全 文 ：第 !"卷 第 #$期
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林 业 科 学
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红平菇木质素降解酶系统漆酶、锰过氧化物酶及
木质素过氧化物酶的检测
池玉杰 闫洪波
（东北林业大学林学院 哈尔滨 #"%%!%）
关键词： 红平菇；木质素降解酶系统；锰过氧化物酶；漆酶；酶活检测
中图分类号：’78$2$9 文献标识码：- 文章编号：#%%# : 7!88（$%%&）#$ : %#"! : %"
收稿日期：$%%& : %" : $&。
基金项目：国家自然科学基金项目（9%;7#7%%）。
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G<4 4PGHA5411?1AH 4BQLR4 J01?G=0BJ K4H4 JARS14M AG M=II4H4BG =BG4HTA1，U6 36 TA1?4J 0I G<4 J01?G=0BJ，H4SH4J4BG=BD RABDAB4J4
S4H0P=MAJ4（VBW），1A55AJ4 ABM 1=DB=B S4H0P=MAJ4（.=W）A5G=T=G=4J，K4H4 R4AJ?H4M JS45GH0S<0G0R4GH=5A11L EL R0B=G0H=BD G<4
0P=MAG=0B 0I $，;X3VW AG !7% BR，-Y,’ AG !$% BR ABM T4HAGHL1 A150<01（/-）AG 9#% BR，G<4 1=DB=BXM4DHAM=BD 4BQLR4J 0I G<4
I?BD?J ABM G<4 H41AG=0BJ<=SJ E4GK44B 4BQLR4 A5G=T=G=4J ABM R4M=?R 50RS0J=G=0B ABM J?EJGHAG4J K4H4 DA=B4M6 Z4J?1GJ =BM=5AG4M
GJ=DB=I=5ABG1L 4BJ?EJGHAG4J K4H4 AMM4M，ABM ;& [·.: # ABM $%" [·.: # K<4B J?EJGHAG4J AMM4M6 ,<4 SAS4H 0II4H4M A EAJ=5 1=DB=B01LG=5 4BQLR010DL
0I 5#$6("*6) 78.9"( I0H I?G?H4 ?G=1=QAG=0B 0I G<4 4BQLR4J ABM I?HG<4H JG?ML 0B VBW ABM 1A55AJ4 R459"2 :&.0*： 5#$6("*6) 78.9"(；1=DB=B01LG=5 4BQLR4J；RABDAB4J4 S4H0P=MAJ4；1A55AJ4；4BQLR4 A5G=T=GL M4G45G=0B
木材白腐菌在分解木质素的过程中会产生非特
异性的分解木质素结构的酶系统，这些酶系统主要
包括细胞外过氧化物酶［锰过氧化物酶（RABDAB4J4
S4H0P=MAJ4， VBW）、木 质 素 过 氧 化 物 酶（ 1=DB=B
S4H0P=MAJ4，.=W）］和细胞外酚氧化酶［漆酶（1A55AJ4）］。
因此，在生物修复方面，白腐菌能够有效地降解废水
和土壤中难被降解的多氯联苯、多环芳烃、33,、染
料、炸药和其他氯化物、叠氮化合物等。一些白腐菌
产生所有上述这 9种分解木质素的酶，而大多数白
腐菌仅产生 $种甚至 #种分解木质素的酶，表明这 9
种酶在分解木质素的过程中并不是全都必需的。大
多数白腐菌产生 VBW和 1A55AJ4，目前已知只有少数
几种白腐菌能够产生 .=W。因此，VBW 和 1A55AJ4 是
降解木质素的主要酶系（C0IH=5#&&!）。VBW（*(#2##2#2#9）是一种依赖 C$U$ 的亚铁
血红素糖蛋白酶，仅广泛存在于木材白腐菌和各种
栖息土壤的枯落层降解担子菌中，细菌、酵母菌、霉
菌和菌根菌都不产生 VBW。 1A55AJ4（*(#2#%292$）是
一种含铜的糖蛋白氧化还原酶，在植物、真菌、昆虫
和细菌中都检测到了该酶的存在，其中在白腐真菌
和植物中最为普遍。.=W（*(#2##2#2#!）与 VBW一样
也是一种含亚铁血红素的过氧化物酶。
国外对于白腐菌降解木质素酶系统的研究主要
集中金孢展齿革菌（5-.0$(":-.$*$ :-(+)");"(169）、虫
拟蜡 菌（ !$(1;"(1";)1) )642$(91);"(.）、糙 皮 侧 耳
（5#$6("*6) ")*($.*6)）、云芝栓菌（<(.9$*$) 2$()1:"#"(）等
菌种，包括产酶条件的优化、基因的克隆及表达、酶
的纯化与蛋白结构分析等（-1=5 $* .# 6，#&&7；
\=AHM=BA $* .# 6，$%%%；)H=4 $* .# 6，$%%%；,4110 $* .# 6，
$%%%；]0AT4H $* .# 6，$%%9）；
我国也进行了几种白腐菌 VBW和 1A55AJ4的活性测
定及产酶条件优化研究（周金燕等，#&&9；浦跃武
等，#&&8；桑希斌等，$%%$；张连慧等，$%%"），对不同
白腐真菌的 VBW和 1A55AJ4进行了纯化及酶学性质
研究（谢慧芳等，$%%9；苏东海等，$%%8；王岁楼等，
$%%8）。白腐真菌 1A55AJ4基因的克隆、表达研究较为
深入，目前已有粗糙脉孢菌（!"#$%&’%$( )$(&&(）、金针
菇（*+(,,#+-.( /"+#0-’"&）等几种白腐菌的漆酶基因
得到了克隆（张银波等，!""#；谌斌等，!""$），而多种
其他白腐菌的 %&’酶学和分子生物学研究则相对
较少。在真菌酶活性的检测中，不同的真菌种和同
种真菌不同菌株之间存在着酶活性的差异；对于同
一真菌菌株，培养基的成分、不同的培养条件也会影
响到酶的产生和活性的大小。红平菇（ 1+"#$%0#&
23(,%$）既是一种白腐菌，又是一种色、香、味俱佳的
食用菌，对其酶学和分子生物学研究鲜见报道。本
文对红平菇菌株 ()在以低氮天冬酰胺 *琥珀酸培
养基（+,-.，/01 &234056& 78974752&6 8:;;2&2; 7;2<）为基
础培养基并分别添加 # 种不同的酶作用底物条件
下，对 %&’，/7;;786 和 +2’ 的活性进行了检测，目的
是搞清红平菇木质素降解酶系统的主要酶系及其与
培养基成分和酶作用底物等条件的关系，为进一步
利用该菌株产木质素降解酶，深入研究红平菇分解
木质素的酶系统的作用机制与木质素降解机制的关
系，以及基因表达调控等分子生物学机制提供基础
的酶学研究。
! 材料与方法
)=) 菌种来源 红平菇菌株 ()由东北林业大学林
学院森林保护学科森林病虫病理实验室提供，试验
前在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（’>-，903730 <6?34086
7574）斜面上的菌种冷藏于 # @冰箱。
)=! 培养基 综合培养基：’>-培养基。产酶基
础培养基：低氮天冬酰胺 * 琥珀酸培养基（A24B "0
(+ C，)DEF；(737BB7 "0 (+ C，)DFG）。
)=G 培养方式 在 !H" I+ 三角瓶中加入 E" I+
+,-.培养基，分别添加 # 种不同底物进行菌种培
养：-C +,-.培养基不含 %&! J，即矿物元素溶液中
不添加 %&.K#·(!K；LC +,-. 培养基含 %&! J（!=$E
!I0/·+
* )），即矿物元素溶液中添加 %&.K#·(!K；MC
+,-.培养基含 %&! J（!=$E!I0/·+
* )），并加入 ! 5青
杨（1%’#+#& #&&#$-".&-&）木屑为产酶底物；>C +,-.培
养基含 %&! J（!=$E!I0/·+
* )），并加入 )" II0/·+* )
!，$ *二甲氧基苯酚（!，$N>%’）"=) I+为产酶底物。
所有的培养液高压灭菌 )H I2&，接菌前向每个
灭菌的三角瓶中加入 H I+除菌的 )HO葡萄糖溶液。
保藏菌种先接种至 ’>-平板培养基（D ;I）上，!F @
培养 )"天，F II打孔器于培养皿菌丝边缘打孔，将
菌饼转接至灭菌后的三角瓶中，每个三角瓶加入 H
块菌饼，!F @静止培养，每项试验设 G 个重复。培
养至 G，H，E，D，))，)G，)H，)E和 !)天提取培养液即胞
外酶液，每个三角瓶中每次提取酶液 )=G I+，将提
取的粗酶液离心（)G !"" 4·I2&* )，室温）H I2&，进行
酶活测定后冷藏于 * !" @冰箱。
)=# 酶活测定方法 %&’的活性通过紫外可见分
光光度计（P/340896; #G""940，-I648Q7I）在 #E" &I处
检测 !，$N>%’ 的氧化进行测定（R74228Q2 "0 (+ C，
)DD!）。测定体系 ) I+，其中丙二酸钠缓冲液（H"
II0/·+* )）F#"!+，%&.K#（)" II0/·+
* )）H"!+，!，
$>%’（)" II0/·+* )）H"!+，酶液样品 H"!+，(!K!（)"
II0/·+* )）)"!+，以 ) I+去离子水作为对照，测定
#E" &I处吸光度在 ) I2&内的变化值，反应起始于
)" II0/·+* ) (!K! 的加入。/7;;786的活性通过紫外
分光光度计在 #!" &I 处检测 !，!S *连氮 *双（G *
乙基苯并噻唑 * $ *磺酸）（-LT.）的氧化进行测定
（U55643 "0 (+ C，)DD$）。测定体系 ) I+，其中丙二酸
钠缓冲液（H" II0/·+* )）FH"!+，酶液样品 )""!+，
-LT.（!" II0/·+* )）H"!+，以) I+去离子水作为对
照，测定 #!" &I处吸光度在G I2&内的变化值。+29
采用以藜芦醇（V-）为底物的测定方法（T26& "0 (+ C，
)DFF）。测定体系 ) I+，其中丙二酸钠缓冲液（)""
II0/·+* )，9(G="）G#"!+，藜芦醇（!" II0/·+
* )）)""
!+，酶液样品 HH"!+，(!K!（H# II0/·+
* )）)"!+，以
) I+去离子水作为对照，测定 G)" &I 处吸光度在
G I2&内的变化值。酶活单位（P）：上述条件下，每
分钟催化 )!I0/ !，$N>%’，-LT.或 V-所需的酶量。
计算中的!#E" W #D $""（I0/·+* ) ;I）* )，!#!" W G$ """
（I0/·+* ) ;I）* )，!G)" W D G"" """（I0/·+* ) ;I）* )。
" 结果与分析
!=) 红平菇 #种培养液中 +2’的酶活测定 在 #种
不同的培养液中分别对 +2’的酶活进行检测，但在
G)" &I处均未检测到吸光值的变化，表明红平菇不
产生 +2’。
!=! 红平菇培养液 -酶活测定结果 红平菇在不
含 %&! J的 +,-.培养基中不加底物条件下培养 !)
天过程中，提取的酶液未检测到 %&’的活性，但是
可以检测到 /7;;786的活性，/7;;786 D天达到最大分
泌量，酶活力为 GF P·+* )（图 )）。
!=G 红平菇培养液 L酶活测定结果 红平菇在含
%&! J的 +,-.培养基中不加底物条件下培养 !) 天
过程中，提取的酶液检测到 %&’的活性变化，但活
性很低，)H 天达到分泌高峰，最大酶活力仅为
H P·+* )；/7;;786在 D天时达最大分泌量，酶活力达
G$ P·+* )（图 !）。-，L !种培养液的检测结果表明：
HH)第 )!期 池玉杰等：红平菇木质素降解酶系统漆酶、锰过氧化物酶及木质素过氧化物酶的检测
图 ! 培养液 " #$%和 &’((’)*酶活随时间变化
+,-. ! #$% ’$/ &’((’)* ’(0,1,02 34 (5&056* 7*083/ "
#$9 :是红平菇产生 #$%的必要因子，在诱导红平菇
产生 #$%的过程中起着关键作用，而漆酶的产生则
不受该条件的制约。对比 "，; 9种培养液漆酶的活
性基本相同。
9 培养液 ; #$%和 &’((’)*酶活随时间的变化
+,-. 9 #$% ’$/ &’((’)* ’(0,1,02 34 (5&056* 7*083/ ;
9<= 红平菇培养液 >酶活测定结果 红平菇在含
#$9 :的 ?@"A培养基中加入木屑为底物条件下培养
9!天过程中，提取的酶液检测到 #$%的活性变化，
#$%在 !=天达到最大分泌量，酶活力为 BC D·?E !；
&’((’)* C 天达到最大分泌量，酶活力为 9FG D·?E !
（图 =）。表明红平菇液体培养过程中添加木屑为底
物可以显著提高 #$%和 &’((’)*的产生量，同时还可
缩短 #$%达到最大分泌量的时间，说明底物对于白
腐菌木质素降解酶系统产生的诱导作用。
= 培养液 > #$%和 &’((’)*酶活随时间的变化
+,-. = #$% ’$/ &’((’)* ’(0,1,02 34 (5&056* 7*083/ >
9#$9 :的 ?@"A培养基中加入 9，BJI#%为底物条件下
培养 9! 天过程中，提取的酶液检测到 #$%的活性
变化，#$% 在 !! 天达到最大分泌量，酶活力为
HB D·?E !；&’((’)* 在 C 天达最大分泌量，酶活力为
!CC D·?E !（图 H）。表明红平菇液体培养过程中添加
9，BJI#%为底物也可以显著提高 #$% 和 &’((’)* 的
产生量，同时缩短了 #$%达到最大分泌量的时间。
对比 >，I 9种培养液过程中酶的产生结果发现，以
木屑为底物 #$%和 &’((’)*的产量要稍高于以 9，BJ
I#%为底物 #$%和 &’((’)*的产量。
9比较 在 H 种不同的培养液中，红平菇的 #$% 和
&’((’)*活性变化是有规律的。&’((’)*的变化曲线更
一致，都是在 =天之后产生，以后较迅速地升高，在
第 C天达到最高，以后又迅速下降，!! 天之后就变
得很低，!= K !G 天后接近为零；#$%也是在 = 天之
后产生，只是活性很低，以后逐渐升高，在第 !! K !=
K !G天后达到最高，以后又逐渐下降，!L或 9!天时
接近为零，这与作者以前的研究结果相似（>8, !"
#$ .，9FFL）。红平菇 #$% 的产生需要有 #$9 : 的参
与，&’((’)*在有无 #$9 : 的条件下均可产生，最大分
泌量也不受该因素的影响。培养过程中添加酶的底
物木屑和 9，BJI#% 可较大程度地提高 #$% 和
BG! 林 业 科 学 HG卷
! 培养液 " #$%和 &’((’)*酶活随时间的变化
+,-. ! #$% ’$/ &’((’)* ’(0,1,02 34 (5&056* 7*083/ "
&’((’)*的产量，&’((’)*产量提高 !倍，#$%的产酶量
则提高了 9: 倍多；底物不同对于培养过程中酶的
产生影响也不同，添加木屑为底物要比添加 ;，<=
"#%为底物的 #$%和 &’((’)*的产量要高，并且二者
间的差别在 #$% 的分泌量上表现得更为显著（图
>）。
图 > !种培养液中 #$%和 &’((’)*酶活比较
+,-. > ?37@’6,),3$ 34 #$% ’$/ &’((’)* ’(0,1,02
’73$- 4356 (5&056* 7*083/
! 结论与讨论
本文采用 ABCD培养基在 !种不同培养液中对
白腐菌红平菇木质素降解酶系统的主要酶系 #$%，
&’((’)*和 A,%的活性进行检测。结果表明，红平菇
可同时产生 #$%和 &’((’)*，但不产生 A,%，; 种酶的
活性变化是有规律的，&’((’)*总是在第 E 天时达到
最高。
通过 ;种酶活性的检测，也获得了酶与培养基
的成分和酶作用底物等条件的关系。对比 !种培养
液的酶活力测定结果，发现 #$; F 是产生 #$% 的必
要因子，#$; F在诱导菌株产生 #$%的过程中起着关
键作用，而漆酶的产生则不受该条件制约，这与前人
对其他白腐菌的研究结果相同。而二价锰离子
#$; F在木材和土壤的环境中是一直存在的，#$%以
#$; F作为首选还原底物，即电子供体，使其变成高
度活性的三价锰离子 #$G F，螯合的 #$G F 作为低分
子质量的物质，成为氧化还原中介体，是可渗透和扩
散到木材细胞内木质素结构中的氧化剂，可在远离
酶的一定位置上发挥作用，经由氢原子和一个电子
的提取，非特异性地氧化木质素大分子中的酚结构
（池玉杰等，;::H）。
在培养液内添加酶作用的底物木屑和 ;，<="#%
后，可以较大程度地提高 #$%和 &’((’)*的分泌量，
表明底物对于白腐菌木质素降解酶系统产生的诱导
作用。底物不同对于培养过程中酶的产生影响也不
同，添加木屑为底物要比添加 ;，<="#% 为底物的
#$%和 &’((’)* 的产量稍高。在添加 ;，<="#% 的培
养过程中可以观察到培养基的颜色变为浅褐色，且
菌丝的生长速度及生长量均比底物为木屑培养方式
稍差，原因可能是 ;，<="#%本身对白腐菌的生长具
有一定的抑制作用，从而阻碍了酶的分泌。
本文对 #$%和 &’((’)*酶活检测，选择了限制营
养型基础培养基低氮天冬酰胺 I琥珀酸培养基，以
便可以更加灵敏地检测分泌量较少的 #$%，因此酶
活相对于选择富营养型培养基较低，同时最大产酶
时间稍有延后。本项试验尚未进行培养条件的优
化，推测是导致酶活相对较低的一个原因，因此如需
要提高酶活力、缩短产酶时间，还需进一步选择富营
养型培养基并对产酶条件进行优化。
参 考 文 献
谌 斌，唐雪明，沈 微 . ;::酵母中的初步表达 .食品与生物技术学报，;>（!）：!G I >!.
池玉杰，伊洪伟 .;::HJ 木材白腐菌分解木质素的酶系统 I锰过氧化
物酶、漆酶和木质素过氧化物酶催化分解木质素的机制 .菌物学
报，;<（9）：9>G I 9<:.
浦跃武，甄浩铭，冯书庭，等 .9EEKJ 白腐菌产锰过氧化物酶条件的研
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桑希斌，王宜磊 .;::;J 采绒革盖菌锰过氧化物酶的诱导及部分特性
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苏东海，苏东民，杨国伟，等 . ;::KJ 白腐菌 L%;9漆酶分离纯化及其部
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王岁楼，王琼波 .;::KJ 灵芝突变株 M9>:;漆酶的分离纯化及酶学性
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谢慧芳，近藤隆一郎，李忠正 .;::GJ 白腐菌 !"#$%&’("#%)% *’&+,+# NO I
H>9第 9;期 池玉杰等：红平菇木质素降解酶系统漆酶、锰过氧化物酶及木质素过氧化物酶的检测
!"#产锰过氧化物酶的生产及初步纯化 $林产化学与工业，"%
（#）："" & "!$
张连慧，刘卫晓，葛克山，等 $ "’’() 变色栓菌产锰过氧化物酶的条件
优化 $微生物学通报，%"（(）：*+ & ,’"$
张银波，姜 琼，江木兰，等 $ "’’#) 金针菇漆酶基因的克隆及其在毕
赤酵母中的表达研究 $微生物学报，##（!）：--( & --* $
周金燕，张发群，桑原正章 $ ,**%) 真菌产生的锰过氧化物酶和漆酶
的研究! $富氮培养基筛选产酶的真菌 $微生物学报，%%（(）：
%+- & %*, $
./01 2，.30/4567879 :，;$ ,**-) ?@7871A480B7A0<9 491<=09D E79D79454 F48("&*+’+,’&-./ $ I0<1@0E017 4A I0?@0 J K，>7A7337 .，270L7/7 M$ "’’-) ?79 1CO9D0 09184754 /0D909 =4D87=7A0<9 79= A@4 F8<=O1A0<9 49BHE45？P9A4897A0<97/ I0<=4A480<87A0<9 79= I0<=4D87=7A0<9，(*（,）：%"
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（责任编辑 石红青）
+(, 林 业 科 学 #(卷