全 文 ：第 51 卷 第 10 期
2 0 1 5 年 10 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 51，No. 10
Oct．，2 0 1 5
doi:10．11707 / j．1001-7488．20151016
收稿日期: 2015 － 02 － 04; 修回日期: 2015 － 03 － 25。
基金项目: 国家自然科学基金项目(31170628; 31300567)。
* 邱德有为通讯作者。
红豆杉 TcLBDs基因的克隆与表达分析*
李艳艳1 杨艳芳1 王俊青2 王 帅1 刘洪伟1 邱德有1
(1． 中国林业科学研究院林业研究所 林木遗传育种国家重点实验室 北京 100091;
2． 湖北襄阳市林业科学研究所 襄阳 441052)
摘 要: 【目的】LBD(LATEＲAL OＲGAN BOUNDAＲIES DOMAIN)转录因子在植物次生生长中具有潜在的作用。
克隆红豆杉 LBD 基因，研究 LBD 在红豆杉剥皮后树皮再生过程中的表达状况，以揭示其调控作用。【方法】在红
豆杉剥皮再生组织转录组数据库中搜索 LBD 基因，根据获得的基因序列设计引物，利用 ＲT-PCＲ 方法克隆得到 2
个红豆杉 TcLBDs 基因的 cDNA 片段，分别命名为 TcLBD1 和 TcLBD6。进一步利用生物信息学工具对其进行分析，
最后利用半定量 ＲT-PCＲ 对红豆杉不同组织、利用 qＲT-PCＲ 技术对其剥皮再生不同时期的 TcLBDs 的表达进行分
析。【结果】TcLBD1 的 cDNA 包含 549 bp 开放阅读框(OＲF)，编码 182 个氨基酸; TcLBD6 的 cDNA 包含 687 bp 开
放阅读框，编码 228 个氨基酸。TcLBD1 和 TcLBD6 编码的蛋白质分子量分别为 19. 97，25. 13 kDa，序列分析表明二
者在 N 端存在着 LBD 类转录因子特有的 LOB 结构域，都属于第 1 类(Class Ⅰ) LBD; 二者在核酸序列和氨基酸序
列水平上分别有 55. 2% 和 57. 9% 的相似性，且蛋白质二级结构也具有较高的相似性。系统进化树结果显示
TcLBD1 与北美云杉的蛋白(ABK21479)聚为一簇，亲缘关系最近; TcLBD6 与拟南芥的 AS2 /LBD6 聚在一起。组织
表达谱分析表明 TcLBD1 在茎和木质部(含形成层)中表达量明显高于根、叶片和韧皮部(含形成层)中的表达量;
TcLBD6 主要在根和茎中表达。2 个 TcLBDs 基因在红豆杉剥皮再生不同时期再生组织间的表达模式结果显示，在
其剥皮再生过程中 TcLBD1 基因表达量在 6 天时达到最高，整体呈上调表达; TcLBD6 表达水平在 18 天后显著上
调。【结论】克隆 2 个红豆杉 TcLBDs 基因，TcLBD1 和 TcLBD6，这 2 个基因在红豆杉剥皮再生过程中均有响应，推
测二者在红豆杉剥皮后树皮再生过程中起调控作用。
关键词: 红豆杉; LBD; 转录因子; 生物信息学分析; 基因表达
中图分类号: S718. 46 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2015)10 － 0126 － 08
Cloning and Expression of Lateral Organ Boundaries
Domain Genes (TcLBDs) in Taxus chinensis
Li Yanyan1 Yang Yanfang1 Wang Junqing2 Wang Shuai1 Liu Hongwei1 Qiu Deyou1
(1 ． State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding Ｒesearch Institute of Forestry，CAF Beijing 100091;
2 ． Xiangyang Institute of Forestry Science in Hubei Province Xiangyang 441052)
Abstract: 【Objective】LBD( LATEＲAL OＲGAN BOUNDAＲIES DOMAIN) transcription factors play a potential role
in plant secondary growth． The aims were to clone the cDNA of LBDs from Taxus chinensis and reveal their potential
regulatory role in tissues regeneration after bark girdling by investigating the expression profiles of these LBDs． 【Method】
According to the sequences of TcLBDs genes obtained from the transcriptome database of the regeneration tissues after bark
girdling in T． chinensis，specific primers were designed． The two LBD genes were isolated using reverse transcription-
polymerase chain reaction ( ＲT-PCＲ) ． Bioinformatic characteristics of the cloned TcLBDs were analyzed using online
service． Lastly，the expression profiles of these genes in different tissues and at different regeneration stages after bark
girdling were analyzed by semi-quantitative ＲT-PCＲ and quantitative real-time PCＲ ( qＲT-PCＲ) respectively． 【Ｒesult】
The results showed that the cDNA of TcLBD1 contained a 549 bp open reading frame (OＲF) in length which encoded
polypeptide of 182 amino acids，and TcLBD6 contained a 687 bp OＲF encoding 228 amino acid residues． The molecular
weights of TcLBD1 and TcLBD6 encoded protein were 19. 97 kDa and 25. 13 kDa，respectively． The sequences analysis
showed that the amino acid sequences of TcLBD1 and TcLBD6 contained one specific conserved LOB motifs in N-terminal
第 10 期 李艳艳等: 红豆杉 TcLBDs 基因的克隆与表达分析
and were classified into class Ⅰ of LBD transcription factors，both of them shared 55. 2% and 57. 9% sequence similarity
in nucleotide and amino acid，respectively，and had high identity with each other in secondary structure of protein．
Phylogenetic tree analysis suggested that TcLBD1 could be clustered together with protein (ABK21479) of Picea sitchensis
and they are closest in genetic relationship，TcLBD6 could be clustered with protein ASYMMETＲIC LEAVES2 /LBD6 of
Arabidopsis thaliana． The analysis of tissues expression patterns showed that the transcript abundance of TcLBD1 was
higher in stems and xylem with cambium than that in roots，leaves，phloem with cambium; while TcLBD6 was mainly
expressed in roots and stems． Through analysis of the expression patterns in regeneration tissues after bark girdling，the
mＲNA expressions of TcLBD1 appeared sharply expression after 6 days bark girdling and showed a continuously
upregulated pattern，that of TcLBD6 were found to increase notably after 18 days and show a rising trend in the following
periods．【Conclusion】 Three TcLBDs genes were cloned from T． chinensis，and their expressions were regulated in
regeneration processes after bark girdling． Our results demonstrated that TcLBD1 and TcLBD6 might play a regulatory role
in bark regeneration after bark girdling in T． chinensis．
Key words: Taxus chinensis; LBD; transcription factor; bioinformatics analysis; gene expression
LBD ( LATEＲAL OＲGAN BOUNDAＲIES
DOMAIN) /ASL(ASYMMETＲIC LEAVES 2-Like)蛋
白是植物特有的一个家族的转录因子，在植物侧生
器官原基中特异性表达(Husbands et al．，2007; Lee
et al．，2009; Majer et al．，2011)。Shuai 等(2002)通
过增强子陷阱的方法，首先在拟南芥 ( Arabidopsis
thaliana)中鉴别出 1 个在侧生器官基部特异表达的
基因，命名为 LOB 基因。ASL 和 LBD 基因含有相近
的 LOB 结构域，因此将含有该保守结构域的基因称
为 LBD。LOB 结构域跨越 100 个氨基酸左右的长
度，最显著的是包含 CX2CX6CX3C 保守结构域的 22
个氨基酸组成的 1 个类似于锌指的基序、1 个保守
的甘 氨 酸 残 基 ( G ) 和 1 个 类 似 亮 氨 酸 拉 链
(LX6LX3LX6L)的基序。根据 LOB 结构域中亮氨酸
拉链类似基序的存在与否可以将 LBD 基因归为 2
类: 含有亮氨酸拉链类似基序的一类是第 1 类
(Class I); 而缺失该基序的是第 2 类(ClassⅡ)(Shuai
et al．，2002; Iwakawa et al．，2002; Majer et al．，2011)。
自从第 1 个 LBD 蛋白结构被解析以来，目前已在拟
南芥( Iwakawa et al．，2002; Shuai et al．，2002)、水稻
(Oryza sativa)(Yang et al．，2006)、玉米(Zea mays)
(Schnable et al．，2009)、番茄(Solanum lycopersicum)
(王小非等，2013 ) 和杨树 ( Populus) ( Zhu et al．，
2007)等植物中分别发现 43，35，43，46 和 57 个具有
LOB 结构域的 LBD 蛋白。
在植物生长过程中，有些 LBD 基因在全生育期
或在所有取样的器官中均有表达，而部分 LBD 基因
仅在特定组织或特定生育阶段表达，显示典型的时
空特异表达的特点，揭示出 LBD 基因功能的多样性
(Shuai et al．，2002; Yang et al．，2006)。此外，许多
LBD 基因在植物侧生器官近轴面表达，它们在侧生
器官发育中发挥了关键作用 (Majer et al．，2011;
Shuai et al．，2002)。LBD 基因对植物的影响包括愈
伤组织分化，叶片、花序、根的形成以及茎部次生生
长等方面。在拟南芥中，异位表达 LBD 转录因子
(LBD16，LBD17，LBD18 和 LBD29)在没有外源植物
激素下足以引发其自发形成愈伤组织，可见 LBD 转
录因子在愈伤组织诱导过程中起着关键的调控作用
(Fan et al．，2012)。AS2 /LBD6 受 BOP(BLADE-ON-
PETIOLE1)诱导 ( Jun et al．，2010)，并通过与 1 个
MYB 转录因子 AS1 共同作用来调控叶极性的建立
(Byrne et al．，2000; Semiarti et al．，2001; Iwakawa
et al．，2007)。LBD18 直接结合到细胞壁松弛因子
EXP14 的 启 动 子 区 促 进 侧 根 发 育 ( Lee et al．，
2013)。LBD29 在水稻、玉米中的同源基因 CＲL1
(AＲL1) 和 Ｒtcs 分别调控各自根冠的发育 ( Hetz
et al．，1996; Inukai et al．，2005; Liu et al．，2005;
Taramino et al．，2007)。ASL1 ( LBD36) 的过表达抑
制 KNAT1 基因的过量表达，引起花和角果下垂的表
型 ( Chalfun-Junior et al．， 2005; Nakazawa et al．，
2003)。水稻的部分 LBD 基因可以控制颖壳的发育
和花序的长短(Li et al．，2008; 卢寰等，2013)。在
杨树(Populus tremula × P． alba)中，PtaLBD1 参与杨
树木材次生生长的调控，该转录因子可以显著促进
韧皮部的分化和发育(Yordanova et al．，2010)。尽
管对 LBD 基因的研究有了重大进展，但这些功能研
究大多局限于拟南芥、水稻、杨树等模式植物中，而
红豆杉 LBD 基因尚未有文献报道。
红豆杉属(Taxus)植物为多年生乔木或大型灌
木，生长缓慢，仅为一般针叶树生长速度的 1 /10。
紫杉醇( taxol)是从红豆杉属树皮中分离提取到的
天然抗肿瘤物质，是迄今为止最具抗癌活性的天然
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林 业 科 学 51 卷
化合物之一(Wani et al．，1971; Goodman，2001 )。
Strobel 等(1992)利用放射性同位素14 C 标记的乙酸
盐为底物的方法证明短叶红豆杉( Taxus brevifolia)
韧皮部合成紫杉醇的能力很强。韧皮组织对树皮的
形成也至关重要，例如在树木热绝缘性、存储、水损
失预防和害虫的保护上有重要功能 ( van Bel，
2003); 此外，通过韧皮部组织还可以向不断增长的
木质部提供光合同化物、营养、水和信号分子。大面
积剥皮后次生维管组织再生的最佳条件最先在杜仲
(Eucommia ulmoides)上建立( Li et al．，1981)，利用
该试验系统，已从转录组水平、功能基因组水平和蛋
白质组水平系统研究维管形成层发生和分化及韧皮
部、木质部形成相关的基因，探讨木本植物的次生维
管组织形成的分子机制 (Wang et al．，2009; Pang
et al．，2008; Zhang et al．，2011)，但红豆杉属的剥皮
再生及其分子机制的研究还未见报道。本研究基于
课题组前期利用高通量测序技术( Illumina HiSeqTM
2000)对红豆杉( T． chinensis)的剥皮再生组织进行
的转录组测序的数据，分析筛选得到了红豆杉
TcLBDs 片段序列，并克隆了其中 2 个 LBD cDNA 片
段，进而对其进行生物信息学分析，也研究了
TcLBDs 基因的组织表达特异性及在红豆杉剥皮再
生过程中的表达特性，以期为研究 LBD 基因在红豆
杉次生生长中的功能提供有用信息。
1 材料与方法
1. 1 植物材料 所采用的红豆杉为湖北省襄阳市
林业科学研究所提供的 10 年生实生苗和中国林业
科学研究院温室栽种的 3 年生苗。
1. 2 试验方法 1) 红豆杉剥皮再生材料与其不同
组织材料的采集 在湖北襄阳于 2013 年 6 月初选
取生长良好、干形均匀的红豆杉进行剥皮处理，此时
其形成层活动正处旺盛期。按照 Li 等(1981)的方
法进行剥皮试验，稍作改动。对选取的红豆杉从其
基部距地面约 40 cm 处开始，一直向上环剥约
25 cm，分别用无菌处理的刀片轻轻刮取暴露在外树
干的材料，做好标记，迅速投入液氮中，为剥皮当天
的材料，即第 0 天。剥皮后将树用消毒的塑料薄膜
包裹好。剥皮后第 6 天，选择第 0 天未取过样的树，
揭开塑料薄膜，刮取树干上的材料做好标记立即投
入液氮中，重新包裹好树干。剥皮后第 12，18，24，
30，36 天参照第 6 天的方法分别取样，共处理了试
验材料 15 株。同时采集 3 年生红豆杉的根、茎、叶、
包含形成层的韧皮部和包含形成层的木质部的组织
用于组织表达分析。
2) 红豆杉总 ＲNA 的提取及 TcLBDs 基因的克
隆 采集的 3 年生红豆杉的根、茎、叶、包含形成层的
韧皮部、包含形成层的木质部和红豆杉剥皮再生不
同时期的组织总 ＲNA 提取采用 EASYpin Plus 植物
ＲNA 快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公
司)。利用天根生化科技有限公司反转录试剂盒
TIANScript ＲT Kit 合成 cDNA，用于 ＲT-PCＲ 和 qＲT-
PCＲ 分析。将红豆杉的树皮提取的 ＲNA 按照
PrimeScriptTMⅡ1 st Strand cDNA Sythesis Kit(TakaＲa)
说明书进行反转录合成单链 cDNA，用于基因克隆。
以杨树中 Yordanova 等 (2010 )已发表的 PtaLBD1
(登录号 HQ284166)为 query，进行本地化 Blast 工
作，搜索课题组前期测序的红豆杉剥皮再生组织转
录组数据，筛选得到一致性为 67. 86% 和 58. 33%
的 2 条序列，分析发现这 2 条序列均具有完整开放
阅读框(OＲF)。根据这 2 条序列信息，分别在其开
放阅读框上、下游设计特异性引物 (表 1 )，采用
PrimeSTAＲ Max DNA Polymerase mix 扩增 cDNA
序列(TakaＲa)。将获得的 PCＲ 产物连接于 pEASY-
T1 载体上，并利用 ABI 3730 进行测序(中美泰和生
物技术有限公司，北京)。
3) TcLBDs 基因的生物信息学分析 利用
ExPaSy，ProtScale，SOPMA 和 Swiss-model 等生物信
息学软件对 TcLBDs 的理化性质、结构域及其高级结
构进行预测与分析，网址见表 2; 多序列比对使用
Clustalx 1. 83 软件; 用 MEGA 4. 0 软件构建进化树，
采用邻接算法( neighbor joining，NJ)，bootstrap 检测
设置重复为 1 000 次。
4) TcLBDs 基因的表达分析 采用 ＲT-PCＲ 分
析 TcLBDs 基因在正常生长的红豆杉不同组织间的
表达模式，以 Tcactin 为内参基因，引物序列见表 1。
采用 qＲT-PCＲ 检测剥皮后不同时期组织这 2 个基
因的表达水平，具体操作步骤按 SYBＲ FAST qPCＲ
Kit Master Mix(2 × )Universal(KAPA，美国)说明书
进行。以灭菌双蒸水为模板作为空白对照，在
ABI7500 仪器 (ABI，美国)上进行。目的基因相对
表达水平采用 2 － △△ CT方法 ( Livak et al．，2001)，所
有反应均为 2 次生物学重复，3 次技术性重复。
2 结果与分析
2. 1 基因克隆 利用生物信息学分析筛查红豆杉
的剥皮再生组织转录组数据库获得了 2 个 LBD 电
子序列。经 NCBI 的 BLASTx 比对及 OＲF Finder
(open reading frame finder)分析显示，二者均具有完
整的开放阅读框，并与其他植物中的 LBD 具有较高
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第 10 期 李艳艳等: 红豆杉 TcLBDs 基因的克隆与表达分析
相似性，推测为全长编码序列。利用 ＲT-PCＲ 方法
对二者进行扩增，PCＲ 产物经过 1. 0% 的琼脂糖电
泳之后，检测到 1 条 650 bp 左右的条带和 1 条
1 000 bp左右的条带。测序结果表明前者 cDNA 包
含 549 bp 开放阅读框(OＲF)，编码 182 个氨基酸;
后者 cDNA 包含 687 bp 开放阅读框，编码 228 个氨
基酸。序列结果与转录组电子序列基本一致。在
NCBI 中 BlaxtP 结果显示，前者与拟南芥 LBD1 (登
录号: NP_172268)具有 62%的一致性，后者与拟南
芥的 LBD6 /AS2(登录号: NP_176739)具有 76%的
一致性，因此将 2 个基因分别命名为 TcLBD1 和
TcLBD6。
表 1 试验所用引物
Tab． 1 The primer sequences
基因名称
Gene name
引物名称
Primer name
引物
Sequence (5— 3)
TcLBD1 LBD1-F CATCTGCTAAAGCAAAATCCTA
LBD1-Ｒ CCGTCTGGTGCCATAGAAGA
TcLBD6 LBD6-F GACCATGGCGACCACTGACCA
LBD6-Ｒ ACTGCAGTCTCTCAGTGGAC
ＲT-LBD1 ＲT-LBD1-F CCGACTGTACTGACCCACAT
ＲT-LBD1-Ｒ CCGTCTGGTGCCATAGAAGA
ＲT-LBD6 ＲT-LBD6-F ATTCGGATAAGCGGGAGGAG
ＲT-LBD6-Ｒ ACTGCAGTCTCTCAGTGGAC
Tcactin Tcactin-F AAGAGAAGCTTGCTTATGTAGC
Tcactin-Ｒ TCTGATATCCACATCACACTTC
表 2 试验所用生物信息在线分析软件
Tab． 2 The online softwares of informatics analysis
检索内容 Items 软件名称 Softwares 在线网址 Online webs
理化性质 Physical and chemical properties ExPaSy-Protparam http:∥www． expasy． org / protparam /
结构域分析 Conserved domains search ExPaSy- Scanprosite http:∥web． expasy． ch / tools / scanprosite /
二级结构分析 Secondary structure prediction SOPMA
http:∥npsa-pbil． ibcp． fr / cgi-bin / npsa_automat． pl? page =
npsa_sopma． html
三维结构模拟 Tertiary structure prediction Swiss-model http:∥swissmodel． expasy． org /
2. 2 TcLBDs 蛋白质的理化性质及结构预测分析
运用 ExPaSy-Protparam 工具对 TcLBD1 和 TcLBD6 编
码蛋白的理化性质进行了预测，其相对分子量分别为
19. 97，25. 13 kDa，理论等电点 pI 分别为 7. 74，6. 22。
蛋白的分子式预测分别为 C867 H1374 N250 O266 S13，
C1109H1721N323O327 S10，其 中 TcLBD1 带 正 电 残 基
(Arg + Lys)19 个，带负电残基(Asp + Glu)22 个; 而
TcLBD1 带正电残基和负电残基分别为 22 和 21 个。
蛋白质二级结构指它的多肽链借助氢键排列成
特有的折叠或者盘绕方式。根据 SOPMA 预测的蛋白
质二级结构分析发现，TcLBDs 蛋白的氨基酸主要由
α －螺旋(alpha helix)、无规则卷曲( random coil)和延
伸链(extended strand)和 β 转角(beta turn)4 种形式
组成，在 TcLBD1 中分别占 50. 01%，39. 01%，6. 0%和
3. 85% ; 在 TcLBD6 中 分 别 占 36. 40%，46. 93%，
11. 84%和 4. 82%。这与其他 LOB-Domain 基因表达
产物二级结构的螺旋结构分布一致 ( Shuai et al．，
2002)。由于 TcLBD6 比 TcLBD1 多了 46 个氨基酸，
且二级结构相似性较高，因此以 TcLBD6 为例，用
SWISS-MODEL 模拟其三维结构(图 1)。三维模型中
用于该模型的氨基酸残基范围为 88—208 位，该模型
以3n4x. 2. A蛋白为模板，序列同源性为 26. 00%，可以
看到 1 个大的螺旋卷曲(coiled coil motif)结构。
2. 3 TcLBDs 蛋白序列保守型分析以及进化树分析
根据 NCBI 的比对和注释结果，发现 TcLBD1 在北美
图 1 TcLBD6 蛋白三维结构分析
Fig． 1 Tertiary structure of TcLBD6
云杉 ( Picea sitchensis )、欧 洲 山 杨 × 银 白 杨
(Populus tremula × Populus alba)、毛果杨(Populus
trichocarpa)、蒺藜苜蓿 (Medicago truncatula)、可可
(Theobroma cacao)和拟南芥等植物体内中存在同源
基因; TcLBD6 在可可、毛果杨、蒺藜苜蓿和拟南芥
等物种中存在同源基因(表 3)。通过对 TcLBD1 和
TcLBD6 与上述物种的 LBD 蛋白进行多序列比对
(图 2)发现，它们与拟南芥等其他植物的 LBD 家族
的转录因子一样在 N 端存在着明显的保守区域:
CX2CX6CX3C 基序、1 个保守的甘氨酸残基(Gly)和
1 个类似亮氨酸拉链 ( LX6LX3LX6L)的基序。其中
CX2CX6CX3C 基序对于结合 DNA 是必需的; 亮氨
酸“螺旋卷曲”二级结构可能与蛋白二聚化有关，负
责和其他蛋白相互作用( Iwakawa et al．，2002; Shuai
et al．，2002; Majer et al．，2011; Matsumura et al．，
2009)。利用在线工具 Scanprosite Search 对 TcLBDs
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林 业 科 学 51 卷
进行保守结构域的分析，结果 (图 3)所示，TcLBDs
保守结构域有高度保守的大约 100 个氨基酸残基组
成，构成了 LBD 类转录因子特有的 LOB 结构域。
参照拟南芥 LBD 分类研究结果，TcLBD1 和 TcLBD6
均属于第 1 类(ClassⅠ)。
表 3 TcLBD1 和 TcLBD6 的同源基因
Tab． 3 Homological genes of TcLBD1 and TcLBD6
基因
Gene
物种
Species
序列号
Accession number
E 值
E-value
描述
Description
TcLBD1 毛果杨 Populus trichocarpa XP_002315279 1E － 54
LOB 结构域蛋白 11
Lateral organ boundaries (LOB) domain protein 11
蒺藜苜蓿 Medicago truncatula XP_007015486 2E － 54
包含 LOB 结构域蛋白 1
LOB domain-containing protein 1
欧洲山杨 ×银白杨
Populus tremula × P． alba
ADU54137 5E － 54 LOB 结构域 1 LOB domain 1
可可 Theobroma cacao XP_007009738 6E － 53
包含 LOB 结构域的蛋白 1
LOB domain-containing protein 1
北美云杉 Picea sitchensis ABK23871 2E － 52 未知功能 Unknown
拟南芥 Arabidopsis thaliana NP_172268 7E － 51
包含 LOB 结构域的蛋白 1
LOB domain-containing protein 1
TcLBD6 可可 Theobroma cacao XP_007047171 3E － 57 ASL 1 蛋白 ASYMMETＲIC LEAVES 2-like 1
毛果杨 Populus trichocarpa XP_002307250 8E － 57 LOB 结构域蛋白 28 LOB domain protein 28
毛果杨 Populus trichocarpa XP_002300051 3E － 55 LOB 结构域蛋白 25 LOB domain protein 25
拟南芥 Arabidopsis thaliana NP_176739 2E － 54 AS2 蛋白 Protein ASYMMETＲIC LEAVES 2
蒺藜苜蓿 Medicago truncatula KEH31799 2E － 56 LOB 结构域蛋白 LOB domain protein
图 2 TcLBDs 与其他植物同源蛋白的氨基酸多序列比对
Fig． 2 Multiple alignment result of TcLBDs and homological proteins of other plants
为进一步分析红豆杉 2 个 LBD 蛋白与其他物
种 LBD 蛋白的进化关系，利用 MEGA 4. 0 软件构建
了系统进化树(图 4)。结果表明，尽管 TcLBD1 和
TcLBD6 均属于 LBD 家族的 ClassⅠ类群，然而系统
进化树却明显将这 2 个蛋白分在 2 个类群: TcLBD1
与北美云杉的未知功能蛋白最先聚合，接着与拟南
芥 LBD1 ( NP _172268)聚合; TcLBD6 与拟南芥的
LBD6 /AS2(NP_176739)蛋白氨基酸序列相似性最
高，聚为一簇。
图 3 TcLBDs 保守结构域分析
Fig． 3 Conserved domains search of TcLBDs
031
第 10 期 李艳艳等: 红豆杉 TcLBDs 基因的克隆与表达分析
图 4 TcLBDs 与其他植物同源氨基酸的系统进化树
Fig． 4 Phylogenetic tree of TcLBDs and homological amino acids in other plants
2. 4 TcLBDs 基因组织表达分析 采用半定量 ＲT-
PCＲ 技术检测 2 个 TcLBDs 基因在红豆杉不同组织
中的表达情况，结果如图 5 所示，2 个基因的表达具
有明显的组织特异性，它们在正常条件下的红豆杉
的茎中均有表达。TcLBD1 在木质部(含形成层)中
表达量最高，而且茎和木质部(含形成层)中表达量
明显高于在根、韧皮部(含形成层)和叶片中的表达
量; TcLBD6 在根中表达量最高，其次是茎，在叶片
中表达量最低。
图 5 TcLBDs 基因的组织表达
Fig． 5 The tissue expression of TcLBDs in T． chinensis
1． 根; 2． 茎; 3． 叶; 4． 韧皮部(含形成层) ;
5． 木质部(含形成层)。
1． Ｒoots; 2． Stems; 3． Leaves; 4． Phloem with cambium;
5． Xylem with cambium．
2. 5 TcLBDs 基因在红豆杉剥皮再生中的表达模式
分析 利用 qＲT-PCＲ 方法研究 TcLBDs 基因在红豆
杉剥皮再生过程中的表达模式。对红豆杉剥皮后
0，6，12，18，24，30，36 天再生组织中表达情况进行
分析。结果(图 6)表明在上述再生组织中 TcLBDs
基因表达水平均上调表达。TcLBD1 在 6 天时基因
表达量达到最高，大约为对照的 40 倍，随后减少到
对照的 5 倍左右; TcLBD6 表达量在 18 天后急剧上
升，在 36 天时达到最高，是对照的 14 倍左右。
图 6 TcLBDs 基因在红豆杉剥皮再生过程中的表达
Fig． 6 Expression of TcLBDs in regeneration
after bark girdling in T． chinensis
3 结论与讨论
本研究成功克隆获得了 2 个红豆杉 LBD 基因，
并对其编码蛋白的氨基酸结构进行生物信息学分
析。结果表明 TcLBDs 氨基酸序列均具有其他植物
如杨树和拟南芥等中报道的 LOB 结构域，并属于
LBD 家族的 ClassⅠ类群。通过同源比对和进化树
等分析表明，TcLBDs 与其他植物 LBD 蛋白氨基酸
序列相似性较高，因此命名为 LBD 基因。LBD 家族
Ⅰ类成员在植物中细分为不同的亚类，不同亚类具
有部分特异氨基酸序列，如拟南芥、番茄和水稻的Ⅰ
类基因分别被分为 2，4，5 个亚类 ( Iwakawa et al．，
2002; Yang et al．，2006; 王小非等，2013)。因此推
测红豆杉的 TcLBD1 和 TcLBD6 可能分别属于不同
的亚类。进化树分析 TcLBD1 与北美云杉的登录号
ABK23871 的蛋白聚为一簇，亲缘关系最近。推测
是 由 于 红 豆 杉 与 北 美 云 杉 均 为 松 杉 纲
131
林 业 科 学 51 卷
(Coniferopsida)植物，在进化上有亲缘关系。北美
云杉的 ABK23871 蛋白是否同样为 LBD 转录因子
有待于今后进一步研究。
LBD 家族成员之一的 AS2 /LBD6 调节拟南芥叶
片木质部和韧皮部的特异化 ( Lin et al．，2003; Xu
et al．，2003; Zhu et al．，2008)，过量表达 AS2 /LBD6
形成木质部包围韧皮部组织的近轴面维管束，也有
可能是通过 KANADI1 基因的反向调控 ( Lin et al．，
2003; Xu et al．，2003; 2008; Wu et al．，2008)。研
究显示 AS2 /LBD6 也调控着木质部特异化方面有着
重要作用的 miＲ165 /miＲ166 的表达 ( Ueno et al．，
2007; Demura et al．，2007)。采用激活标记技术得
到了杨树 PtaLBD1 突变体，其表型为次生韧皮部增
厚，同时检测到 APL 基因表达水平处于上调趋势，
推测 PtaLBD1 可能参与直接激活 APL 基因的表达;
PtaLBD1 基因过量表达后杨树韧皮部的厚度显著增
加，正向调控着射线细胞的起始和增值; 而通过抑
制 PtaLBD1 表达，则减少了杨树直径增长和高度不
规则的韧皮部的发育(Yordanova et al．，2010)。在
本研究中，TcLBDs 基因主要表达在正在生长的茎
中，尤其 TcLBD1 在木质部(含形成层)表达量较高，
这暗示 TcLBDs 基因可能参与维管组织的生长发育。
在红豆杉剥皮再生过程中 TcLBD6 尤其 18 天时显
著上升、在 36 天时达到最高。红豆杉剥皮再生组织
解剖结构观察显示，在 18 天时出现不连续的扁平状
的分生组织细胞; 30 天时形成层样区域已出现，分
别向内分化形成木质部和向外形成韧皮部。这些表
明 TcLBD6 可能参与调控红豆杉次生生长———侧生
器官高度特异化的发育过程。
类似于拟南芥，愈伤组织诱导培养基(CIM)含
有大量生长素被用于其他植物体外系统培养，生长
素对愈伤细胞的诱导至关重要( Skoog et al．，1957;
Gordon et al．，2007 )，在 CIM 培养基异位诱导的
LBD16，LBD17，LBD18 和 LBD29 却在 arf7 arf19 双
突变体中大幅减弱甚至不表达，这进一步说明了部
分 LBD 基因是直接作用愈伤组织形成的 AＲFs
( auxin response factors ) 的下游基因 ( Fan et al．，
2012)。过表达拟南芥 AS2 /LBD6 或杨树 LBD1 显
示略有增加愈伤组织细胞的表型 ( Iwakawa et al．，
2002; Lee et al．，2009)。本研究的 TcLBD1 在红豆
杉剥皮再生过程中的表达量均呈现上调表达，尤其
在 6 天时表达量达到最高; 且在红豆杉剥皮再生 6
天时出现了大量愈伤组织细胞，而后愈伤细胞一直
存在。这些暗示 TcLBD1 可能直接或间接参与了植
物激素(如生长素或细胞分裂素)信号传导和愈伤
细胞的诱导过程。
本研究获得了红豆杉 2 个 TcLBDs 基因，为进一
步研究 LBD 基因对红豆杉侧生器官边界的建成的
作用打下了基础。作者课题组正在通过转基因手段
在拟南芥中对上述基因做进一步的分析，以验证它
们的功能和调控机制。
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(责任编辑 徐 红)
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