bp DNA marker;
1，2: 转化子提取质粒 The plasmids of CHW10B-GFP．
2. 1. 4 酶切检测结果 EcoＲ I /Hind III 双酶切所
提取转化子 CHW10B-GFP2 的质粒，纯化后的酶切
图 2 GFP 基因标记菌株 CHW10B 的质粒稳定性检测
Fig． 2 Stability of engineered strain CHW10B-GFP
产物经 0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测分析，结果如图 3
所示:泳道 1 在 10 600 bp处有一明显条带，符合
pGFP4412 质粒大小; 泳道 2 在6 200及4 400 bp处
均有明显条带，符合酶切产物预期大小，这进一步证
实 GFP 基因已成功标记于 CHW10B 菌株。
图 3 双酶切电泳检测
Fig． 3 Ｒesult of 2% agarose gel eletrophoresis of double
enzyme cleavage product
M: 12 000 bp DNA marker;
1: 转化子提取质粒 The plasmids of CHW10B-GFP;
2: 酶切产物 The product of double enzyme cleavage．
2. 2 转化子与野生菌株的比较
2. 2. 1 溶磷细菌的细胞及菌落形态特征 分别对
菌株 CHW10B 转化子及野生菌株的细胞形态和菌
落特征进行观察。革兰氏染色结果表明转化子及野
生菌株均为革兰氏阴性(G － )短杆菌，但二者在 LB
固体平板上的菌落形态有一定差别(图版 I － 2)。
野生菌株菌落呈圆形、边缘整齐，表面湿润黏稠，为
乳白色; 而标记菌株 CHW10B-GFP2 菌落表面为浅
棕色，其他特性一致。
2. 2. 2 液体培养特征比较 采用紫外分析仪在
365 nm 紫外光下观察菌株的培养特征和菌液的荧
光特性。由图版 I － 3 可以看出，标记菌株在紫外灯
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林 业 科 学 51 卷
下可释放出强烈的荧光，这进一步说明已成功将
GFP 基因导入 CHW10B 细胞中。
2. 2. 3 溶磷能力的比较 可溶性磷含量测定结果
表明，CHW10B 野生菌株及其转化子在发酵 4 天时
发酵液中可溶性磷含量分别为 656. 57 和 639. 12
mg·L － 1，说明 GFP 质粒的进入对菌株 CHW10B 的
溶磷能力影响较小。
2. 3 CHW10B 菌株在南方红豆杉根际的定殖动态
将 GFP 标记的 CHW10B 菌悬液接种到南方红
豆杉 1 年生盆栽实生苗根表面，并对根际土壤中
GFP 标记菌株进行定期回收检测，结果如图 4 所示。
检测期间，CHW10B 菌株在南方红豆杉根际的数量
变化幅度较大，总体呈下降的趋势。接种 1 天南方
红豆杉根际土壤中 CHW10B 转化菌数为 6. 08 ×
107 cfu·g － 1，可见初期细菌能大量存活; 接种 5 天细
菌数量迅速减少; 接种 15 天后，细菌代谢速率增
加、生长繁殖加快，细菌数量明显增多; 25 ～ 40 天，
菌体数量升高后，呈平稳的趋势。分析原因可能是
GFP 标记菌在根部定殖后，需逐渐适应根围的微环
境，细菌存活条件差，故菌体大量死亡，数量大幅度
变化，总体呈下降趋势; 经过一段时间的适应，标记
菌在宿主根际微生态环境中开始生存和繁殖，数量
不再下降，开始上升至平稳趋势。用荧光显微镜对
接种 40 天后南方红豆杉的根部(图版 I － 4)进行观
察，在南方红豆杉根系表面及其内部有大量发绿色
荧光 的 GFP 标 记 细 胞 存 在。这 进 一 步 说 明
CHW10B 转化菌株具有迁移性，具备从南方红豆杉
根际传输到根内部的能力，并能在南方红豆杉实生
苗根部长期稳定地定殖。
图 4 GFP 基因标记 CHW10B
在南方红豆杉根际的数量消长动态
Fig． 4 Population fluctuation of strain CHW10B tagged
with GFP gene in taxus’s rhizosphere
3 结论与讨论
目前研究微生物在植物根际或体内定殖的方法
很多，如电镜观察法、免疫胶体金染色法、抗药性标
记法、报告基因标记法等。近年来，绿色荧光蛋白
(GFP)标记已经被广泛用于细菌在植物根际及植物
体的定殖研究中。本研究首先对溶磷菌株草木樨中
华根瘤菌 CHW10B 进行 GFP 标记，随后研究标记后
菌株的存活特性;在确认菌株的稳定性之后，再进行
标记菌株在南方红豆杉根际定殖的相关研究。
在研究 GFP 标记菌株与植物互作前，对标记菌
株的生长特性、稳定性等进行检测是非常必要的。
为了保证对标记菌株在植物根际及体内的长期定殖
动态进行监测，须选择荧光表达强烈且稳定遗传的
转化子，这是顺利开展定殖研究的前提和关键。如
Leff 等(1996)对大肠埃希菌 (Escherichia coli)进行
GFP 标记，结果发现标记菌株所携带的 GFP 基因几
天内便丢失，而 GFP 标记的 Pseudomanas sp． 菌株
接种到土壤后 13 个月却仍能检测到; 有研究还发
现 GFP 标 记 的 清 枯 雷 尔 氏 菌 ( Ｒalstonia
solanacearum)与野生菌株相比，标记菌株出现了生
长滞后现象(车建美等，2008)。本研究采用修改的
反复冻融的转化方法，成功地将含有绿色荧光蛋白
基因的质粒 pGFP4412 转入草木樨中华根瘤菌
CHW10B 中，通过荧光检测观测到其在蓝光单色光
模式下照射时，发出明显绿色荧光;同时 pGFP4412
质粒在同一菌株不同个体中表达的效果有一定的差
异。笔者结合连续传代的方法，最终筛选出了具有
强荧光并能稳定遗传的 CHW10B 标记菌株，而且该
菌株与原始菌株相比，对磷素的溶解能力没有降低，
证明转入的 pGFP4412 质粒对目标菌株的生理生化
影响不大，不影响其正常生长繁殖，该菌株可以满足
南方红豆杉根部定殖相关研究的需要。在前人的研
究中，pGFP4412 质 粒 主 要 用 于 属 芽 孢 杆 菌
(Bacillus) 的标记 ( Liu et al．，2006; 杨秀荣等，
2013)，本研究结果说明该质粒也适用于草木樨中
华根瘤菌的 GFP 标记。
定殖是植物有益菌发挥作用的重要因素。许多
室内效果显著的菌株在田间很难达到预期的效果，
这是由于菌株不能有效定殖于植物根际或体内。植
物根际有益菌产生的预期效果与其在植物体的定殖
能力密切相关，有益菌发挥功能的前提条件就是施
用后能在环境中存活并有效定殖。本研究表明
CHW10B 菌株能够在南方红豆杉根际土及根部长
期稳定存活，在接种 40 天后，南方红豆杉根系表面
及内部仍有大量 GFP 标记细胞存在。以上研究结
果说明，高效溶磷草木樨中华根瘤菌 CHW10B 菌株
可长期有效且稳定定殖于南方红豆杉根际及根部，
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第 1 期 任嘉红等: GFP 标记溶磷草木樨中华根瘤菌 CHW10B 及其定殖
该菌株在生产实践上具有较大的应用潜力。
南方红豆杉与土壤中的有益微生物———丛枝菌
根真菌 ( AMF)能形成共生体 (任嘉红等，2008 )。
因此，应开展溶磷草木樨中华根瘤菌 CHW10B 菌株
与 AMF 互作研究，可为开发南方红豆杉专用高效复
合菌肥，促进南方红豆杉人工林的生长和紫杉醇产
业的可持续性发展提供理论依据。
参 考 文 献
车建美，蓝江林，刘 波 ． 2008． 转绿色荧光蛋白基因的清枯雷尔
氏菌生物学特性 ． 中国农业科学，41(11) : 3626 － 3635．
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(责任编辑 朱乾坤)
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