全 文 ：第 !" 卷 第 # 期
" $ % # 年 # 月
林 业 科 学
&’()*+(, &(-.,) &(*(’,)
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2345!" $ % #
6/7"%$5%%8$89:5%$$%;8<==5"$%#$#$@
收稿日期" "$%! >$# >%=# 修回日期" "$%! >$8 >"8$
基金项目"国家自然科学基金项目%?%"8$#@$& # 西北农林科技大学校基金项目%kI"$%"$%%& $
! 唐光辉为通讯作者$
核桃举肢蛾和桃蛀螟幼虫肠道细菌多样性的
D’M;IKK)和 +;Mh-D分析!
王娇莉B南小宁B任争争B明B洁B唐光辉
%西北农林科技大学林学院9核桃试验示范站B杨凌 8%"%$$&
摘B要!B(目的) 了解危害核桃果实青皮的核桃举肢蛾和桃蛀螟幼虫肠道细菌群落结构与多样性$ (方法) 采用
基于 %#& YM*,基因的变性梯度凝胶电泳%D’M;IKK)&和末端限制性片段长度多样性%+;Mh-D&技术分析 " 种害虫
幼虫肠道细菌群落特征$ (结果) %&D’M;IKK)分析显示核桃举肢蛾幼虫肠道细菌主要有沃尔巴克氏体属’肠球
菌属’肠杆菌属’根瘤菌属和假单胞菌属!其中沃尔巴克氏体属是优势菌群!占测得序列的 <$1$F#桃蛀螟幼虫肠道
细菌主要有沃尔巴克氏体属’肠球菌属’根瘤菌属和假单胞菌属!其中肠球菌属是优势菌群!占测得序列的 #"1@F$
"&IKK)条带的系统发育分析显示!核桃举肢蛾幼虫肠道中!8"1!F的菌株属变形菌门!%"1!F的菌株属于厚壁菌
门!%!1$F的菌株属于拟杆菌菌门$ 桃蛀螟幼虫肠道中!?81$F的菌株属于变形菌门!#?1$F的菌株属于厚壁菌门!
未检测到拟杆菌门细菌$ ?&+;Mh-D分析显示 8# TL 和 %"" TL +;MhZ分别是桃蛀螟和核桃举肢蛾幼虫肠道的优势
菌群!+;Mh-D的主成分和聚类分析显示核桃举肢蛾和桃蛀螟幼虫肠道细菌群落结构明显地分为 " 类$ <&D’M;
IKK)和 +;Mh-D" 种方法均显示核桃举肢蛾幼虫与桃蛀螟幼虫肠道细菌多样性差异不显著但种类组成所占比例
有较大差异$ (结论) 初步揭示了危害核桃果实的 " 种不同食性昆虫幼虫肠道细菌组成特点!可为进一步探讨其
肠道微生物与其食性之间的关系提供理论基础$
关键词"B核桃举肢蛾# 桃蛀螟# 肠道微生物# D’M;IKK)# +;Mh-D
中图分类号!&8%=1=?BBB文献标识码!,BBB文章编号!%$$% >8<==""$%##$# >$$8# >%$
7(4$%6(#, )*!"#$6#("&/]&’#$%(& 1)JJ."(#($6*%)J<.1$=*5/&%(6).&"6)$
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GE4H27E/07B*E4 P7E/474HBMO4 kRO4H]RO4HBC74H27OB+E4HK3E4HR37
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5,*0A6’%31+2&,3$2&0AE4HE46 U0/2$/*$/0+C61/,0(&*3%0+K3O4OO0EYVEOQ/4Z3N74H\E043U*ZHYOO4 R3Z[5(COUR/6) +RO%#&
YM*, D’M;6O4EU3Y74H HYE67O4UHO0O0OQUY/LR/YOZ7Z % D’M;IKK)& E46 URO UOYN74E0;YOZUY7QU7/4 XYEHNO4U0O4HUR
L/0WN/YLR7ZN%+;Mh-D& \OYOONL0/WO6 U/74VOZU7HEUOUROQREYEQUOY7ZU7QZ/X74UOZU74E0TEQUOY7EQ/NN347UWXY/NUROU\/
NE74 LOZUZ5(MOZ30UZ) % & D’M;IKK)ZR/\O6 UREUURO74UOZU74E0UYEQU/X5"2&,3$2&00EYVEORE6 J$%B3/203 ZL5!
D1,&*$/$//6+ZL5! D1,&*$B3/,&*ZL5! :20L$B06? ZL5E46 !+&6>$?$13+ZL5! \7UR LRW0/UWLOZ/XJ$%B3/203 TO74HURO
LYO6/N74E4UHY/3L! EQQ/34UO6 X/Y<$F /XURONOEZ3YO6 ZOj3O4QO# URO74UOZU74E0UYEQU/XU"C61/,0(&*3%0+0EYVEORE6
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UREU74 E0URO7Z/0EUO6 ZUYE74Z! 8"1!F /XUROZUYE74ZTO0/4HO6 U/DY/UO/TEQUOY7E! %"1!F U/h7YN7Q3UOZ! E46 %!F U/
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U/h7YN7Q3UOZ74 URO74UOZU74E0UYEQU/XU"C61/,0(&*3%0+0EYVEO5?&+;Mh-D6EUEZR/\O6 8# TL E46 %"" TL +;MhZ\OYOURO
LYO6/N74E4UHY/3LZ74 URO74UOZU74E0UYEQU/X5"2&,3$2&0E46 U"C61/,0(&*3%0+0EYVEO! YOZLOQU7VO0W5DY74Q7LE0Q/NL/4O4U
E4E0WZ7Z%D’,& E46 Q03ZUOYE4E0WZ7Z7467QEUO6 UREUUROYO\OYOU\/ZUY3QU3YOQEUOH/Y7OZX/YURO74UOZU74E0TEQUOY7E
B第 # 期 王娇莉等" 核桃举肢蛾和桃蛀螟幼虫肠道细菌多样性的 D’M;IKK)和 +;Mh-D分析
Q/NN347U7OZ74 5"2&,3$2&0E46 U"C61/,0(&*3%0+"<&d/UR IKK)E46 +;Mh-DE4E0WZOZZR/\O6 URO67VOYZ7UW67XOYO4QOZ/X
74UOZU74E0TEQUOY7EXY/N5"2&,3$2&00EYVEOE46 U"C61/,0(&*3%0+0EYVEO\OYO4/UZ7H47X7QE4U! E46 UROYO\EZE67XOYO4QO74
UROLY/L/YU7/4 /XTEQUOY7EQ/NL/Z7U7/45(’/4Q03Z7/4) +R7ZZU36WYOVOE0O6 UROQREYEQUOY7ZU7QZ/XURO74UOZU74E0N7QY/T7E0
Q/NL/Z7U7/4 74 U\/67XOYO4U74ZOQUZ! \R7QR LY/V76O6 EURO/YOU7QE0TEZ7ZX/YX3YUROYZU36W/4 UROYO0EU7/4ZR7L TOU\OO4 URO
67OUZE46 74UOZU74E0N7QY/TOZ/XUROU\/67XOYO4U67OU0EYVEOQ/4Z3N74H\E043U*ZHYOO4 R3Z[5
:$, ;)%-6"B5,*0A6’%31+2&,3$2&0# U0/2$/*$/0+C61/0(&*3%0+# 74UOZU74E0TEQUOY7E# D’M;IKK)# +;Mh-D
BB核桃%a6’%31+*&’03&为世界四大坚果之一!具有
较高的营养价值!在中国栽植历史悠久!是丘陵山区
农民致富的主要经济林树种%许新桥等!"$%?&$ 近
年来国家大力发展木本油料作物!核桃的种植地域
与面积快速增加%谭晓风等!"$%"&$ 随着核桃种植
面积的扩大及大面积集中连片种植方式的出现!核
桃病虫害危害问题也日益突出!每年病虫害造成的
核桃损失就高达 =$ 万 [H%赵凯旋等!"$%!&$ 早期
研 究 认 为 + 核 桃 黑 , 是 由 一 种 属 鳞 翅 目
%-OL76/LUOYE&举肢蛾科 %iO07/67476EO&的害虫核桃
举肢蛾 %5,*0A6’%31+2&,3$2&0&造成的$ 近期研究发
现!+核桃黑,不仅仅是由核桃举肢蛾危害造成!而
是由多种病虫害引起!其中核桃举肢蛾和属鳞翅目
% -OL76/LUOYE& 螟 蛾 科 % DWYE076EO& 的 桃 蛀 螟
%U0/2$/*$/0+C61/0(&*3%0+&是我国北方引起+核桃黑,
的 " 种主要害虫 %赵凯旋等! "$%!#田敏爵等!
"$%$&$ 核桃举肢蛾是一种主要危害核桃的寡食性
害虫!以幼虫蛀食核桃青皮乃至果仁!受害果逐渐变
黑而内陷’脱落!可造成核桃减产 <$F a!$F!危害
严重时可造成核桃绝收 %金骥等!%@!<#王祥明等!
"$%?&$ 桃蛀螟是一种多食性害虫!已知桃蛀螟的
寄主植物有 %$$ 余种!是一种食性极杂的害虫 %鹿
金秋等!"$%$&!关于桃蛀螟对核桃的危害!深山区
未见其危害!在浅山区及粮果混杂的平川区其危害
形成的黑果率较高$ 核桃举肢蛾和桃蛀螟幼虫单独
或混合串食核桃青皮或果仁!使核桃果实变黑’提早
落果!严重影响核桃的产量%李随院等!"$%$&$
昆虫肠道微生物与昆虫食性分化和寄主的选择
关系是近年来昆虫学研究的热点问题之一$ 植食性
昆虫对自然食物的营养成分平衡有特殊的适应性!
对寄主植物的消化率和转化率的决定因素在于植食
性昆虫有特殊的共生菌$ 尽管共生菌在植食性昆虫
对寄主植物专一性方面所起的作用仍然不明确!但
肠道微生物和植物表面微生物可提供对植物大分子
的消化和植物源毒素的解毒功能!共生菌在植食性
昆虫和寄主植物选择之间扮演着重要角色%I70/4 &,
3%"! "$$<# I/3H0EZ!"$$@&!通过对昆虫肠道微生物
的研 究! 可能找到 新的 害虫防治策 略 和 方 法
%dY/6OY7Q[ &,3%"! "$$<&$ 核桃举肢蛾和桃蛀螟幼虫
在食性上差异很大!但二者共同危害核桃青皮$ 为深
入了解 " 种食性迥异的蛀食性核桃害虫肠道微生物
区系及其与共生菌的相关性!笔者采用变性梯度凝胶
电 泳 %D’M;6O4EU3Y74HHYE67O4UHO0O0OQUY/LR/YOZ7Z!
D’M;IKK)&和末端限制性片段长度多样性%UOYN74E0
YOZUY7QU7/4 XYEHNO4U0O4HUR L/0WN/YLR7ZN! +;Mh-D&相
结合的技术!分析 " 种害虫幼虫肠道细菌的种类组
成和多样性!并初步探讨细菌在不同食性类型昆虫
对寄主植物选择中所扮演的角色$
%B材料与方法
<=<>核桃举肢蛾和桃蛀螟幼虫的采集
核桃举肢蛾和桃蛀螟幼虫于 "$%? 年 = 月中旬
采集于陕西省山阳县十里铺乡郭家村西北农林科技
大学山阳核桃实验示范站核桃园内 %%$@1==o)!
??1!?o*&!将幼虫蛀食的核桃青果带回实验室!剖
开虫果!用灭菌镊子夹出核桃青皮虫道内的核桃举
肢蛾和桃蛀螟幼虫!分别置灭菌离心管中备用$
<=?>基因组总 7D9提取
提取 I*,前!幼虫分别依次用灭菌三蒸水冲洗
虫体表面!8!F酒精表面消毒 ?$ Z!在 Dd& 缓冲液
%*E’0%?8 NN/0.->%! ’^0"18 NN/0.->%!*E"iDS<
%$ NN/0.->%! i^"DS< " NN/0.-
>%!Li81<&中浸泡
?$ Z!灭菌三蒸水冲洗 ? 遍!在体视显微镜下解剖出
中肠!置于 %1! N-灭菌离心管中备用$
解剖核桃举肢蛾幼虫和桃蛀螟幼虫各 "$ 头!每
%$ 头幼虫肠道混为 % 个样品!共获 " 个核桃举肢蛾
幼虫肠道样品和 " 个桃蛀螟幼虫肠道样品!分别标
号为 i%!i"!+%!+"!作为 IKK)试验样品$ 解剖核
桃举肢蛾幼虫和桃蛀螟幼虫各 ? 头!以 % 头幼虫肠
道为 % 个样品!得到 ? 个核桃举肢蛾幼虫肠道样品
和 ? 个桃蛀螟幼虫肠道样品!分别标号为 i$"!
i$解剖工作均在超净工作台上进行$
处理后的 " 种幼虫肠道使用 I*,提取试剂盒
%天根!北京&提取基因组总 I*,!提取步骤按试剂
盒操作说明书进行$ 核酸蛋白仪检测 I*,浓度并
88
林 业 科 学 !" 卷B
存储在 >"$ q备用$
<=@>肠道细菌群落多样性的 S1[L7KKE分析
%1?1%B%#& YM*,.? 区 D’M扩增B分别以混合样
品 +%!+"!i%!i" 提取的 I*,为细菌 %#& YM*,.?
区扩增模板!以细菌 %#& YM*,通用引物 "8h%!p;,K
,K+++K,+’’+KK’+’,K;?p&和 % <@"M%!p;+,’KK
++,’’++K++,’K,’++;?p&进行 %#& YM*,全长扩增
%C3W]OY&,3%"! %@@#&#以 %#& YM*,全长 D’M产物
为模板!以 !p端带 K’夹的上游引物 ?<%h;K’%!p;’
K’’’K’’K’K’K’KKK’KKKK’KKKKK’,’KKKK
KK’’+,’KKK,KK’,K’,K;?p&和下游引物 !?%!p;,++,’’K’KK’+K’+KK;?p&进行 %#& YM*,.?
区 D’M%C3W]OY&,3%"! %@@#&$ " 次 D’M扩增反应体
系%!$ !-&均包含 < !-6*+D%"1! NN/0.->% &!! !-
%$ nT3XOY!? !-CH’0"%"! NN/0.-
>% &!$1< !-+Ej+C
I*,聚合酶%! c.!->%&%+E^EME&!" !-模板 I*,!
?%1# !-灭菌 66i"S!引物%%$ !N/0.-
>% &各 " !-$
反应程序均为 @< q预变性 " N74#@< q变性 ?$ Z!!!
q退火 延伸 8 N74$ 得到的 D’M产物用 %1$F琼脂糖凝胶电
泳检测!并保存于 >"$ q用于 IKK)分析$
%1?1"BIKK)分析B使用 I’/6O+C通用突变检测系
统%d7/;ME6&进行$ 将每个样品的 <$ !-D’M产物
上样于浓度为 =F%J\[&的含有丙烯酰胺线性变性
梯度范围为 ?!F a#$F /%$$F的变性丙烯酰胺包
括 8 N/0.->% 尿素和 <$F甲酰胺 %C3W]OY&,3%"!
%@@?&0的聚丙烯酰胺%丙烯酰胺9甲叉丙烯酰胺质
量比 ?81!s%&凝胶中$ 电泳运行条件为最初 %"$ .!
%$ N74 之后 =$ .!%% R!#$ q!缓冲液为 % n+,)$
电泳结束后将凝胶在去离子水中洗脱!然后通过银
染使其显色并照相$
%1?1?BIKK)条带鉴定B 标记 IKK)图谱中清晰
的条带后将标记条带切下!分别保存于含有 !$ !-
灭菌三蒸水的 %1! N-灭菌离心管中$ < q浸泡过
夜后转移至 >"$ q保存$ 洗脱下的 I*,作为进一
步扩增的模板!扩增引物为 !p端不带 K’夹的上游
引物 ?<%h和下游引物 !?与上述相同$ D’M产物经 I*,纯化回收试剂盒
%天根!北京&纯化回收后与载体 LCI%@;+%+E^EME!
大连 & 连接! 转化到大肠杆菌 %D+/2&*0/203 /$%0&
Ii!%菌株%天根!北京&中!用菌落 D’M方法检测
阳性克隆!每个条带随机挑取 ? a! 个阳性克隆送测
序公司%上海生物工程公司&进行测序$
使用软件 ’RY/NEZDY/%1! 和 -EZOYHO4O8 对测
序结果进行扫描校对’拼接和去载体$ 将整理好的
序列在 *’d(数据库 % RUL"99\\\54QT7540N547R5
H/VDd-,&+&中进行比对!下载具有较高序列相似性
的序列!将得到的序列用 ’03ZUE0P"1% 进行比对
%-EY[74 &,3%"! "$$8&!使用 C)K,!1$! 采用最大似
然法构建系统发育树%+EN3YE&,3%"! "$%%&$ 并将整
理好的核桃举肢蛾和桃蛀螟幼虫肠道细菌序列提交
到 *’d(数据库!序列号为 % D^@@M^$%8=#!;^M$%8=8?&$
%1?1%d7/;ME6&进行 IKK)条带分析$ 首先尽量减少背景
的影响!其次进行条带检测和参数调整!然后使含有
最多条带的泳道进行自动匹配!公差设定在 他泳道手动匹配!最后输出全部泳道的峰值密度$ 为
了鉴定主要细菌类群并确定它们在核桃举肢蛾和桃
蛀螟幼虫肠道内变化情况!将 IKK)图谱中输出的数
据进行多样性指数计算!根据下面的公式计算香侬 >
维纳指数%Nb&’丰富度%.&和均匀度指数%Db&"
NbWZ’
.
0W%
%<0\<& 04%<0\<&!
DbWNb\04.!
式中!. 为 % 个泳道的条带数!<0为 % 个泳道内第 0
个条带的峰值密度!<为 % 个泳道内所有条带的总
峰值密度%KE0E46 &,3%"! "$$?&$
%1?1!B运算分类单元 "/LOYEU7/4E0UEJ/4/N7Q347U$
S+cZ#B将用于构建系统发育树的序列生成 h,&+,
文件!计算距离矩阵!然后用 CS+icM%.OYZ7/4
%1"@1$&软件运算其矩阵差异!通常小于 $1$? 的被
定义为同一个物种单元%&QR0/ZZ&,3%"! "$$!&$ 通过
CS+icM软件计算 ’RE/(多样性指数可以估量物
种丰富度的绝对值%’RE/&,3%"! "$$?&!而稀释度曲
线的方法用于展示样品间 S+c多样性差异%’/0\O0
&,3%"! "$$<#K/UO07&,3%"! "$$%&$ 采用数据分析制
图软件 &7HNED0/U%.OYZ7/4 %$1%&绘制稀释度曲线$
<=A>肠道细菌群落多样性 FL[0VS测定
%1<1%B%#& YM*,扩增B分别以样品 i$"!i$i$!!+$=!+$@!+%$ 提取的 I*,为模板!以 !p端 h,C
荧光标记的 %#& YM*,上游引物 =h%!p;#;h,C;,K,K
+++K,+’C+KK’+’,K;?p&及下游引物 % <@"M%!p;KK
++,’’++K++,’K,’++;?p&%+7LEW4/&,3%"! "$%"&进行
扩增$ 反应体系%!$ !-&包含 < !-6*+D%"1! NN/0.
->%&!! !-%$ nT3XOY!? !-CH’0" %"! NN/0.-
>% &!
$1< !-+Ej+CI*,聚合酶%! c.!0>%&%+E^EME&!" !-
模板 I*,!?%1# !-灭菌 66i"S!引物%%$ !N/0.-
>% &
各 " !-$ D’M扩增条件为"@< q预变性 " N74#@< q
变性 ?$ Z!!! q退火 =8
B第 # 期 王娇莉等" 核桃举肢蛾和桃蛀螟幼虫肠道细菌多样性的 D’M;IKK)和 +;Mh-D分析
环#最后 8" q延伸 8 N74$ D’M产物经 %F琼脂糖凝
胶电泳检测!I*,纯化回收试剂盒%天根!北京&纯化
回收备用!具体步骤按照说明书进行$
%1<1"B纯化产物的酶切及测序分析B纯化的 D’M
产物以 5%6#’5(3#’N23# %+E^EME!大连& ? 种限
制性内切酶分别进行酶切$ 限制性内切酶酶切反应
体系%%$ !-&根据各个酶的说明书进行!?8 q消化
< R$ 酶切产物经 %F琼脂糖凝胶电泳检测后送测序
公司%上海生物工程公司&进行测序分析$
%1<1?B多样性指数分析B根据 &+M分析得到的数
据!仅采用片段长度在 !$ a!$$ TL 内的 +;Mh数值计
算样品的香侬 >维纳指数%Nb&’丰富度%.&和均匀度
指数%Dp&%h7OYOY&,3%"! "$$?#+7LEW4/&,3%"! "$%"&"
NbWZ’
.
0W%
!04!0!
DbWN\04.$
式中!!0表示第0个+;MhZ的面积占总+;MhZ面积的
比例!. 为测得的 +;MhZ个数$
%1<1!$ TL 和大于 !$$ TL 的片段$ 对于细菌!由于相对
数量过小的限制性末端片段%+;MhZ&不会对群落的
特性产生明显的影响!故在本分析中舍去了相对数
量小于 %F的 +;MhZ!然后分别计算图谱中每一个峰
的峰面积与所有峰总面积的比值!将每个 +;Mh所
占的百分比作为权重导入 &D&&%#1$ 软件!聚类方法
选择组间平均距离法!距离选择平方欧氏距离做出
聚类分析图$ 利用 &D&&%#1$ 软件!进行主成分分
析!首先用 h,’+SM命令!用 D’%主成分法&提取因
子!得到因子载荷阵 5!然后根据关系!求出特征向
量!最后建立主成分模型%李雪琴等!"$%"&$
"B结果与分析
?=<>? 种昆虫肠道细菌群落多样性 S1[L7KKE
分析
"1%1%B细菌群落结构多样性分析B对 " 种食性不
同的核桃害虫肠道细菌 %#& YM*,.? 区进行 D’M
扩增!构建肠道菌群 IKK)图谱$ 图谱分析表明!"
种昆虫幼虫肠道间条带的数量’亮度和位置均存在
差异!IKK)图谱可以较好地反映 " 种昆虫幼虫肠
道菌群组成结构的异同%图 %&$ 图中共有 "" 个条
带%h%;h%$!D%;D%"&较为明显且可以鉴别!其中桃
蛀螟幼虫可鉴别条带为 %$ 条!核桃举肢蛾为 %" 条$
条带 D#!D= 在核桃举肢蛾样品%i%!i"&中占主导
地位!条带 h%!h?!h+"&中占主导地位$ 基于 " 种昆虫幼虫肠道菌群
IKK)示意图!利用 d(S;M,Il3E4U7UWS4O<1?1% 进
一步分析核桃举肢蛾和桃蛀螟幼虫肠道的相似性!
结果表明!" 种不同昆虫样品中 IKK)条带数量’密
度和细菌组成各不相同$
香侬 >维纳指数 %Nb&与细菌群落的多样性呈
正相关%i3 &,3%"! "$%?&!因此基于 IKK)条带信息
的峰值密度可计算细菌多样性指数!进而估算微生
物群落的多样性$ 通过对 " 种不同昆虫样品 IKK)
图谱中输出的数据计算多样性指数!结果表明!< 个
样品中 i% 的 Nb值%"1=8? b$1%$@&’Db值%$1@@< b
$1$?=&’ . 值 % %= & 最 高! +" 的 Nb值 % "1<#% b
$1$"@&’Db值%$1@@$ b$1$%"&和 . 值%%"&最低%表
%&$ 9检验表明!" 种昆虫幼虫间多样性差异不显
著%!e$1$!&!同种昆虫不同幼虫之间的差异也不
显著%!e$1$!&$
表 <>基于 7KKE图谱的 ? 种幼虫肠道共生细菌样品多样性指数!
F&2M<>7(4$%6(#, ("-$O )*("#$6#("&/2&’#$%(& (-$"#(*($-("6&JG/$6)*#;) /&%4&$2&6$-)"7KKEG%)*(/$6
物种 &LOQ7OZ 泳道 -E4O
丰富度
M7QR4OZZ% .&
均匀度指数
)VO44OZZ746OJ%Db&
香侬 >维纳指数
&RE44/4;G7O4OY746OJ%Nb&
桃蛀螟 +% %8 $1@@" b$1$$= "1=%$ b$1$"<
U"C61/,0(&*3%0+ +" %" $1@@$ b$1$%" "1<#% b$1$"@
核桃举肢蛾 i% %= $1@@< b$1$?= "1=8? b$1%$@
5"2&,3$2&0 i" %8 $1@@< b$1$$8 "1=%# b$1$"%
BB"表中数据为 ? 次重复平均值 b标准误 IEUEEYONOE4 b&)! 1 g?5
BB根据分析序列矩阵数据!核桃举肢蛾样品所有
<$ 个不同序列被划分为 8 个 S+cZ$1$?!桃蛀螟样品
所有 "8 个不同序列被划分为 < 个 S+cZ$1$? %图 "&$
表明核桃举肢蛾样品的细菌的多样性较丰富!该结
果与通过 IKK)条带峰值密度计算出的香侬 >维
纳指数%Nb&的结果一致$
"1%1"B系统发育分析和优势菌属B采用 D’M;
IKK)条带测序方法进行 " 种昆虫肠道细菌系统遗
传分析!" 种昆虫肠道样品 IKK)图谱共有 "" 个条
带克隆测序成功!在 KO4dE4[ 中与其最相似的序列
整合!以最大似然法构建核桃举肢蛾和桃蛀螟幼虫
肠道细菌菌群系统发育树%图 ?&$ 核桃举肢蛾幼虫
肠道中!8"1!F的菌株属变形菌门%DY/UO/TEQUOY7E&!
%"1!F的菌株属于厚壁菌门%h7YN7Q3UOZ&!%!1$F的
@8
林 业 科 学 !" 卷B
图 %B" 种幼虫肠道细菌 %#& YM*,基因片段
D’M扩增后 IKK)图谱
h7H5%BIKK)LY/X70OZ/XD’M;ENL07X7O6 %#& YM*,HO4O
XYEHNO4UZ/XTEQUOY7EXY/NUROH3UZ/XU\/0EYVEO
+%!+""桃蛀螟幼虫泳道 K3UZENL0OZXY/NU"C61/,0(&*3%0+0EYVEO#
i%!i"" 核桃举肢蛾幼虫泳道 K3UZENL0OZXY/N 5"2&,3$2&0
0EYVEO# D% >D%"! h% >h%$" 不同细菌的 %#& YM*,基因区域
%#& YM*,HO4OYOH7/4Z/X67XOYO4UTEQUOY7E5
图 "B" 种幼虫肠道细菌 %#& YM*,基因序
列的稀释度
h7H5"BMEYOXEQU7/4 Q3YVOZ/XTEQUOY7E0%#& YM*,
ZOj3O4QOZ74 UROH3U/XU\/0EYVEO
菌株属于拟杆菌菌门%dEQUOY/76OUOZ&$ 桃蛀螟幼虫
肠 道 中! ?81$F 的 菌 株 属 于 变 形 菌 门
%DY/UO/TEQUOY7E&! #?1$F 的 菌 株 属 于 厚 壁 菌 门
%h7YN7Q3UOZ&!未检测到拟杆菌门 %dEQUOY/76OUOZ&
细菌$
经测序后!核桃举肢蛾幼虫肠道 " 个样品中有
<$ 个克隆子测序成功!桃蛀螟幼虫肠道 " 个样品中
有 "8 个克隆子测序成功$ 根据 IKK)条带种属鉴
定结果计算 " 种昆虫样品细菌群落结构的单个菌属
组成分别占其总细菌群落组成的百分比%图 <&$
由图 < 可知!沃尔巴克氏体属%J$%B3/203&是核
桃举肢蛾幼虫肠道中的优势细菌!所占百分比为
<$1$F!肠球菌属%D1,&*$/$//6+&是桃蛀螟幼虫肠道
中的优势细菌!所占百分比为 #"1@F$ " 种昆虫幼
虫肠道细菌结构的主要差别在于其优势菌群不相
同!并且核桃举肢蛾幼虫肠道中含有肠杆菌属
%D1,&*$B3/,&*&的细菌!而在 D’M;IKK)方法检测中
桃蛀螟幼虫肠道中未检测到肠杆菌属的细菌及拟杆
菌门的不可培养细菌$
?=?>? 种昆虫肠道细菌群落多样性 FL[0VS分析
经多种限制性内切酶进行预试验后!其中 ? 种
限制性内切酶 5%6#’N23#’5(3#酶切获得较为理
想的结果$ 选择上述 ? 种酶进行酶切!" 种幼虫肠
道样品的 +;MhZ的数量分别如表 " 所示!5%6#酶产
生的+;MhZ数目大于 N23#和 5(3#酶产生的 +;MhZ
数!所以本试验中采用产生 +;MhZ数较多的 5%6#酶
的结果进行细菌的数据统计分析$
表 ?>经 <0&"%>6&"和 桃蛀螟样品的 FL[06数量!
F&2M?>D.J2$%)*FL[06-(5$6#$-2, >6&"&"-5.#66&JG/$-*%)J<36).&"6)$&"-;3’*%,.$0)1&/$(/&%4&$
样品 &ENL0O 5(3# N23# 5%6#
+$= ! @ =
+$@ ! %% !
+%$ ! ? %%
i$" %! ! %?
i$< < @ %$
i$! %? %! @
BB"样品 +$=!+$@!+%$ 为桃蛀螟幼虫肠道样品编号#样品 i$"!
i$EYOH3UZENL0OZXY/NU"C61/,0(&*3%0+0EYVEO#&ENL0O+$=! +$@! +%$ EYO
H3UZENL0OZXY/N5"2&,3$2&00EYVEO5下同 +ROZENOTO0/\5
"1"1%B多样性指数分析和优势菌群B表 ? 显示!
i$< 具有最高的 Np值和 Dp值$ +$@ 具有最低的 Nb
值!+$= 具有最低的 Db值$ 总之!核桃举肢蛾幼虫肠
道细菌菌群 Nb值’Db值和 . 值普遍高于桃蛀螟幼虫
肠道细菌菌群!与 D’M;IKK)结果一致$
表 @>根据 FL[0VS数据计算得到的 ? 种幼虫肠道
共生细菌样品多样性指数
F&2M@>7(4$%6(#, ("-$O )*("#$6#("&/6,J2()#(’2&’#$%(&
(-$"#(*($-("6&JG/$6)*#;) /&%4&$2&6$-)"FL[0VS-&#&
样品 &ENL0O . Db Nb
+$= = $1?<= b$1$"% $18"? b$1$+$@ ! $1<$" b$1$"! $1#<# b$1$<$
+%$ %% $1<$= b$1$"" $1@8= b$1$!<
i$" %" $1<#< b$1$"< %1%@$ b$1$!@
i$< %$ $1=?$ b$1$?8 %1@%% b$1$=<
i$! @ $1!$? b$1$<@ %1%$! b$1%$=
$=
B第 # 期 王娇莉等" 核桃举肢蛾和桃蛀螟幼虫肠道细菌多样性的 D’M;IKK)和 +;Mh-D分析
图 ?B基于 %#& YM*,基因的 " 种幼虫肠道细菌群落 CEJ7N3N;-7[O07R//6 系统进化树
h7H5?BCEJ7N3N;-7[O07R//6 LRW0/HO4OU7QUYOOZ/XUROTEQUOY7E0Q/NN347U7OZ74 UROH3U/XU\/0EYVEOTEZO6 /4 URO%#& YM*,HO4OXYEHNO4UZ
图 h7H5/XU\/0EYVEOH3U;EZZ/Q7EUO6 TEQUOY7E0Q/NN347UW
BB" 种昆虫肠道细菌种类平均相对丰度分析显
示!" 种幼虫肠道细菌群落结构差异较明显!但同一
昆虫不同个体肠道样品间具有相似的细菌群落结构
%图 !&$ 在桃蛀螟样品中!共有 %< 个 +;MhZ!所占比
例超过 %!1$F的 +;MhZ只有 8# TL!在核桃举肢蛾
样品中!共有 "< 个 +;MhZ!所占比例超过 %!1$F的
+;MhZ有 8"!%""!%"# TL$ 图 ! 表明 8# TL +;MhZ在
所有桃蛀螟样品细菌菌群结构中占 =%1$F!是桃蛀
螟幼虫肠道优势菌群#%"" TL +;MhZ在 i$" 个核桃举肢蛾样品细菌菌群结构中占 <<1$F!是
核桃举肢蛾幼虫肠道优势菌群$ 8" TL +;MhZ在
i$" 中所占比例为 8"1$F!为该肠道样品菌群中的
优势细菌!但在 i$品个体间差异产生$
"1"1"B聚类分析和主成分分析B把基于 +;Mh-D
微生物群落结构分析的样品谱图进行预处理后!采
用 &D&&%#1$ 进行分析!结果如图 # 所示$ 以相似性
%=
林 业 科 学 !" 卷B
图 !B用限制性内切酶 5%6#酶切后 " 种幼虫肠道细菌 %#& YM*,+;MhZ的相对丰度
h7H5!BMO0EU7VOET346E4QOZ/XTEQUOY7E0%#& YM*,+;MhZ67HOZUO6 3Z74HO46/43Q0OEZO5%6#74 H3UZENL0OZXY/NU\/0EYVEO
图 #B用限制性内切酶 5%6#酶切后 " 种
幼虫肠道细菌 +;Mh-D图谱的聚类分析
h7H5#B’03ZUE0E4E0WZ7Z/XURO+;Mh-DLY/X70OZXY/N
U\/0EYVEO\R7QR \OYO67HOZUO6 3Z74H5%6#O4]WNO
@$F为标准!# 个样品聚为 ? 类"类群 % 由 ? 个桃蛀
螟幼虫肠道细菌样品组成!类群 " 由 i$" 和 i$< 组
成!类群 ? 由 i$! 构成$ 从聚类的结果可知!幼虫
肠道细菌样品以昆虫的种类而进行分群并类!昆虫
种类对细菌群落结构影响较为明显!可能与不同昆
虫种类肠道特定共生菌结构组成有关!细菌群落变
异可能是环境条件变异的综合反应$ 聚类结果显示
桃蛀螟幼虫肠道细菌 ? 个样品归并为一类!与此相
比!核桃举肢蛾幼虫肠道菌群个体间差异明显$
D’,主成分分析结果与聚类分析相似!# 个样
品组成 ? 组$ 细菌群落筛选出的 ?$ 个 +;MhZ反应
的信息累计方差达到 @$F!表明原始数据矩阵可以
较好地反映基于片段的源解析$ " 种昆虫肠道细菌
D’%’D’" 得分如图 8 所示!样品被分成 ? 部分!基于
D’,的得分!+$=!+$@!+%$ 在第 % 象限!i$在第 " 象限!i$" 在第 < 象限$ +$@ D’% 得分最高
%$1@@? @8"&!i$! D’" 得分最高%$1@<# @!?&$
图 8B限制性内切酶 5%6#酶切后 " 种幼虫肠
道细菌 +;Mh-D图谱的主成分分析
h7H58BDY74Q7LE0Q/NL/4O4UZE4E0WZ7Z%D’,&/XURO+;Mh-D
LY/X70OZXY/NU\/0EYVEO67HOZUO6 3Z74H5%6#O4]WNO
?B讨论
昆虫与植物之间长期的协同进化使植食性昆虫
形成了许多适应对策!如选择性取食’消化系统特
化’食性专化’效率速率的进化等%但建国!%@@%&$
植食性昆虫的食性和营养在昆虫与植物间的关系中
处于最为重要的地位%钦俊德!%@#"&$ 昆虫肠道微
生物!包括寄生与共生关系都与昆虫的营养与代谢
等有着密切的联系!并且在漫长的进化过程中在宿
主体内形成特定的寄居区系!甚至在一定程度上昆
虫肠道微生物群落结构决定了其肠道的生态功能
%i//LOY&,3%"! "$$%#CQhE0;*HE7!%@@=&$
"=
B第 # 期 王娇莉等" 核桃举肢蛾和桃蛀螟幼虫肠道细菌多样性的 D’M;IKK)和 +;Mh-D分析
" 种昆虫肠道细菌的 D’M;IKK)和 +;Mh-D的
多样性分析结果基本保持一致$ 根据 D’M;IKK)
图谱的峰值密度计算可知!核桃举肢蛾肠道细菌群
落香侬 >维纳指数’均匀度指数和丰富度均高于桃
蛀螟!与 +;Mh-D的多样性分析结果相同$ 核桃举
肢蛾为寡食性昆虫!相对于多食性昆虫桃蛀螟!核桃
举肢蛾幼可以从其肠道细菌群落的多样性中获益$
研究表明某些肠道细菌通过合成昆虫天然食物中缺
乏而其生长发育又所必需的营养物质来帮助改善营
养质量!这些营养物质包括必需氨基酸’d族维生
素’氮源和甾醇类物质等 %dY76HOZ!%@=%#I/3H0EZ!
"$$@#K7TZ/4 &,3%"! "$%$#2E4Z/4 &,3%"! "$$=#C7E/&,
3%"! "$$?&$
基于 %#& YM*,.? 区基因序列的 D’M;IKK)
分析!" 种核桃害虫分别获得 %" 个和 %$ 个可测条
带!并经克隆测序后!" 种昆虫体内的细菌菌群包含
变形菌门 < 个属的微生物!分别是沃尔巴克氏体属’
肠杆菌属’根瘤菌属和假单胞菌属!厚壁菌门的肠球
菌属!以及拟杆菌门的不可培养细菌$ " 种昆虫幼
虫肠道细菌菌群存在差异!桃蛀螟幼虫肠道没有肠
杆菌属细菌及拟杆菌门不可培养细菌!且 " 种昆虫
幼虫肠道细菌优势菌群明显不同$ 核桃举肢蛾幼虫
肠道 " 个样品中共获得 <$ 个克隆子!其中沃尔巴克
氏体属的克隆子有 %# 个!占总数的 <$1$F#桃蛀螟
幼虫肠道 " 个样品中共获得 "8 个克隆子!属于肠球
菌属的克隆子有 %8 个!占总数的 #"1@F$ 推测这 "
种细菌分别是 " 种昆虫的主要优势菌群$
鳞翅目昆虫是昆虫中一个较大的类群!但对于
其肠道细菌的研究较少%dY/6OY7Q[ &,3%"! "$$<&!其
中研究最多的是家蚕%@$?B-4?$*0&!多数研究都表
明家蚕肠道主要菌群有肠球菌属’葡萄球菌属
%.,3C2-%$/$//6+&’肠杆菌属和芽孢杆菌属%@3/0%6+&
%相辉等!"$$8&$ 在这些主要菌群中!研究最多的
是肠球菌属%dY/6OY7Q[ &,3%"! "$$<#相辉等!"$$8&!
该菌在鳞翅目昆虫肠道中普遍存在!经常存在于高
Li%= a@&的环境中!它可以通过代谢使周围环境
Li降低%CE4OY/&,3%"! %@@@&$ 对蝗虫肠道中的肠
球菌研究时发现!该属很多种类能够产生乙酸盐!并
推测大量乙酸盐的积累是蝗虫肠道 Li低的主要原
因%COE6 &,3%"! %@==&$ 该菌可能对寄主昆虫有利!
比如一些鳞翅目的微生物毒素!如苏云金芽孢杆菌
%@3/0%6+,26*01’0&1+0+&在碱性环境下有活性!最适
Li为 81!!肠球菌可能通过降低肠道 Li值来保护
昆虫免受 dU毒素的侵染%dY/6OY7Q[ &,3%"! "$$<&$
本试验中所鉴定出的细菌在已有研究的鳞翅目
昆虫肠道中都有发现!初步判断它们都是 " 种幼虫
肠道的常驻细菌$ 笔者参照其他昆虫的研究结果对
本试验中鉴定出的肠道细菌的功能加以探讨$
沃尔巴克氏体属在 " 种昆虫体内稳定存在$
iOYU74H等%%@"<&在尖音库蚊%#6%&4C0*0&1+&的生殖
组织里首次发现了该共生菌!该菌可以通过诱导胞
质不 亲 和 %K7Y74 &,3%"! %@@! &’ 诱 导 孤 雌 生 殖
%&U/3URENOY&,3%"! %@@$ &’诱导雌性化 %M/3ZZOU&,
3%"! %@@"&和杀雄%i3YZU&,3%"! %@@#&等来对宿主的
生殖进行调控$ 本研究中!沃尔巴克氏体属细菌可
能是对宿主起促进作用!有研究表明该属细菌对宿
主适合度的促进作用主要表现在增强宿主的生殖
力!包括雌性的繁殖力和雄性的生育力%杨克冬等!
"$$=&$ 肠杆菌属细菌只存在于核桃举肢蛾幼虫肠
道中$ 肠杆菌是一个大家族!包括许多与动物和植
物相关的细菌!其成员广泛存在于动物包括人类和
昆虫肠道细菌群落中!它能够在维生素的生物合成’
信息素的产生和植物化合物的降解中起到促进作用
%dYO]4E[!%@="#P3 &,3%"! "$$?&$ 白蚁肠道中肠杆
菌属的细菌很常见!寄主昆虫的营养物质可由肠杆
菌属细菌固定大气中的氮而获得 %)3U7Q[ &,3%"!
%@8=&!肠杆菌在寄主昆虫的固氮方面起到重要作
用#而肠杆菌属细菌在核桃举肢蛾幼虫肠道中的作
用还不清楚!有待进一步研究$ 假单胞菌属是微生
物的重要类群!是一类化能异养的兼性厌氧菌!在自
然界分布广泛!在水体’土壤’植物组织和动物体内
都有发现$ 假单胞菌属细菌包含许多致病菌!这些
致病菌可以侵染人体’植物和动物等%A/34H! %@8$#
/^6ENE&,3%"! %@=!#dY/6OW&,3%"! %@@%&!同时也有
研究发现一些假单胞菌属细菌具有纤维素降解活性
% /^6ENE&,3%"! %@=!#COWOYZ&,3%"! %@=<#C70\EY6;
&E60OY&,3%"! %@@!#&746R3 &,3%"! "$$%&!并且它可以
通过糖酵解和戊糖磷酸化途径降解碳水化合物
%DYOZQ/U&,3%"! "$$"&!所以假单胞菌可能参与了为
寄主提供能量的过程$
尽管 " 种昆虫肠道细菌群落成分相对简单!但
阐明各种细菌在 " 种昆虫幼虫生物学和维护肠道内
物种组成中的作用及与食性的关系仍然是个难题$
本研究利用 D’M;IKK)和 +;Mh-D的技术初步分析
了共同危害核桃青果皮的不同食性昆虫核桃举肢蛾
和桃蛀螟幼虫肠道内细菌群落结构及多样性!在此
基础上进一步探讨了核桃举肢蛾幼虫与桃蛀螟幼虫
肠道优势菌及其动态变化!为深入了解昆虫的选择
?=
林 业 科 学 !" 卷B
性取食’寄主 >寄生’共生微生物之间复杂的关系提
供了重要信息$
参 考 文 献
但建国5%@@%5昆虫生态学的新分支---昆虫营养生态学5青年生
态学者论丛! "@# >"@#5
%IE4 2K5%@@%5,TY7OX74UY/63QU7/4 U/E4O\TYE4QR /X74ZOQUOQ/0/HW;
74ZOQU43UY7U7/4E0OQ/0/HW5+YE4ZEQU7/4Z/XURO)Q/0/HW&/Q7OUW/X
’R74OZOA/3UR! "@# >"@#5/74 ’R74OZO0 &
金B骥! 卢友三5%@!<5核桃黑%虫害&初步观察及防治研讨5农业
科学通讯! %=& " <<$ ><<%5
%274 2! -3 A&5%@!<5+ROLYO07N74EYW/TZOYVEU7/4 E46 Q/4UY/067ZQ3ZZ/X
5,*0A6’%31+ 2&,3$2&0" d30OU74 /X ,HY7Q30U3YE0 &Q7O4QO E46
+OQR4/0/HW! %=& " <$$ ><<%5/74 ’R74OZO0 &
李随院! 冯纪年! 李新昌! 等5"$%$5山阳县+核桃黑,成因初步调
查及防治5陕西农业科学! %?& " %%" >%%?5
%-7& A! hO4H2*! -7P’! &,3%""$%$5,LYO07N74EYW74VOZU7HEU7/4 E46
LYOVO4U7/4 /X,HY7Q30U3YE0&Q7O4QOZ! %?& " %%" >%%?5/74 ’R74OZO0 &
李雪琴! 张芳芳! 党献民! 等5"$%"5&D,&& 主成分分析法在速冻水
饺皮质构品质评价中的应用5粮食工程技术! %?#& " #8 >#@5
%-7P l! kRE4Hhh! IE4HP C! &,3%""$%"5&D,&& LY74Q7LE0
Q/NL/4O4UE4E0WZ7Z%D’,& ELL07O6 74 UROOVE03EU7/4 /Xj3E07UW/X
URO XY/]O4 63NL074HZ Q/YU7QE0 ZUY3QU3YO5 h//6 )4H74OOY74H
+OQR47j3O! %?#& " #8 >#@5/74 ’R74OZO0 &
鹿金秋! 王振营! 何康来! 等5"$%$5桃蛀螟研究的历史’现状与展
望5植物保护学报! ?#%"& " ?% >?=5
%-3 2l! GE4HkA! iO^ -! &,3%5"$%$5MOZOEYQR R7ZU/YW! LY/HYOZZOZ
E46 LY/ZLOQUZ74 UROWO0/\ LOEQR N/UR! U0/2$/*$/0+C61/,0(&*3%0+
K3O4OO52/3Y4E0/XD0E4UDY/UOQU7/4! ?# % " & " ?% >?=5 / 74
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谭晓风! 马履一! 李芳东! 等5"$%"5我国木本粮油产业发展战略研
究5经济林研究! ?$%%& " % >!5
%+E4 Ph! CE-A! -7hI! &,3%""$%"5(463ZUY7E07]EU7/4 6OVO0/LNO4U
ZUYEUOHW/X\//6WHYE74 E46 /7074 ’R74E5*/4\//6 h/YOZUMOZOEYQR!
?$%%& " % >!5/74 ’R74OZO0 &
田敏爵! 刘凤利! 董军强5"$%$5商洛地区核桃举肢蛾的生活史及
防治5西北林学院学报! "!%"& " %"8 >%"@5
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5,*0A6’%31+2&,3$2&0E46 7UZQ/NLYORO4Z7VOQ/4UY/0UOQR47j3OZ5
2/3Y4E0/X*/YUR\OZUh/YOZUYWc47VOYZ7UW! "! %"& " %"8 >%"@5/74
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)4U/N/0/H7QE&747QE! %"& " %#@ >%=!5/74 ’R74OZO0 &
王祥明5"$%?5商洛市核桃举肢蛾发生规律与防治5北方果树!
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2&,3$2&0AE4H74 &RE4H-3/5*/YUROY4 hY37UZ! %%& " "" >"?5/74
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相B辉! 李木旺! 赵B勇5"$$85家蚕幼虫中肠细菌群落多样性的
D’M;IKK)和 %#& YI*,文库序列分析5昆虫学报! !$ % ? & "
""" >""?5
%P7E4Hi! -7CG! kRE/A5"$$85dEQUOY7E0Q/NN347UW74 N76H3UZ/X
UROZ70[\/YN0EYVEOOZU7NEUO6 TWD’M;IKK)E46 %#& YI*,HO4O
07TYEYWE4E0WZ7Z5,QUE)4U/N/0/H7QE&747QE! !$ % ? & " """ >"??5
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许新桥! 孟丙南5"$%?5我国核桃产业潜力及发展对策研究5林业
经济! %"& " ?< >?=5
%P3 Pl! CO4Hd*5"$%?5MOZOEYQR /4 \E043U7463ZUYW6OVO0/LNO4U/X
R3HOL/UO4U7E0E46 Q/34UOYNOEZ3YO74 ’R74E5h/YOZUYW)Q/4/N7QZ!
%"& " ?< >?=5/74 ’R74OZO0 &
杨克冬! 张海燕! 钱海涛! 等5"$$=5沃尔巴克氏体感染对松毛虫赤
眼蜂生殖力’发育历期和存活的影响5中国生物防治! "< %?& "
"%$ >"%<5
%AE4H^I! kRE4HiA! l7E4 i+! &,3%5"$$=5)XOQU/XJ$%B3/203
74XOQU7/4 /4 XOQ3467UW! 6OVO0/LNO4UE063YEU7/4 E46 Z3YV7VE0/X
9*0/2$’*3??3 >&1>*$%0?0"’R74OZO2/3Y4E0/Xd7/0/H7QE0’/4UY/0! "<
%?& " "%$ >"%<5/74 ’R74OZO0 &
赵凯旋! 张文超! 冯纪年5"$%!5不同立地条件下+核桃黑,的发生
情况调查5中国农学通报! ?%%%$& " %@< >%@85
%kRE/^P! kRE4HG ’! hO4H2*5"$%!5+RO74VOZU7HEU7/4 /XGE043U* 74 URO 67XOYO4UZ7UOQ/467U7/4Z5 ’R74OZO,HY7Q30U3YE0
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07L/6OLZ7LOLU76OU/J745C/0OQ30EYD0E4U;C7QY/TO(4UOYEQU7/4Z! %<& "
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TEQUOY7E0Q/NN347UW/XUROHWLZWN/UR 0EYVE0N76H3UTW3Z74H
Q30U3Y74H E46 Q30U3YO;746OLO46O4U NOUR/6Z5 ,LL07O6 E46
)4V7Y/4NO4UE0C7QY/T7/0/HW! 8$%%& " "@? >?$$%5
’RE/,! &RO4 +25"$$?5*/4LEYENOUY7QOZU7NEU7/4 /X&RE44/4*Z746OJ
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