PSAF是绿色植物光系统Ⅰ反应中心F亚基,在光合作用电子迁移过程中起着重要作用。以青杄cDNA文库为模板,根据PwPSAF的EST序列设计引物,进行5‘-RACE和3‘-RACE试验,以获得青杄PwPSAF的末端序列,经过与EST序列进行拼接获取青杄PwPSAF的全长cDNA序列。基于其氨基酸序列,利用Expasy tools、DNAMAN、ClustalX和MEGA等工具,进行理化性质、二级结构和三级结构的生物信息学分析。结果表明: PwPSAF是一个由253 aa组成的蛋白质,理论分子量为27.04 kDa,等电点为9.57,预测蛋白有2个跨膜区域,蛋白质的C端具有保守的结构。RT-qPCR试验显示PwPSAF主要在青杄的针叶中表达。在种子萌发过程中吸胀期(0~2天)表达量最高,在4天时表达量降低,随着子叶的不断长出,其表达量又逐渐增高。在干旱和盐胁迫下,针叶中的PwPSAF的表达量被大幅下调。研究结果显示PwPSAF在青杄种子萌发及非生物逆境胁迫下的光合过程中起着重要作用。
PSAF is F subunit of photosystem Ⅰ reaction center complex in higher plants and plays an important role during the process of electron mobility of photosynthesis. The full length cDNA of PwPSAF was obtained by RACE PCR assays based on the cDNA library of Picea wilsonii and EST fragment of PwPSAF. Several pieces of software and tools such as Expasy, DNAMAN, ClustalX and MEGA were used to analyze the physical and chemical properties and secondary and tertiary structures of PwPSAF. Expression level of PwPSAF in different tissues of seedlings was identified by RT-qPCR under drought and salt treatments. Furthermore, the expression patterns were investigated at different stages of seed germination. We found that PwPSAF was composed of 253 amino acids and the theoretical molecular weight was 27.04 kDa with isoelectric point of 9.57. The protein has two transmembrane domains and shares conserved C domain with other species such as Picea sitchensis and Vitis vinifera. RT-qPCR assays indicated that PwPSAF was mainly expressed in needles of Picea wilsonii. During seed germination, PwPSAF showed the highest expression within 2 days after germination, and then declined on the fourth day. With the cotyledons grown, the expression of PwPSAF was up-regulated again. In addition, the expression level of PwPSAF was down-regulated in the needles under drought and salt stresses. These results suggest that PwPSAF in P. wilsonii plays an important role during seed germination and in response to abiotic stresses.
全 文 :第 49 卷 第 10 期
2 0 1 3 年 10 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 49,No. 10
Oct.,2 0 1 3
doi: 10.11707 / j.1001-7488.20131007
收稿日期: 2013 - 02 - 01; 修回日期: 2013 - 08 - 04。
基金项目: 国家自然科学基金项目(31270663) ; 国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2011ZX08009-003-002)。
* 张凌云为通讯作者。
青杄 PwPSAF基因的克隆与组织表达分析*
李长江 孙 帆 张 通 张凌云
(北京林业大学林学院 森林培育与保护教育部重点实验室 北京 100083)
摘 要: PSAF 是绿色植物光系统Ⅰ反应中心 F 亚基,在光合作用电子迁移过程中起着重要作用。以青杄 cDNA
文库为模板,根据 PwPSAF 的 EST 序列设计引物,进行 5-RACE 和 3-RACE 试验,以获得青杄 PwPSAF 的末端序
列,经过与 EST 序列进行拼接获取青杄 PwPSAF 的全长 cDNA 序列。基于其氨基酸序列,利用 Expasy tools、
DNAMAN、ClustalX 和 MEGA 等工具,进行理化性质、二级结构和三级结构的生物信息学分析。结果表明: PwPSAF
是一个由 253 aa 组成的蛋白质,理论分子量为 27. 04 kDa,等电点为 9. 57,预测蛋白有 2 个跨膜区域,蛋白质的 C 端
具有保守的结构。RT-qPCR 试验显示 PwPSAF 主要在青杄的针叶中表达。在种子萌发过程中吸胀期(0 ~ 2 天)表
达量最高,在 4 天时表达量降低,随着子叶的不断长出,其表达量又逐渐增高。在干旱和盐胁迫下,针叶中的
PwPSAF 的表达量被大幅下调。研究结果显示 PwPSAF 在青杄种子萌发及非生物逆境胁迫下的光合过程中起着重
要作用。
关键词: 青杄; PSAF; 生物信息学分析; 组织表达; 胁迫响应
中图分类号: S718. 46 文献标识码: A 文章编号: 1001 - 7488(2013)10 - 0040 - 08
Cloning and Tissue Expression Analysis of PwPSAF in Picea wilsonii
Li Changjiang Sun Fan Zhang Tong Zhang Lingyun
(Key Laboratory of Forest Silviculture and Conservation of Ministry of Education College of Forestry,Beijing Forestry University Beijing 100083)
Abstract: PSAF is F subunit of photosystem Ⅰ reaction center complex in higher plants and plays an important role
during the process of electron mobility of photosynthesis. The full length cDNA of PwPSAF was obtained by RACE PCR
assays based on the cDNA library of Picea wilsonii and EST fragment of PwPSAF. Several pieces of software and tools such
as Expasy,DNAMAN,ClustalX and MEGA were used to analyze the physical and chemical properties and secondary and
tertiary structures of PwPSAF. Expression level of PwPSAF in different tissues of seedlings was identified by RT-qPCR
under drought and salt treatments. Furthermore,the expression patterns were investigated at different stages of seed
germination. We found that PwPSAF was composed of 253 amino acids and the theoretical molecular weight was 27. 04
kDa with isoelectric point of 9. 57. The protein has two transmembrane domains and shares conserved C domain with other
species such as Picea sitchensis and Vitis vinifera. RT-qPCR assays indicated that PwPSAF was mainly expressed in
needles of Picea wilsonii. During seed germination, PwPSAF showed the highest expression within 2 days after
germination,and then declined on the fourth day. With the cotyledons grown,the expression of PwPSAF was up-regulated
again. In addition,the expression level of PwPSAF was down-regulated in the needles under drought and salt stresses.
These results suggest that PwPSAF in P. wilsonii plays an important role during seed germination and in response to
abiotic stresses.
Key words: Picea wilsonii; PSAF; bioinformatic analysis; tissue-specific expression; stress response
PSAF( photosystem I reaction center F),又称光
系统Ⅰ亚基Ⅲ( subunit Ⅲ of photosystem Ⅰ),是绿
色植物光系统Ⅰ(PSⅠ)反应中心蛋白 F 亚基,为 PS
Ⅰ复合体的重要组成部分 ( Farkas et al.,2011a)。
PSAF 蛋白由核基因编码,在受到光信号或细胞分裂
素的诱导后表达,同时也受到 Ca2 +、细胞质激酶与
磷酸酶的诱导(Chandok et al.,2001; Wstemeyer et
al.,2003)。大量研究表明,PSAF 在藻类光合作用
中,特别在 PSⅠ的电子传递过程中起到重要作用。
Chitnis 等 ( 1991 ) 首 先 在 蓝 藻 ( Cyanobacterium
第 10 期 李长江等: 青杄 PwPSAF 基因的克隆与组织表达分析
synechocystis)中鉴定了 PSAF 基因。之后,在莱茵衣
藻(Chlamydomonas reinhardtii)的研究中发现,PSAF
蛋白介导质体蓝素、细胞色素 c6 与 PS Ⅰ反应中心
结合(Farah et al.,1995),且发现特异互作位点为
PSAF 的 Lys27 与细胞色素 c6 的 Glu69 残基、PSAF
的 Lys23 残基与细胞色素 c6 的 Glu69 /Glu70 残基
(Sommer et al.,2006)。进一步研究发现,STT7 基因
的失活将能保护莱茵衣藻 PSAF 突变体免受高光下
的氧化胁迫作用(Berry et al.,2011),而 PSAJ 能稳
定 PSAF 的结构与功能,当 psaj 缺失突变后,质体蓝
素与细胞色素 c6 向反应中心 P700 的电子转移水平
将显 著 下 降 ( Fischer et al.,1999 )。在 聚 球 藻
(Synechococcus elongatus) 与莱茵衣藻中,也证明了
PSAF 蛋白介导细胞色素 c6 与质体蓝素中的电子向
PSⅠ反应中心的传递(Hippler et al.,1999),而且在
这个过程中 PSAF 的 N 端起到重要作用(Hippler et
al.,1998)。在聚球藻中发现,当 psaf 突变后,电子
转移线路会发生改变(Van Der Est et al.,2004),而
PSAB 的分支电子转移将会增加 ( Agalarov et al.,
2008)。
在高等植物中,对于 PSAF 功能的研究并不多
见。Flieger 等(1993)在菠菜 ( Spinacia oleracea)中
发现位于启动子区 - 220 bp 与 - 179 bp 之间的一
个 42 bp 区域对于 PSAF 基因的表达有重要的调控
作用。进一步研究表明 PSAF 与质体蓝素相互作
用,并形成了对传递电子有重要作用的二硫桥
( Farkas et al.,2011a),通过核磁共振技术证明,
Mg2 +和 Mn2 +与菠菜的质体蓝素结合,进而调节其
与 PSAF 的 结 合 ( Farkas et al.,2011b )。同 时,
PSAF 蛋白 8 与 63 位的半胱氨酸受到硫氧还蛋白
的还原作用,而蛋白的活化则需要受到质体蓝素
的氧化作用( Farkas et al.,2011c)。相对于在藻类
中 PSAF 功能的研究,植物中该蛋白功能还知之
甚少。
青杄(Picea wilsonii)属于松科( Pinaceae)云杉
属(Picea)植物,是多年生木本针叶树种,对干旱、阴
冷等环境有较强的适应能力,为我国重要的园林绿
化树种。本研究基于青杄 cDNA 文库与 PwPSAF 的
EST 序列,利用 RACE PCR 获取 PwPSAF 的全长
cDNA 序列。通过生物信息学工具预测 PwPSAF 的
分子组成、理化性质、二级结构、三级结构等; 同时,
利用 RT-qPCR 技术检测其在青杄各组织的特异表
达、种子萌发过程的表达水平,以及干旱、盐胁迫处
理下 PwPSAF 在各组织的表达水平。本研究将为林
木中 PSAF 的功能研究奠定基础,以进一步研究其
在林木发育及抗逆过程中的功能,也可为林木遗传
育种、优质林木基因的筛选等提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 植物材料 青杄花粉和种子采集于中国科
学院植物所植物园; 青杄混合组织 cDNA 文库由
Invitrogen(英潍捷基)公司利用 Gateway 技术构建。
3 年生青杄幼苗的根、茎与针叶用于组织特异表达
试验,采集后置于 - 80 ℃备用。
1. 1. 2 试验试剂 pDONR222 为文库载体,由
Invitrogen 公司提供,pEASY-T1 载体购于全式金公
司,PCR Taq PCR mix、DNA marker(DL2000)、大肠
杆菌(Escherichia coli)感受态 DH5α 等购于天根公
司,反转录试剂盒 ( RevertAidTM First Strand cDNA
Synthesis Kit)购于 Fermentas 公司。荧光定量 PCR
试剂盒( SYBR FAST qPCR Kit)购于美国 KAPA 公
司。RNA 提取试剂盒购于 AidLab 公司。其他试剂
均购买于 AMRESCO 公司。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 青杄 PSAF 的克隆 以青杄 cDNA 文库为
模板,根据 PwPSAF 的 EST 序列与 pDONR222 载体
的序列设计引物,进行 RACE PCR 试验。5-RACE
PCR 引物为 5-race-f 与 5-race-r,3-RACE PCR 引物
为 3-race-f 与 3-race-r。经过回收、测序后 获得
PwPSAF 的末端序列,与 EST 序列拼接后获得
PwPSAF 的全长 cDNA 序列。设计引物 psaf-forward
与 psaf-reverse,经过 PCR 后得到开放阅读框完整的
核酸序列,连接到 pEASY-T1 上,获得 PwPSAF 单克
隆。所用到的引物见表 1。
表 1 青杄 PSAF 克隆及组织表达分析所需要的引物
Tab. 1 Primers used in cloning and tissue
expression analysis of PwPSAF
引物名称
Primer name
核酸序列
Nucleotide sequences(5—3)
5-race-f CAGTCTTAAGCTCGGGCCCCA
5-race-r GCCTTCGAGTCCTTGCACGGCG
3-race-f CGGTTCGACAACTACGGGAAGG
3-race-r CTGCCAGGAAACAGCTATGAC
psaf-forward CACTGGCAGCAATGGCGATGAC
psaf-reverse GCAATCTACCGGGGAGAAACAG
psaf-rt-a GGCAGGAGTATCGACTTACGTT
psaf-rt-b GTTCTTCTCCTCTTTTCCTCCT
EF1-α-F ATGGCAGCAAAGGCAATGATCT
EF1-α-R TTATATGGCACCAATGGCCTTG
1. 2. 2 生物信息学分析 运用 DNAMAN 软件进行
核酸序列拼接及翻译,运用 ProtParam 工具分析蛋白
14
林 业 科 学 49 卷
的氨基酸组成及理化特性( http: / /web. expasy. org /
protparam /)。利用 TMHMM 工具进行蛋白跨膜预
测 ( http: / /www. cbs. dtu. dk / services /TMHMM-
2. 0 /); 利用 ProtScale 工具进行蛋白疏水性分析
( http: / /web. expasy. org / cgi-bin / protscale / protscale.
pl); 运用 GOR4 工具进行蛋白的二级结构分析
(http: / / gor. bb. iastate. edu /); 运用 SWISS-MODEL
工具进行蛋白的三级结构分析( http: / / swissmodel.
expasy. org /)。多序列比对由 ClustalX 工具完成,系
统发育树由 MEGA5 构建完成,构建系统树计算方
法为邻位相连法。
1. 2. 3 组织特异表达试验 用于试验的 3 年生青
杄的根、茎、针叶、种子及花粉等总 RNA 的提取利用
AidLab 公司的植物 RNA 提取试剂盒。琼脂糖凝胶
电泳的结果中 28 S 与 18 S 比较明显即可进行
cDNA 第 1 条链的合成,运用 Fermentas 公司的反转
录试剂盒进行。均一化浓度之后在 StepOnePlus
Real Time RT-PCR 仪器上进行荧光定量 PCR 来检
测基因在不同组织的相对表达量,所用特异引物为
psaf-rt-a 与 psaf-rt-b,内参基因为青杄延伸因子蛋白
EF1-α(Yu et al.,2011),引物为 EF1-α-F 与 EF1-α-
R(表 1),试验设置 3 次重复。
1. 2. 4 种子萌发试验 种子萌发试验采用水培法。
将吸水滤纸铺在培养皿中,青杄种子分散放入湿润
的滤纸上培养,试验过程中保持培养皿底部水分充
足。将培养皿置于 25 ℃光照培养箱中,光周期为
16 h 光照 /8 h 黑暗,培养 10 天,分别在培养 0,2,4,
6,8,10 天时采样,并置于 - 80 ℃保存备用。提取各
时期萌发幼体总 RNA 后,经反转录、RT-qPCR 等试
验检测各个时期 PSAF 的表达量,各个时期取样及
RT-PCR 试验均设置 3 次重复。
1. 2. 5 干旱与盐胁迫试验 干旱胁迫处理参考喻
方圆(2002)方法,盐胁迫试验参考朱振贤(2007)研
究方法,分别有改动。具体如下: 将 3 年生青杄幼
苗栽植于营养土与蛭石(体积比 1∶ 1)混合的培养基
质中,置于温室中,温度为 25 ℃,空气湿度为 60%,
光周期为 16 h 光照 /8 h 黑暗。干旱试验中,对试验
组青杄进行控水处理 4 周(不浇水),对照组每周浇
灌 500 mL 清水。盐胁迫试验中,试验组每周分别浇
灌 500 mL 2%,4%,6%的 NaCl 溶液,并每天喷施 5
mL 对应浓度的 NaCl 溶液于青杄幼苗针叶做加强处
理,处理 4 周,对照组每周浇 500 mL 清水。干旱与
盐胁迫试验中每个处理均设置 3 个重复,取样后放
入 - 80 ℃备用。提取青杄幼苗各组织(根、茎与针
叶)总 RNA 后进行反转录、RT-qPCR 等试验检测各
组织 PwPSAF 的表达量变化,取样及 RT-PCR 试验
均设置 3 次重复。
2 结果与分析
2. 1 青杄 PSAF 的克隆
经过 RACE PCR 成功获得 PwPSAF 的末端序
列,与 EST 序列拼接后 获得 全长 cDNA 序列。
PwPSAF 全长 cDNA 序列由1 139 bp组成,5-UTR 为
41 bp,在 42 bp 处发现起始密码子 ATG,在 801 bp
处发现终止密码子 TAG,编码区共 759 bp,编码 253
个氨 基 酸。 3-UTR 共 321 bp,并 在 末 端 发 现
Poly(A) 15尾巴(图 1)。
2. 2 生物信息学分析
2. 2. 1 氨 基 酸 组 成 及 理 化 性 质 分 析 根 据
ProtParam 工具预测 PSAF 的分子量为 27. 04 kDa,理
论等电点为 9. 57。丙氨酸(Ala)为 12. 3%,赖氨酸
(Lys)、丝氨酸 ( Ser ) 与亮氨酸 ( Leu ) 含量均为
9. 5%,甘氨酸(Gly)为 7. 1%,分子式 C1210 H1953 N331
O351 S9,预测半衰期约为 30 h,不稳定指数为 50. 47,
说明蛋白质不稳定。利用 Protscale 工具预测蛋白质
疏水性,结果如图 2A,蛋白质第 75 位亮氨酸( Leu)
分值为 2. 244,疏水性最大,第 58 位天冬酰胺(Asn)
分值最小,为 - 3. 722。TMHMM 工具预测蛋白有 2
个跨膜区域,分别位于 64—86 aa 与 176—198 aa(图
2B)。
利用 FoldIndex 工具进行蛋白质固有无序化分
析,结果表明蛋白质在 N 端及 115—135 aa 之间存
在无序化特征,预测此蛋白质具有很强的动态结构,
在行使其功能时蛋白质的结构容易发生改变 (图
2C)。
2. 2. 2 多序列比对及进化树分析 通过 NCBI 上
的 Blastp 工具可以检测到 PwPSAF 在其他物种中的
同源蛋白质,如北美云杉 ( Picea sitchensis)、毛果杨
(Populus trichocarpa)、葡萄 ( Vitis vinifera)、马铃薯
(Solanum tuberosum)、拟南芥 ( Arabidopsis thaliana)
等 PSAF 蛋白质(表 2)。运用 Clustalx 工具进行多
序列比对(图 3),结果发现不同植物的 PSAF 拥有
保守的 CD Ⅰ(Val-Cys-Ser)与 CD Ⅱ ( Ser-Ala /Tyr-
Ala-Leu-Ala-Leu)结构,以及大部分的 C 端序列。利
用 MEGA5 进行不同物种中 PSAFs 的进化树分析发
现: PwPSAF 与北美云杉的 PSAF 聚为一簇(图 4),
裸子植物 PSAF 聚在 Clade Ⅲ,双子叶植物 PSAF 聚
在 Clade Ⅰ,单子叶植物 PSAF 聚在 Clade Ⅱ。
24
第 10 期 李长江等: 青杄 PwPSAF 基因的克隆与组织表达分析
图 1 青杄 PSAF 的全长 cDNA 序列及蛋白质氨基酸序列
Fig. 1 Full length cDNA sequence and deduced protein amino acid sequence of PwPSAF
2. 2. 3 二级结构和三级结构预测 利用 GOR4 工
具进行蛋白的二级结构预测,发现 PwPSAF 中 α -
螺旋 ( α-helix ) 为 27. 27%,无规则卷曲 ( random
coil) 占 50. 20%,延 伸 链 ( extended strand ) 为
22. 53%,且 α - 螺旋主要分布在 60—74 aa、100—
145 aa 及 N 端 220 aa 处(图 5A)。
三级结构由 SWISS-MODEL 工具预测(图 5B),
蛋白含有较多的 α - 螺旋结构,且在空间上有一定
距离,可以分别形成疏水区域或跨膜区域,跨膜区域
在 N 端与 C 端均有分布。
2. 3 组织表达分析
2. 3. 1 组织特异性表达分析 提取青杄各组织的
总 RNA 以及青杄种子在萌发不同时期幼体的总
RNA,进行琼脂糖凝胶电泳,显示总 RNA 的提取质
量较好,28 S 与 18 S 条带清晰(图略),可以进行后
续试验。
利用 RT-qPCR 技术检测 PwPSAF 在青杄各组
织的表达量,结果发现 PwPSAF 在针叶中表达量最
34
林 业 科 学 49 卷
图 2 PwPSAF 的理化性质分析
Fig. 2 Physical and chemical properties analysis of PwPSAF
A: ProtScale 工具预测 PwPSAF 疏水性结果; B: TMHMM 工具预
测 PwPSAF 跨膜分析结果; C: FoldIndex 工具预测 PwPSAF 固有
无序 化 分 析 结 果。 A: Hydrophobic analysis of PwPSAF by
ProtScale; B: Transmembrane analysis of PwPSAF by TMHMM; C:
Intrinsically disordered protein analysis of PwPSAF by FoldIndex.
表 2 PwPSAF 的同源蛋白
Tab. 2 Homological proteins of PwPSAF
物种
Species
蛋白名称
Protein name
登陆号
Accession
number
E
北美云杉 Picea sitchensis PsPSAF EF087687 3e - 126
毛果杨 Populus trichocarpa PtPSAF EF148032 4e - 86
葡萄 Vitis vinifera VvPSAF XM_002272548 3e - 74
黄顶菊 Flaveria trinervia FtPSAF FTRPHOTOI 8e - 78
马铃薯 Solanum tuberosum StPSAF JX576243 1e - 77
拟南芥 Arabidopsis thaliana AtPSAF NM_102871 3e - 75
蓖麻 Ricinus communis RcPSAF XM_002516373 1e - 74
大麦 Hordeum vulgare HvPSAF HVU08135 1e - 73
水稻 Oryza sativa OsPSAF AF093634 4e - 73
高,其次是在茎与种子中(图 6A)。在种子萌发的
过程中,PwPSAF 在第 2 天的表达量最高,之后开始
急剧下降,随着子叶生长,从第 6 天开始 PwPSAF 在
萌发幼体中的表达量逐步增高(图 6B)。
2. 3. 2 干旱与盐胁迫下 PwPSAF 的表达分析 提
取胁迫处理后的青杄各组织总 RNA,进行反转录与
浓度均一化后,进行 RT-qPCR 试验。结果显示,在
干旱情况下,PwPSAF 基因在根与茎中表达量与对
照相比 基 本无 变化,值得 注意 的是 在 针 叶 中
PwPSAF 的表达量下调 10 倍左右(图 7A)。在盐胁
迫下,PwPSAF 的表达量随着盐浓度的增加,在针叶
中不断下降,而在 6% 的 NaCl 溶液处理下,根与茎
中 PwPSAF 的表达量上调(图 7B)。
3 结论与讨论
本研究成功分离了青杄 PwPSAF 基因,基于其
蛋白质氨基酸组成进行了生物信息学分析。运用
RT-qPCR 技术检测了 PwPSAF 在青杄不同组织、种
子萌发不同时期,以及在干旱与盐胁迫下的表达情
况。结果显示 PwPSAF 是一个由 253 aa 组成的膜蛋
白,含有典型的 PSAK 结构域,通过 blast 检索发现
其氨基酸序列与北美云杉的 EF087687 高度同源,
二者相似性达到 98. 02%。进化树分析也表明二者
聚为一簇,由于青杄与北美云杉均为松科云杉属植
物,推测二者在进化上有共同的祖先。
针叶是青杄进行光合作用的主要场所,相比于
其他组织(如根、茎等),PwPSAF 在青杄的针叶中表
达量最高,暗示了该基因可能参与青杄针叶的光合
过程。这与其他物种中 PSAF 主要参与光合作用的
功能 一 致 ( Sommer et al., 2006; Farkas et al.,
2011a )。 同 时,这 也 与 作 者 对 青 杄 PSAK
(photosystem reaction center subunit K)的研究结果
类似(李长江等,2012),PwPSAK 与 PwPSAF 均为
PSⅠ复合体的重要组成部分,且二者基因均在青杄
的针叶中高表达。
重要的是,在种子萌发试验中 PwPSAF 的表达
量在第 2 天急剧升高,这个时期是青杄种子的吸胀
期,种子打破休眠,大量基因被诱导激活表达,在第
4 天 PwPSAF 的表达量又下调; 随着子叶的生长,
PwPSAF 表达量又逐步升高。PwPSAF 在青杄种子
萌发过程中表达量的变化说明 PwPSAF 在种子萌发
早期被诱导,参与了种子的萌发过程,但在萌发不同
阶段可能起着不同的作用。另一种可能是该基因受
到植物自身发育过程及外界环境信号的调控。
Chandok 等(2001)认为 PSAF 的表达受到光信号的
诱导,因此推断在本试验中,种子萌发 6 天后,
44
第 10 期 李长江等: 青杄 PwPSAF 基因的克隆与组织表达分析
图 3 不同物种 PSAF 蛋白多序列比对结果
Fig. 3 Multiple protein sequences alignment of PSAF of various species
多序列比对中的保守序列标记为黑色(相似性 = 100% ),粉色(相似性 > 75% ),蓝色(相似性 > 50% )。Conserved residues in this alignment
are shaded in black ( homology level = 100% ),pink ( homology level > 75% ) and blue ( homology level > 50% ) .
图 4 青杄 PSAF 进化树分析
Fig. 4 Phylogenetic tree analysis of PwPSAF
PwPSAF 受到光信号的诱导,表达量又开始逐渐增
加。然而,PwPSAF 的表达量在青杄种子萌发的 0 ~
4 天内升高又急剧下调的分子机制还有待研究。
PwPSAF 在青杄种子萌发与针叶中的表达模式说明
了其不但参与了青杄的光合作用过程,而且与光形
态建成的动态过程有关。
大量研究表明,在干旱及盐胁迫等非生物逆境
条件下,植物的光合作用会明显受抑。在玉米(Zea
mays)中的研究表明干旱会降低玉米的光合速率,
增强叶片对光的敏感性,严重制约光合作用 (卜令
铎等,2010);
图 5 青杄 PSAF 的二级结构与三级结构
Fig. 5 Predicted secondary and tertiary structure of PwPSAF
A: PSAF二级结构,由 GOR4 工具进行预测; B: PSAF 三级结构,由 Swiss-model 工具预测,虚线方框内为预测的跨膜区域。A: Secondary structure of
PwPSAF predicted by GOR4 tool; B: Tertiary structure of PwPSAF predicted by Swiss-model,and dotted boxes indicate the transmembrane domains.
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林 业 科 学 49 卷
图 6 PwPSAF 在青杄不同组织(A)及种子萌发
不同时间(B)的表达分析
Fig. 6 Expression levels of PwPSAF in different organs
(A) and during seed germination (B) of Picea wilsonii
所有结果均由三次重复试验所得。
Values are means ± SE from three independent assays.
在对杨树的研究中发现,受到高温与干旱胁迫后,核
酮糖 1,5 - 二磷酸羧化酶(Rubisco)的表达量将降
低,但 PS Ⅰ 中 PSAD ( photosystem reaction center
subunit D)的表达被诱导上调(He et al.,2008)。在
本研究中也表明,干旱会在分子水平降低 PwPSAF
的表达量,进而影响 PSⅠ的功能,这与 Batlang
(2010)在水稻(Oryza sativa)中的研究结果相同,即
在受到干旱胁迫后,水稻中 PSⅠ的 F 亚基、K 亚基
与 N 亚基的表达量均被下调。盐胁迫也严重影响
植物的光合作用。有研究表明,在盐胁迫下,光合作
用中起到重要作用的 Rubisco 活性降低,植物的光
合效率下降(张娟等,2008); 在高光胁迫下,植物
体内的活性氧(ROS)大量产生,直接破坏 PSⅡ的反
应中心,从而抑制光合作用(Murata et al.,2007),而
盐胁迫则通过抑制 PSBA 基因的表达抑制 PSⅡ的修
复(Allakhverdiev et al.,2002)。关于盐胁迫对 PSⅠ
的影响报道较少。在本试验中发现,盐胁迫下青杄
PSAF 在针叶的表达量下调,这说明盐胁迫也对
PSⅠ产生不利影响。且在本研究中,随着盐害的增
加,PwPSAF 下调的程度增大。值得注意的是在受
图 7 干旱与盐胁迫下 PwPSAF 在青杄不同组织的表达情况
Fig. 7 Expression level of PwPSAF in different organs of Picea wilsonii
under drought and salt stresses
所有结果均由 3 次重复试验所得。
Values are means ± SE from three independent assays.
到 6% NaCl 溶液处理后,茎中 PwPSAF 的表达量上
调,推测植物体针叶中光合系统受到损害,而植物自
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体的分子机制还有待研究。
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(责任编辑 徐 红)
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