全 文 ：林业 科学研 究 1 9 9 5 , 8 (3 ) : 2 4 1一 2 4 6
F o re s t R e s e a rc h
马尾松离体培养条件下的微繁殖
和菌根的形成 ‘
成小 飞 花晓梅 李文铀
摘要 以马尾松种胚作外植体进行不定芽诱导 。 基本培养基的种类对外植体不定芽的诱导起
着决定性的作用 , 在 G D 附加 2 . 0 m g /I J BA 的培养基上 , 外植体不定芽诱导率达 70 % 以上 。 IA A 或
N A A 的加入不利 于外植体不 定芽的诱 导 。 在不定芽生长培养基中 , 加入适量的 IB A 能促进不定芽
的伸 长生长 。 仲长至 。. s c m 以上 的嫩枝在 l /2 G D 附加 4 . o m g / L IB A 的培养基上 , 生根状况 良
好 。 生根后的小植株 , 在 1 / Z G D 培养基上接种 R t 49 菌根真菌 , 菌丝侵染进入根部 , 形成组培菌根
植株 。
关键词 马尾松 、 离体培养 、 菌根
马尾松 (p ln us m as s洲 ia na L a m b . )是我国南方的主要造林树种 。 已有许多试验表 明菌根
真菌与松根共生是松属树种正常生长和发育的必要条件川 。 本试验试图在离体条件下首先通
过组织培养技术产生大量马尾松再生小植株 , 然后在培养基上接种菌根真菌使其形成菌根 , 为
提高松苗的产量和质量提供一套有效的生物技术 。
早在 60 年代 , 国外就开始了对重要松树组织培养的探索[z] 。 30 多年来虽曾以胚 、子叶 、腋
芽和短枝等为外植体对 10 余种松进行了再生植株的研究 , 但大多数只得到了不定芽丛或伸长
的不定枝 , 只有少数几种能够获得生根的小植株〔3一 6」, 至今生根仍然是一个难题 。 吴若青 1 7 1曾
报道获得了马尾松丛生芽 , 但至今未见有成功地获得再生植株的报道 。
至于菌根接种 , 大多 以实生苗为材料 , 以 土壤和 泥炭鲜等为基质 。 1 9 7 4 年 , P ac hl e w sk i
等 已9〕曾在大试管固体琼脂基质中对欧洲赤松 (p in u 、 s刃v es trl 、 L . )进行菌根合成 , 其效果优于
泥炭鲜等其它基质 。 迄今为止 , 在试管中 , 用马尾松组培苗进行菌根接种 , 尚未见报道 。
材料与方法
马尾松种子除去外种皮 , 用 70 % 乙醇消毒 1 m in , 然后用 0 . 1 % H g C1 2 消毒 10 m in , 无菌水
洗 4一 5 次 , 剥取种胚接入不定芽诱导培养基中 。 置于光照培养箱内 , 温度为 25 士 I C , 光照强
度约为 1 5 0 0 lx , 光照周期为 1 5 h 光照 , g h 黑暗 。
L l 不定芽诱导培养基
分别选用 M S 、 G D 、 S H 及 MCM 培养基 , 加入 2 % 蔗糖 , 。. 4 % 琼脂 粉 , 将 p H 值调至 5 . 8
左右 , 附加不同浓度的 BA (6 一节基喋吟)和 IA A (叫噪乙酸) , 按 L l。(4 5 )正交试验设计川 。
在上述试验的基础上 , 进一步对培养基和激素配比进行试验 。 在 G D 和 SH 两种培养基
上 , 分别加入 1 . 0一 5 . 0 m g / L B A 和 o一 0 . 1 m g / L IA A , 按正交表 L 。(4 ’火 2 ‘)设计 。
19 9 4一 11一 0 3 收稿 。
成 小飞助理 研究员 , 李文锢 (中国林 业科学 研究院森林生态环境研 究所 北京 1。。。9 1 ) ; 花晓梅 (中国林业科学研 究院
林业研究所 ) 。
* 本文 为“八五 ”攻关课题 “湿地松 、 马尾松 、 火炬松 、 落叶松 、按树菌根应用技术研究 ”部分内容 。
2 4 2 林 业 科 学 研 究 8 卷
L Z 不定芽生长培养基
外 植体在不定芽诱导培养基上生长 30 d 左右 (或稍长 )转入 1 / ZG D (大量元素 ) 、 1 /2 G D
(大量元素)附加 IBA O . 1 m g / L 或 G A o . 5 m g / L 的培养基上 , 促进不定芽伸长 , 每隔 30 d 转换
一次新鲜培养基 。
1
.
3 不定根的形成和菌根接种
切取长至 0 . 5 c m 以上的不定枝 , 接入 1 /2 G D (大 ) , 加 IBA (叫噪丁酸)2 . 0 或 4 . 0 m g / L
的生根培养基上 , 在不定枝生根的同时或不定根形成后接种 R t4 9 菌根真菌 。 将切取嫩枝后的
剩余部分 , 转入 1 /2 G D (大 )或 1 /2 G D (大 )加 B A O . 5 m g / L 的培养基上 , 使不定芽继续生长 。
2 结果与讨论
2
.
1 培养基种类和激素浓度对外植体诱导的影响
从消毒后的种子中剥 出种胚 , 接入按 L 1 6 (4 5 )正交设计的不定芽诱导培养基中 , 30 d 后观
察外植体生长状况 , 结果见表 1 。
表 1 不同培养基和激素浓度上外植体存活率
培养基号 培养基种类 B A (n 19 /I ) IA A (m g /I ) 接种外植体数 (个 ) 外植体存活数 (个) 存活率 (% )
9463572()洲0ZC01
{:
::
{:
G D
G l)
G D
G l)
S H
S H
5 11
S H
M S
M S
M S
M S
M CM
MC M
MC M
MC M
0
.
1
.
2
.
4
.
O
.
l
.
2
.
4
.
O
.
1
.
2
.
4
.
O
.
1
.
2
.
4
.
0
0
.
0
.
1
.
0
.
0
1
.
O
.
O
.
1
.
O
O
.
2 8
3 2
28
2 2
2 5
20
3 l
2 9
:
.
30
30
30
30
30
2 7
2 8
3 O
2 6
3 0
l 8
l 2
l 8
1 4
2 4
1 5
9
6
6
0
8
l 1
1 l
在 G D 和 S H 培养基上 , 大部分外植体生长 , 保持绿色 , 当 BA 浓度为 0 . 5一 2 . 0 m g / L 时 ,
外植体存活率在 60 写以上 。 在 M S 和 MCM 两种培养基上 , 无论 B A 和 IA A 浓度高低 , 大多数
种胚外植体黄化 , 死亡 , 只有少量的外植体保持绿色 , 但胚芽端不膨大 , 转入 G D 或 1 /2 G D 培
养基上 , 外植体仍不能正常生长 , 最后死亡 。 因此 , 表 1 表明 , 决定马尾松种胚外植体存活率的
首要因素是基本培养基的种类 , G D 培养基最好 , SH 其次 , M S 和 M CM 培养基则不适用 。由于
M S 和 M CM 培养基上的外植体大部分死亡 , 影响 了对 B A 和 IA A 浓度的筛选 , 因此 ,进一步
试验了 G D 和 s H 培养基及 B A 和 IA A 浓度对外植体不定芽诱导的影响 , 表 2 结果表明 , 首先
对外植体不定芽诱导影响最大的仍然是培养基种类 , G D 和 SH 两种培养基上不定芽诱导率的
极差 R 最大 , 为 57 。 G D 培养基较 S H 更适用于马尾松不定芽的诱导 。 其次是培养基中加入或
3 期 成小飞等 : 马尾松离体培养条件下的微繁殖和菌根的形成
表 2 培养基和激素浓度对外植体
不定芽诱导的影响
率)导写诱(
导植数)诱外个被的体(
数)种个接(A/LAlgLm培养
基号
B A 培养基
(m g / I ) 种 类
1
.
0 (1)
1
.
0 (l)
2
.
0 (2 )
2
.
0 (2 )
4
.
0 (3 )
4
.
0 (3 )
5
.
0 (4 )
5
.
0 (4 )
SH (l )
G D (2 )
SH (l )
G D (2 )
SH (1 )
G l)(2 )
SH (l )
G D (2 )
0 (l)
0
.
1 (2)
0
.
1 (2 )
0 (l )
0 (l )
0
.
1 (2 )
0
.
1 (2 )
0 (l )
:: ::
::
::
::
:{
:; ::
::
::
::
1 1 1 0 0 1 8 6
1 2 1 2 5 2 4 3
I
_
3 1 1 8
1 4 8 6
:::
尺 3 9 5 7 4 1
注 : I 代表各处理水 平 卜诱导率之和 ; R 代表各处理中
最大诱导率与最 小诱导率之差 。
培养基中加 入 N A A 后 , 不定芽诱 导率
均低于 40 % , 并且在下胚轴上诱导产生愈伤
组织 。 因此与 IA A 一样 , N A A 也不利于种胚
外植体上不定芽的诱导 。
不加入 IA A 。 培养基中不加入 IA A 更有利于
外植体上不定芽的诱导 。第三为细胞分裂素
B A 浓度 。 IA A 加入与否和 BA 浓度对外植
体不定芽诱导率影响差异不 明显 , 极差 R 分
别为41 和 3 9 。不定芽诱导培养基的最佳组合
为 G D + 2 . 0 m g / L BA , 不加 IA A , 不定芽诱
导率为7 % 。
激素对外植体不定芽诱导的影响 , 一方
面与激素浓度有关 , 另一方面与激素种类有
关 。为了更进一步研究生长素类对马尾松不
定芽诱导的影响 , 在培养基中加入一定浓度
的 N A A , 观察其对不定芽诱导的影响 , 结果
见表 3 。
表 3 N AA 对外植体不定芽诱导的影响
培养 培养基 B A N A A 外植体 诱导数 诱导率
基号 种 类 (m g / I ) (m g / l ) 数 (个 ) (个 ) (% )
1 S H 2
.
0 0
.
0 1 5 4 内 3 5
2 S H 4
.
0 0
.
2 0 3 8 1 3 3 4
3 G D 2
.
0 0
.
0 5 6 2 2 2 3 5
4 G D 4
.
0 0
.
10 只5 1 3 2 4
对于大多数树种 , 细胞分裂素是离体器官发生必需的外源激素 , 细胞分裂素与生长素适当
配 比通常决定器官 发生的类型 , 但在许多针叶树培养中 , 仅附加细胞分裂素就可以诱导不定芽
发生 , 例如 , 辐射松 (p i, Zu s ,二d ia ta D . D o n )子叶在 BA 的诱导下 , 可以形成不定芽「‘。] 。
外植体接入不定芽诱导培养基后 , 胚体逐渐变为绿色 , 胚芽端膨大 , 子叶先端形成小突起 。
但在接种时 , 如果将子 叶置于培养基上 , 则绝大部分死亡 , 胚芽端不定芽诱导率也降低 。
2
.
2 不定芽的伸长
外植体接入不定芽诱导培养基 3 o d 后或稍长 , 转入不定芽生长培养基 , 每隔 30 d 左右转
换一次新鲜培养基 。 转入生长培养基后 , 在胚芽端逐渐生长出 3 一 7 个或更多的不定芽 (图版 I-
1
,
2 )
, 适当延长外植体诱导时间 , 有利于不定芽数量的增加 。 同时 , 在多个子叶的先端也形成 1
一 2 个不定芽 。
在 1 /2 G D (大 )培养基上 , 外植体上不定芽生长正常但较缓慢 , 通常需转换 1一 2 次生长培
养基后 , 不定芽才能伸长用于切割生根 。 在 1 /2 G D 中 , 加入适量的 IB A 后 , IB A 诱导胚根端萎
缩的胚根继续生长 。 胚根的生长 , 有利于营养的吸收和利用 , 不定芽伸长较在 1 /2 G D 培养基
中快 。一般转换一次新鲜培养基 (6 o d 左右 ) , 即可进行切割生根 。在 1 /2 G D 培养基中加入 G A
后 , 外植体逐渐变黄 , 5 0 % 以上的外植体在培养一段时间后 , 即黄化死亡 , 存活的外植体转入
1 /2 G D 或 1 /2 G D + IBA 0 . 1 m g / L 的培养基上 , 仍然不能恢复正常生长 , 最终死亡 。 在附加
G A 的同时 , 加入少量 IBA , 外植体存活率提高 , 但不能改变其生长状况 。
在针叶树组织培养中 , 经常遇到外植体生长缓慢的问题 , 一方面可能是因为树种本身细胞
2 4 4 林 业 科 学 研 究 8 卷
分裂频率低 , 生长缓慢 ;另一方面可能因为外植体营养需求和吸收不平衡 , 导致营养供给不足 。
在马尾松不定芽生长培养基中加入适量的 IB A , 诱导外植体基部维管组织或根的分化 , 有利于
营养的吸收 , 从而加速不定芽的伸长生长 。 G A 对细胞伸长有着较强的控制作用〔”〕。 在一些植
物离体培养诱导腋芽伸长时 , 在培养基中加入适量的 G A , 能促进腋芽的生长〔”〕。 本文试验结
果表明 , G A 不能促进马尾松不定芽的生长 。 前人也有类似 的报道〔’习 。
2
.
3 不定根和菌根的形成
当不定芽伸长至 0 . 5 c m 以上 , 即可割取嫩枝接入 1 /2 G D + IB A 2 . 0 或 4 . 0 m g /L 的生根
培养基中 。 在 1/2 G D 十 IB A 4 . 0 m g / L 的培养基上培养约 20 d 后 , 嫩枝基部形成 1一 4 条 , 长
约 0 . 2 一 0 . 3 C m 的 白色根 (图版 I一 3 , 4 ) 。在嫩枝基部与不定根之间无愈伤组织形成 。 在 1/ 2 G D
+ IB A Z
· 。 m g /L 的培养基上 , 嫩枝基部既无愈伤组织形成也不产生不定根 。 在嫩枝接入生根
培养基时 , 同时接入 R t 49 菌根 , 菌根真菌迅速生长 , 覆盖培养基表面 , 嫩枝基部不形成不定
根 。 这个结果表明菌根真菌 R t4 9 的接入 , 不能促进嫩枝上不定根的形成 。 但当嫩枝生根后 ,将
生根小植株和菌根真菌同时接入 1 /2 G D 培养基上 , 则可见菌丝包裹根尖 (图 I一 5 , 6 ) 。 关于马
尾松根与 R t4 9 真菌共生的解剖学观察将另文报道 。
总上所述 , 本试验首次在离体培养条件下 , 以马尾松种胚为外植体获得了再生小植株 , 然
后又在无菌条件下接种菌根真菌 R t 4 9 , 合成组培菌根苗 。
参 考 文 献
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3期 成小飞等:马尾松离体培养条件下的微繁殖和菌根的形成
Micropropagation and Myeorrhizae Form ation
ofPi左u丁优口丁了0刀iC作忍LSl b
.
i儿 Vit阳
C人‘ng Xiaoje i H ua Xiao m ei LiWenjia n
Abstract The m atu re em bryos ofPi
nu : m a : : onian a w ere u sed a
s ex plan ts to induee ad
-
vo n ririo us bud
s o n GD
、
SH
、
MS or MCM m edium supplem ented w ith 0
.
5、 4. 0 m g /L BA and
0
. 。一 1. 0 m g /L IAA
.
It has bee
n sho w ed that the basio m edi
u m played a dete
rm in ative role
in initiating the adven titious buds
.
The optim aleo m bin atio n ofthe m ediu m w as GD + 2
.
0
m g /L BA
w ithou t IAA
,
o n w hich o ver seventy peroen t ofex plan ts w as induced
.
The additio n
ofIAA or NAA w as disadvan tag eo us to the fo rm atio n ofadven titious buds
.
By adding opti
-
m alcon een tratio n ofIBA in the g row rh m edium
, the elo ng ation ofthe ad
ven titou s buds w as
im pro ved
.
The elon gared shoo ts w ere induoed to pro duee adven titious roots on l/2 GD m edi
-
um supplem ented w ith 4
.
0 m g /L IBA
.
Bo th the pl
an tlets and m yco
rrhizalfun giRt49
w ere
Ino culated on l/2 GD
m ediu m sim ultaneou sly
.
The m yeo rrhiz alf
u ngiinfeeted the roo t tips
and the
n m yeorrhizae fo
rm ed
.
Key w o rds Pinus 阴a、: on iana , in vitro , m yeo rrhizae
CI、en g Xiaofei
,
Assistant Pro fe、、or , I
,
1W endian (The Ro seareh Institute ofEeo lo gy and Environm en t
,
CAF压iling
1。。091) ;Hua Xiaom ei(The Researeh In stitu re ofForestry, CAF).
3期 成小飞等:马尾松离体培养条件下的微繁殖和菌根的形成
Micropropagation and Myeorrhizae Form ation
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MS or MCM m edium supplem ented w ith 0
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n sho w ed that the basio m edi
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rm in ative role
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The optim aleo m bin atio n ofthe m ediu m w as GD + 2
.
0
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w ithou t IAA
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By adding opti
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, the elo ng ation ofthe ad
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im pro ved
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The elon gared shoo ts w ere induoed to pro duee adven titious roots on l/2 GD m edi
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um supplem ented w ith 4
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rrhizalfun giRt49
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Ino culated on l/2 GD
m ediu m sim ultaneou sly
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The m yeo rrhiz alf
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n m yeorrhizae fo
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