全 文 ：第 !" 卷 第 #$ 期
% $ # $ 年 #$ 月
林 业 科 学
&’()*+(, &(-.,) &(*(’,)
./01!"!*/1#$
2345!% $ # $
根癌农杆菌介导的淡紫拟青霉遗传转化体系的建立!
王曦茁#6朴春根#6李6虹%6汪来发#6郭民伟#6李6永#6刘晓莉8
"#1中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所6国家林业局森林保护学重点实验室6北京 #$$$7#&
%1中国林业科学研究院林业研究所6北京 #$$$7#& 81安徽农业大学林学与园林学院6合肥6%8$$8"#
摘6要!6基于根癌农杆菌介导的遗传转化方法!选择植物线虫生防真菌淡紫拟青霉的分生孢子为受体!建立以
W!#@ 为筛选标记遗传转化体系$ 通过优化遗传转化条件!达到较高的转化效率% # $$$ ‘% !$$个转化子’#$ ="分生
孢子$ 对转化子进行 :’I验证!表明 +YD*,已整合到淡紫拟青霉的基因组中!表型测定发现转化子的遗传表现稳
定$ 农杆菌介导淡紫拟青霉突变体库的建立!为进一步筛选对植物线虫致病性高的突变体(了解淡紫拟青霉的侵
染过程和侵染机制提供基础!对培育更优良的植物线虫生防菌株!开发高效生防制剂等具有重要的意义$
关键词%6根癌农杆菌& 淡紫拟青霉& WY!#@& 遗传转化
中图分类号! &?"81#666文献标识码!,666文章编号!#$$# =?!@@"%$#$##$ =$$7A =$@
收稿日期% %$#$ =$A =$!& 修回日期% %$#$ =$? =%8$
基金项目% 国家自然科学基金"8$??#?8## !农业部科技成果转化资金项目"%$#$WF%!8%$"#A# $
!汪来发为通讯作者$
Q$’&,*-$"6(/’#41<($8"%7&(-)+7)+&="%-&9*LM(3-&’(3B5&/$4#56&’-#/
)0$’(6 #4/"&%-#$+6%&*#-#"%-9)*
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;,$’5&<’%6(N 4LHPP4JUV! 4LMSMPM9S3L HP3/NHUH9/>J$"&+6-90&"#6+6$&+),#! 9R94L/JNR09N4NM;94/UMP! Z9P
PM0M34MU 9P4LMSM3MR4/S5,N M>H3HMN4/S;94H/N PVP4M;/>JM6+6$&+),#Z9PMP49T0HPLMU TVL9ST/SHNSMPHP49N3M39PPM4M9P9PM0M34H[M;9S^MS4/3/NP4SJ34[M34/SRF(YW8’Y$:’(T9PMU /N 25%-8$&*"%+,9*,9".$&+")#Y;MUH94MU
4S9NP>/S;94H/N5bPHN<4LHPPVP4M;! JM6+6$&+),#Z9PPJ33MPP>J0V4S9NP>/S;MU ZH4L 9N M>H3HMN3V/># $$$ =% !$$
4S9NP>/S;9N4PRMS#$" PR/SMP5(4HNUH394MU 4L94+YD*,L9U TMMN HN4MJM6+6$&+),#TV:’I9N90VPHP
/N 4LM4S9NP>/S;9N4P! 9NU 4LM4S9NP>/S;9N4PSM;9HNMU P49T0M5+LMMP49T0HPL;MN4/>+YD*,HNPMS4H/N90
;J49N4P0HTS9SVZ/J0U RS/[HUMP9T9PHP>/S>JS4LMSPM0M34HNJM
6+6$&+),#! ZLH3L HP/>H39N3M4/>/P4MS9TM4MS9N4HYNM;94/UMP4S9HN 9NU UM[M0/R M>M34H[MTH/3/N4S/09=(0 >#53$%625%-8$&*"%+,9*,9".$&+")#& J$"&+6-90&"#6+6$&+),#& WY!#@& 4S9NP>/S;94H/N
66淡紫拟青霉"J$"&+6-90&"#6+6$&+),##是一种典型
的土壤习居菌!是一些植物病原线虫的重要天敌
"李芳等!#77@#$ 淡紫拟青霉能够有效防治南方根
结线虫 "H"6-+?-50)"+)&-5)+*$ # 和马铃薯白线虫
">6-8-?"%$ :$6+?$#等植物寄生线虫!对南方根结线
虫的卵寄生率高达"$_ ‘?$_ " G94909"*$65!#7?7&
G94909!#7@"#!许多试验表明淡紫拟青霉杀线活性与
化学杀线剂相比较无明显差别甚至超过化学杀线剂
".He9V9EJ;9N "*$65!%$$%& 高学彪等!#77@#!而且
还能促进植物的生长 "李芳等!#77@#!达到增产的
目的"EL9N "*$65!%$$%#$ 国内外在淡紫拟青霉的生
物学特性(生防应用和代谢物生理功效等方面的研
究已取得了很大的进展! 但在分子水平! 特别是致
病功能基因及其机制等方面的研究甚少$
构建插入突变体库!是获得突变体并进一步克
隆相关基因的有效方法之一$ 根癌农杆菌介导的转
化 " 25%-8$&*"%+,9 *,9".$&+")#Y;MUH94MU 4S9NP>/S;9Y
4H/N!,+X+#技术是获得真菌插入突变的有效手段
之一!它在一定程度上克服了其他插入突变技术的
缺点!具有操作方法简便(受体材料多样(转化效率
较高"UMWS//4"*$65!#77@& ’LMN "*$65!%$$$#(单拷
贝插入的比例高"UMWS//4"*$65!#77@#(转化子稳定
"’9;R/V"*$65!%$$8& XH3LHM0PM"*$65!%$$!#等优点!
已经成为真菌功能基因组学研究的有力工具"方卫
林 业 科 学 !" 卷6
国等!%$$%#$ 目前应用根癌农杆菌介导的转化技
术!已成功实现了昆虫病原真菌绿僵菌"H"*$%’+7+,9
$)+#-:6+$"# "a9N<"*$65!%$$" #和白僵菌 "3"$,G"%+$
8$##+$)$#"U/PIMHP"*$65!%$$!#的遗传转化$ 虽然
丝状真菌的基本过程相同!但不同真菌转化所需要
的转化参数存在差异!需要针对不同真菌的转化条
件进行摸索$ 本研究成功地利用根癌农杆菌介导的
遗传转化方法对淡紫拟青霉进行了遗传转化!并对
可能影响淡紫拟青霉遗传转化的因子进行研究!建
立根癌农杆菌介导的淡紫拟青霉遗传转化体系!为
淡紫拟青霉突变体库的构建(相关侵染基因的克隆
等研究奠定基础$
#6材料与方法
?C?A材料
#5#5#6菌种#质粒及其来源6淡紫拟青霉 %$Y? 菌
株和根癌农杆菌菌株 )\,#$A 及 ,W-Y# 由中国林
业微生物菌种保藏管理中心"’a’’#提供!分别放
置于 ! d和 =@$ d冰箱中保存备用$
构建质粒 RF(YW8’Y$:’"的原始质粒 RF(YW8’
是日本京都府立大学 O9PJVJ^HEJT/教授构建 "经
O9PJVJ^HEJT/教授同意!由中国农业大学彭友良教
授惠赠#$ 质粒 RF(YW8’Y$:’"由本实验室构建$
质粒 R)+a%@,!带有 W=!#@ 的抗性基因 $:’(!
该基因被克隆后用来置换 RF(YW8’中的 ’:’"16$(h
K’-(#基因$
#5#5%6主要培养基和抗生素6培养基% -F培养
基(基本培养基";HNH;90;MUHJ;!:D,#和诱导培养
基"HNUJ34H/N ;MUHJ;!(X#分别用于农杆菌划线培
养(振荡培养!共培养前诱导$ 农杆菌和淡紫拟青霉
孢子混和后!铺在共培养培养基上进行转化!用
:D,培养基进行转化子的第 # 次和第 % 次筛选$ 转
化子的保存用 :D,培养基$ -F培养基% 胰蛋白胨
"+SVR4/NM##$ #$ TJ>MS" R\ ?1$ #! %$ ;-XY*! # ;-#$ ;<’-=#
’9’0%’%\%2(#$ ;-%$$ ;<’-
=#葡萄糖 "<0J3/PM#!
#$ ;-$1# ;<’-=# aM&2!! A ;-&R/SM)0M;MN4P!
%1A ;-%$$ ;<’-=# *\!*28!加蒸馏水定容至 # -&
(X培养基% $1@ ;-#1%A ;/0’-=# EYTJ>MS" R!17#!%$ ;-XY*!# ;-#$ ;<’-=# ’9’0%’%\%2!
A ;-&R/SM)0M;MN4P!%1A ;-%$$ ;<’-=# *\!*28!
#$ ;-A$$ ;<’-=#甘油"<0V3MS/0#!!$ ;-# ;/0’-=#
X)&" R\ A1A 用 *92\调节 R\值 #! #$ ;-%$$
;<’-=#葡萄糖"<0J3/PM#!% ;-#$$ 5<’;-=# ,&!加
蒸馏水定容至 # -$
抗生素% 振荡培养农杆菌时所用抗生素为链霉
素"A$ 5<’;-=##和卡那霉素"#$ 5<’;-=# #! 对得
到的转化子进行筛选时所用抗生素为头孢噻肟钠
"%$$ 5<’;-=##和 WY!#@"@$$ 5<’;-=##$
其他试剂% 乙酰丁香酮",&#"%$$ 5<’;-=##$
?@DA表达载体的构建
#5%1#6选择标记基因的克隆6潮霉素 F作为选择
标记虽然可以用于某些真菌的遗传转化!但本试验
中淡紫拟青霉对潮霉素不敏感!高浓度的潮霉素仍
不能抑制拟青霉的生长!故选择 WY!#@ 基因 $:’(基
因为筛选标记$ $:’(基因是根据设计的保守引物
通过 :’I方法从 R)+a%@,载体中扩增获得$ 回收
:’I产物并进行 +载体连接!连接产物转化大肠杆
菌 D\A4感受态细胞!涂在附加 A$ 5<’;-=#氨苄青
霉素",X:#的 -F固体平板上筛选重组菌株$ 重组
菌株质粒 D*,碱法小量提取的步骤参照王关林等
"#77@#$
#1%1%6选择标记基因的改造6利用在 $:’(引物端
设计加入的 16$(和 K’-(酶切位点进行双酶切!同
时将 RF(YW8’质粒也用 16$(和 K’-(双酶切& 将酶
切后回收的 D*,片段!用 +! D*,-H<9PM进行连接$
连接产物转化大肠杆菌 D\A4感受态细胞!构成表
达载体 RF(YW8’Y$:’"$ 转化后得到的重组子进行
:’I检测!重组菌株质粒 D*,碱法小量提取的步骤
参照王关林等"#77@#$
?CEA淡紫拟青霉遗传转化体系的建立
#585#6根癌农杆菌菌株的筛选6使用 % 种已经成
功用于丝状真菌遗传转化上!并证明转化效率很高
的农杆菌菌株 )\,#$A 和 ,W-Y#":9S^ "*$65!%$$!&
XH3LHM0PM"*$65!%$$A#进行转化效率对比!重复 8 次!
取平均值$
#585%6抑制淡紫拟青霉 %$Y? 菌株的 WY!#@ 最佳浓
度的筛选6取大小相同"直径为 A ;;#(培养条件
一致"A 天(%A d#的边缘菌丝块!移到含 WY!#@ 浓
度分别为 $! #$$! %$$! 8$$! !$$! A$$! @$$ 和 # $$$
5<’;-=#的 :D,平板上& 然后置于 %A d 恒温箱中
进行培养!分别于培养后 !@!?%!7" 和 #$@ L 观察记
录! 测定其对菌落生长情况$
#58586最佳转化条件的筛选6## 不同生长时期的
淡紫拟青霉孢子悬浮液的准备6淡紫拟青霉 %$Y?
菌株在 :D,平板上 %A d培养 A 天后! 刮取培养基
上的分生孢子到适量的吐温 @$ 中! 振荡后用 ! 层
灭菌擦镜纸过滤孢子悬液以除去菌丝!装于试管中!
"7
6第 #$ 期 王曦茁等% 根癌农杆菌介导的淡紫拟青霉遗传转化体系的建立
调节孢子含量至 # p#$" 个’;-=#!制成新鲜孢子悬
浮液备用$ 另取 ! d保存 # 个月的平板!直接刮取
培养基上的分生孢子!经过同样方法处理!制成孢子
悬浮液备用$
%# 不同浓度农杆菌的准备6取出 =@$ d保存
的农杆菌!-F培养基"&XA$ 5<’;-=#!E9N C#$ 5<’
;-=##上划线培养 # 天$ 挑取单菌落 :D,培养液
"&XA$ 5<’;-=#!E9N C #$ 5<’;-=# #中振荡培养
# ‘% 天"%@ d!%$$ S’;HN =# #$ 在 (X液体培养基
",& %$$ 5<’;-=##中振荡培养 " L!调节 2D""$值为
$1#!$1%!$18!$1!!$1A!$1" 和 $1?!分别置于 #$ ;-
无菌管中备用$ 重复 8 次!取平均值$
8# 不同浓度乙酰丁香酮的准备6在 (X液体培
养基 和 共 培 养 培 养 基 中 加 入 #$$! %$$! A$$!
# $$$ 5<’;-=#的乙酰丁香酮!设不加 ,& 的为空白
对照$ 重复 8 次!取平均值$
!# 最佳共培养条件的筛选6!不同共培养时
间(温度(R\的准备6选择 8 个共培养 R\% A1$!
A1A 和 "1$& ! 个共培养时间% %!!!@!?% 和 7" L& !
个共培养温度% %%!%A!%@ 和 8# d$ 重复 8 次!取平
均值$ 2不同共培养方式的选择6% 种共培养方
式% ,1将 )\,#$A 菌液和 %$Y? 孢子悬浮液等体积
混合! %@ d!#!$ S’;HN =#于摇床共培养 #! L$ 将共
培养液均匀涂布在含 WY!#@"@$$ 5<’;-=# #和头孢
噻肟钠"%$$ 5<’;-=##的 :D,培养基上!%A d培养
8 ‘A 天$ F1混合 #$$ 5-)\,#$A 菌液和 #$$ 5-
%$Y? 孢子悬浮液"#$" 个’;-=# #!混合液均匀涂布
在共培养平板上的滤纸片上"预先将滤纸片剪成宽
度 A ;;左右的条形#!%A d下避光共培养 ?% L$
将滤纸条揭下!反铺到含 WY!#@"@$$ 5<’;-=##和头
孢噻肟钠 "%$$ 5<’;-=# #的 :D,培养基上!%A d
培养 !@ L$ 揭 下 滤 纸 条! 在 %A d 下 培
养# ‘% 天$ 66
?CFA抗性菌株的筛选
#5!5#6筛选培养及抗性稳定测定6挑取选择培养
基":D,#上培养的抗性单菌落!至含有 WY!#@ "@$$
5<’;-=##和头孢噻肟钠"%$$ 5<’;-=# #的 :D,平
板上!于 %A d恒温培养!进一步筛选$ ? 天后!有孢
子产生的转化子进行单孢分离$ 分离的单孢转接到
:D,"WY!#@ @$$ 5<’;-=# 和 头 孢 噻 肟 钠 %$$
5<’;-=##上进行 8 次筛选& 没有孢子产生的转化
子!在菌落边缘挑取单根菌丝末端进行分离培养!8
天后再次筛选培养$ 以上步骤中经 A 次筛选的抗性
菌株!转接到含有 WY!#@ "@$$ 5<’;-=# #的 :D,斜
面培养基上保存$
#5!5%6转化子的 :’I检测6转化子总 D*,提取
及农杆菌 +H质粒 D*,的碱法小量提取的步骤参照
王关林等"#77@#$
随机挑选 #$ 个转化子 "+#Y+#$ #进行 :’I验
证$ 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合
成! 扩增 2:’(基因所用引物如下!下划线表示 $’-(
和 16$(酶切位点$
$:’(Ya/S% A /" ’’W’+’W,W,W+’W,’+’,+W
,,’,,+Y8/&
$:’(YIM[% A / " W’’,+’W,+++,,++’++,W,
,,,,’Y8/$
:’I扩增体系如下% #$ pTJ>MS"X<% C# A 5-!
U*+:"%1A ;;/0’-=# # ! 5-!WMN/;MD*,#1A 5-!
,RL(Ya/S" %$ R ;/0’5-=# # # 5-! ,RL(YIM[" %$
R;/0’5-=### 5-!+9] 酶"A b’5-=###1A 5-!UU\%2
8" 5-$
扩增反应程序% 7! d预变性 ! ;HN!7! d变性
8$ P!A! d退火 8$ P!?% d延伸 #1A ;HN!进行 8$ 个
循环& 最后 ?% d延伸 #$ ;HN!! d结束& 电泳检查
扩增结果!以鉴定 +YD*,是否插入到淡紫拟青霉基
因组内$
?CGADbLT 转化子的生物学特性比较
将野生型 %$Y? 菌株和分离培养的转化子!用打
孔器打成大小相同的菌块接到 :D,培养基上!
%A d培养!菌丝长满培养皿后观察记录$
%6结果与分析
D@?A质粒 %N2LXEIL",5"的构建
质粒 RF(YW8’Y$:’"的构建示意图见图 #!将原
有质粒 RF(YW8’中的 ’:’ 基因置换为 $:’(基因!以
用于淡紫拟青霉的遗传转化!W!#@ 基因从质粒
R)+a%@,上扩增获得$
DCDADbLT 遗传转化体系的建立
%5%5#6抑制 %$Y? 的 WY!#@ 浓度6%$Y? 在含不同浓
度 WY!#@ 的 :D,培养基上的菌落生长情况见表 #$
当 WY!#@ 浓度达到 @$$ 5<’;-=#以上时!已经可以
完全抑制淡紫拟青霉 %$Y? 菌株的生长$
%5%5%6淡紫拟青霉孢子新鲜程度不同对转化率的
影响6分别使用保存了 # 个月的淡紫拟青霉 %$Y?
菌株制成的孢子悬浮液和新鲜菌株制成的孢子悬浮
液!同 )\,#$A 进行共培养!(X作共培养培养基
"R\ A1A #! :D, 作 筛 选 培 养 基! ,& 浓 度 %$$
5<’;-=#!WY!#@ 的筛选浓度为 @$$ 5<’;-=#!在相
同的试验条件下进行遗传转化试验!结果表明% 新
鲜孢子的转化率远远高于保存 # 个月后的孢子转
?7
林 业 科 学 !" 卷6
666
图 #6载体构建示意
aH<5#6’/NP4SJ34H/N />[M34/SP
表 ?A不同浓度 XLF?c 对淡紫拟青霉 DbLT 菌株
生长情况的影响
B&,C?AB"((44(<’#43-44(5(/’<#/<(/’5&’-#/$#4XLF?c
#/95#>’"#4/.#-#"%-9)*$’5&-/DbLT
浓度 ’/N3MN4S94H/Nh
"5<’;-=# #
菌落直径 ’/0/NVUH9;M4MSh3;
!@ L ?% L 7" L #$@ L
$ %1## A1#8 ?1A? 71#%
#$$ #18A !17A "1@8 @1$#
%$$ $18! $1@8 #1!" #17!
8$$ $1$% $1$@ $1#% $1#A
!$$ $1$# $1$8 $1$! $1$"
A$$ $ $ $ $1$8
@$$ $ $ $ $
# $$$ $ $ $ $
表 DA淡紫拟青霉 DbLT 菌株孢子新鲜程度不同
对转化效率的影响
B&,CDAB"((44(<’#4$%#5($45($"/($$#/’5&/$4#56&’-#/
45(R+(/<0 #4/.#-#"%-9)*$’5&-/DbLT
孢子新鲜程度
&R/SMP>SMPLNMPP
转化子个数 +S9NP>/S;9N4Ph
"#$"PR/SMP# =#
保存 # 个月的孢子 &R/SMPP9[MU >/S
/NM;/N4L
#$A
新鲜孢子 aSMPL PR/SMP % !$@
化率"表 %#$
%5%586不同农杆菌对转化率的影响6用 (X作共
培养培养基"R\A1A#!:D,作筛选培养基!,& 浓度
%$$ 5<’;-=#!WY!#@ 的筛选浓度为 @$$ 5<’;-=#!
在相同的试验条件下进行遗传转化试验!试验选用
农杆菌菌株 )\,#$A 和 ,W-Y# 对淡紫拟青霉 %$Y?
菌株进行转化$ 结果表明% 不同农杆菌对淡紫拟青
霉转化率有明显的影响"表 8#$
表 EA不同农杆菌菌株对淡紫拟青霉转化率的影响
B&,CEAB"((44(<’#43-44(5(/’$’&-/$#41.7)+&="%-&9*
#/’5&/$4#56&’-#/45(R+(/<0
共培养菌株
’/Y3J04H[94H/N P49HNP
根癌农杆菌生长浓度
’/N3MN4S94H/N />2M*,9".$&+") "2D""$ #
$1# $1% $18 $1! $1A $1" $1?
,W-Y#和 %$Y?共培养转化子个
数 +LMNJ;TMS/>4S9NP>/S;9N4P
ZH4L ,W-Y# 9NU %$Y? 3/Y3J04JSMh
"#$" PR/SMP# =#
%## "$8 ?A@ # %!$ # ??@ # ?@A # 8!7
)\,#$A和 %$Y? 共培养转化子
个 数 4LM NJ;TMS />
4S9NP>/S;9N4PZH4L )\,#$A 9NU
%$Y? 3/Y3J04JSMh"#$" PR/SMP# =#
$ $ #@ A@! % $!% % !$@ # 8@A
%5%5!6乙酰丁香酮浓度不同对转化效率的影响6
用 (X作共培养培养基" R\A1A#!:D,作筛选培养
基! WY!#@ 的筛选浓度为 @$$ 5<’;-=#!没有加 ,&
的处理几乎没有抗 WY!#@ 的菌落出现!而当 ,& 浓
度为 %$$ ‘A$$ 5<’;-=#时!转化效率最高!当 ,& 浓
度为# $$$ 5<’;-=#时!转化效率降低"图 %#$
图 %6乙酰丁香酮浓度不同对淡紫拟
青霉 %$Y? 转化效率的影响
aH<5%6+LMM>M34/>93M4/PVSHN4S9NP>/S;94H/N >SM]JMN3V/>JM6+6$&+),#%$Y?
%5%5A6根癌农杆菌不同生长浓度对转化效率的影
响6使用不同浓度的根癌农杆菌同淡紫拟青霉 %$Y?
菌株共培养得到的转化效率明显不同$ % 个农杆菌
的菌株浓度 2D""$ f$1" 时转化效率最高!2D""$ f
$1A 时其次!2D""$ q$18 时转化率明显下降"图 8#$
%5%5"6共培养方法的筛选结果6## 共培养的酸碱
度(温度(时间不同对转化效率的影响6在相同的试
验条件下!共培养条件为使用 %$Y? 新鲜菌株孢子悬
浮液同 )\,#$A 进行共培养!(X作共培养培养基!
:D,作筛选培养基!,& 浓度 %$$ 5<’;-=#!WY!#@
的筛选浓度为 @$$ 5<’;-=#!结果显示!共培养培养
@7
6第 #$ 期 王曦茁等% 根癌农杆菌介导的淡紫拟青霉遗传转化体系的建立
图 86不同农杆菌菌株对淡紫拟青霉转化率的影响
aH<586+LMM>M34/>3/Y3J04H[94H/N P49HNP/N
4S9NP>/S;94H/N >SM]JMN3V
基的酸碱度(共培养时间和温度都对转化效率有影
响$ 将 )\,#$A 菌液和 %$Y? 孢子悬浮液涂于滤纸
上进行共培养时!酸碱度(共培养时间和温度分别为
R\A1A(%A d和?% L时转化效率最高$ 将 )\,#$A
菌液和 %$Y? 孢子悬浮液混合振荡共培养时!共培养
时间为 #" L!酸碱度和温度分别为 R\A1A 和 %A d
时转化效率最高"图 !!A#$
图 !6R\值对淡紫拟青霉 %$Y? 转化效率的影响
aH<5!6+LMM>M34/>R\[90JM/N 4S9NP>/S;94H/N >SM]JMN3V
/>JM6+6$&+),#P4S9HN %$Y?
图 A6温度对淡紫拟青霉 %$Y? 菌株转化效率的影响
aH<5A6+LMM>M34/>4M;RMS94JSM/N 4S9NP>/S;94H/N
>SM]JMN3V/>JM6+6$&+),#P4S9HN %$Y?
%# 共培养方式对转化效率的影响6共培养条
件为使用 %$Y? 新鲜菌株孢子悬浮液同 )\,#$A 进
行共培养!(X作共培养培养基" R\A1A#!:D,作筛
选培养基!,& 浓度 %$$ 5;/0’-=#!WY!#@ 的筛选浓
度为 @$$ 5<’;-=#$ 结果显示%共培养方式对转化
效率有影响!将 )\,#$A 菌液和 %$Y? 孢子悬浮液混
合振荡培养比将混合液直接涂在滤纸上转化效率
高"表 !#$
表 FA不同共培养方法对淡紫拟青霉 DbLT 转化效率的影响
B&,CFAB"((44(<’#4<#L<+*’+5(6(’"#3$#/’5&/$4#56&’-#/
45(R+(/<0 #4/.#-#"%-9)*DbLT
共培养方法
’/Y3J04JSM;M4L/U
转化子个数 +S9NP>/S;9N4Ph
"#$" PR/SMP# =#
振荡培养 &L9^M4LM;MUHJ; % !$@
涂于滤纸片上’/94/N >H04MSR9RMS # 8!8
DCEADbLT 转化子的鉴定
%585#6转化子对 WY!#@ 抗性的稳定性6含 WY!#@
@$$ 5<’;-=#的 :D,上!接种 ?% L 后 %$Y? 与 +%$Y?
的菌落生长情况% +%$Y? 在筛选培养基上扩展 % 3;
左右!%$Y? 被 WY!#@ 抑制$ WY!#@ 浓度保持不变继
续在 :D,筛选培养基上继代培养共 A 代$ 结果显
示% +%$Y? 对 WY!#@ 的抗性稳定遗传$
%585%6:’I检测6随机选取 #$$ 个 +%$Y? 菌落!提
取其 D*,!采用 :’I对转化子进行 +YD*,插入验
证!结果显示从 ?7 个抗性菌株中可以扩增出与从质
粒 RF(YW8’Y$:’(中扩增条带大小相同的片段!证明
WY!#@ 基因已整合到 %$Y? 转化子的基因组中& %# 个
没有条带!可能为假阳性!图 " 为随机选取的 #$ 个
+%$Y? 菌落 :’I结果$
图 "6淡紫拟青霉 %$Y? 转化子的 :’I检测
aH<5"6:’IHUMN4H>H394H/N />4S9NP>/S;9N4P/>JM6+6$&+,)#
泳道从左到右编号 # =#$ 分别为转化子 +%$Y?Y#!+%$Y?Y%!+%$Y
?Y8!+%$Y?Y!!+%$Y?YA!+%$Y?Y"!+%$Y?Y?!+%$Y?Y@!+%$Y?Y7!+%$Y?Y
#$& ’EC% 质粒 RF(YW8’Y$:’(& ’E=% 野生型 %$Y?& X% % ^T
D*,X9S^MS$
-HNM# 4/#$ HP+S9NP>/S;9N4P+%$Y?Y#!+%$Y?Y%!+%$Y?Y8!+%$Y?Y!!
+%$Y?YA! +%$Y?Y"! +%$Y?Y?! +%$Y?Y@! +%$Y?Y7 9NU +%$Y?Y#$&
’EC% R09P;HU RF(YW8’Y$:’(9PR/PH4H[M3/N4S/0% ’E =% JM
6+6$&+),#%$Y? 9PNM<94H[M3/N4S/0& X% %^T D*,X9S^MS5
77
林 业 科 学 !" 卷6
DCFA淡紫拟青霉 DbLT 菌株大规模转化和转化子的
生物学特性
按照优化后的操作程序!对淡紫拟青霉 %$Y? 菌
株进行大量遗传转化!转化效率为# $$$ ‘% !$$个’
#$ ="个分生孢子!从所得的突变体中!随机选出 #$$
个经单孢分离并继代筛选表明抗性稳定的突变体!
又经 :’I检测!证明在基因组中已经插入了 WY!#@
抗性基因$
挑选出 :’I检测为阳性的菌株!进行培养和观
察(记录各种表型特征"表 A#$ 产孢能力改变% 有
些突变体产孢量明显降低!如 +%$Y?Y#!+%$Y?Y%!+%$Y
?Y8& 菌落形态改变% 部分菌落出现扇变!如 +%$Y?Y
!!+%$Y?YA"表 A#$
表 GA野生型菌株与转化子的形态特征比较!
B&,CGAB"(6#5%"#*#9-<&*<"&5&<’(5-$’-<$#4>-*3’0%($’5&-/&/3’5&/$4#56&/’$
菌株
&4S9HN
菌落形态
’/0/NV;/SRL/0/产孢情况
&R/SJ094H/N
%$Y? 菌落浅紫色 -H+%$Y?Y# 菌落白色!生长缓慢 iLH4M3/0/NV! P0/Z+%$Y?Y% 菌落白色!生长缓慢 iLH4M3/0/NV! P0/Z+%$Y?Y8 菌落白色!生长迅速!菌丝很发达 iLH4M3/0/NV! S9RHU +%$Y?Y!
菌落浅紫色!菌落出现扇变!菌丝不发达 -H9N 3L9N;V3M0HJ;Z9PJNUMSUM[M0/RMU
产孢量正常 &R/SJ094H/N N/S;90
+%$Y?YA
菌落紫色!菌落出现扇变!菌丝不发达 :JSR0M3/0/NV!3/0/NHMP9RRM9S>9N 3L9NJNUMSUM[M0/RMU
产孢量较多 &R/SJ094H/N ;/SM
66!野生菌株% %$Y?& 转化子+%$Y?Y#!+%$Y?Y%!+%$Y?Y8!+%$Y?Y!!+%$Y?YA$ iH0UY4VRMP4S9HN% %$Y?& 4S9NP>/S;9N4P% +%$Y?Y#!+%$Y?Y%!+%$Y?Y8!+%$Y
?Y! 9NU +%$Y?YA5
86结论与讨论
影响转化效率的因素主要包括% 筛选标记与双
元表达载体"\9NH>"*$65!%$$%& W/UH/"*$65!%$$!#(
根癌农杆菌菌株 "XH3LHM0MP"*$65!%$$A#(乙酰丁香
酮浓度"XH3LHM0PM"*$65!%$$!#(农杆菌生长浓度(共
培养酸碱度 "+9^9L9S9"*$65! %$$!& +PJeH"*$65!
%$$8#(共培养温度"’9;R/V"*$65!%$$8#(共培养时
间"+9^9L9S9"*$65!%$$!#(共培养方式$ 本试验对以
上变量都进行了研究!并得到最适合淡紫拟青霉
%$Y? 遗传转化的条件$
本研究通过农杆菌介导转化淡紫拟青霉的条件
探索!获得淡紫拟青霉 %$Y? 菌株遗传转化最佳的参
数!包括筛选标记(双元表达载体(根癌农杆菌菌株(
根癌农杆菌浓度(淡紫拟青霉分生孢子的新鲜程度(
,& 浓度(共培养条件等$ 采用这种遗传转化体系!
%$Y? 菌株的转化效率达到# $$$ ‘% !$$个转化子’
#$ ="分生孢子!比以前报道的对其他真菌的转化效
率更高"U/PIMHP"*$65!%$$!& -H;9"*$65!%$$"& a9N<
"*$65!%$$"& 赵培静等!%$$?#$ 该转化体系的建立!
为淡紫拟青霉功能基因组学!尤其是对线虫的致病
机制研究奠定了良好的基础$
虽然农杆菌介导的遗传转化已经成功应用于一
些真菌"XH3LHM0MP"*$65!%$$A#!但转化效率在不同
真菌中差距很大"DMWS//4"*$65!#77@#$ 即使对同
一种真菌!筛选标记对抗性菌株的比例也有很大的
影响$ 赵培静等 "%$$?#建立的淡紫拟青霉的遗传
转化体系是以膦丝菌素乙酸转移酶" T9S#基因作为
选择标记!A?_的抗性转化子 :’I检测为阳性& 而
本研究是以大肠杆菌转座子 +N7$8 编码的氨基糖苷
磷酸转移酶"WY!#@#基因作为筛选标记!随机选取
#$$ 个转化子进行 :’I验证!?7 _抗性转化子的
:’I为阳性!这可能是由于真菌对抗生素的耐药性
不同!真菌在培养几代后!就会出现不同的耐药性!
因而会出现不同数量的假阳性菌株$ 试验证明!WY
!#@ 作为选择标记适合淡紫拟青霉的遗传转化$
\9NH>等"%$$%#在转化 F,+6,#8-G+)"#时!也出现了
类似的结果!当以潮霉素磷酸转移酶" LVRL/PRL/4S9NP>MS9PMLRL#基因作为筛选标记!全部抗
性转化子的 :’I均为阳性!而以腐草霉素为选择标
记进行转化!抗性克隆中只有 ?8_为 :’I阳性!这
也许也是由于 F,+6,#8-G+)"#对潮霉素和腐草霉素
的耐药性存在差异造成的$
表达载体的不同会对转化效率造成很大的影
响!据分析这可能是由于质粒的结构和启动子的差
异造成的!质粒的结构会影响到农杆菌介导质粒进
入真菌细胞的过程"’9;R/V"*$65!%$$8#!而启动子
的不同对外源基因的调控可能会出现不同的效果!
抗性基因的表达是影响其转化效果的重要因素$ 据
研究试验目的不同选择合适的启动子是成功进行基
因表达的关键因素之一$ 以淡紫拟青霉为例!赵培
静等"%$$?#以 R’,XF(,#8$# 为基本骨架构建的双
$$#
6第 #$ 期 王曦茁等% 根癌农杆菌介导的淡紫拟青霉遗传转化体系的建立
元表达载体 R+F,I对淡紫拟青霉的转化效率仅为
@$ ‘%$$ 个’#$ ="孢子$ R’,XF(,#8$# 质粒多用于
植物的遗传转化!真菌跟植物的结构存在很大的差
异& 而本试验使用的表达载体来源于曾成功用于炭
疽菌和稻瘟菌的遗传转化"&9^9双元表达载体 RF(YW8’!这个载体在转化稻瘟菌时
获得了 ?$$ ‘# %$$个转化子’#$ ="个孢子的转化效
率!这样的转化效率在世界上是比较高的$ 本研究
通过置换 RF(YW8’中的抗性基因!构建了适合淡紫
拟青霉遗传转化的双元表达载体 RF(YW8’Y,:\!载
体的转化效率为# $$$ ‘% !$$个’#$ ="孢子$ 试验
证明!以 RF(YW8’为基本骨架构建的表达载体更适
合淡紫拟青霉的遗传转化$ \9NH>等"%$$%#年在转
化 FM8-G+)"#时!也出现过类似的试验结果% 利用双
元载体 RbIA?A$ 比利用 RFW<\<转化效率高出 %
倍!用 RFW?Y# 却没有得到转化子$
各种不同的农杆菌菌株都被用于真菌的遗传转
化!每一种农杆菌菌株对真菌的转化效率都是不同
的& 另外!每一种农杆菌对同一种真菌的不同株系
的转 化 效 率 也 是 不 同 的 " ’/[MS4"*$65! %$$#&
aH4K通过试验比较!选取了对 %$Y? 侵染能力最强的
)\,#$A 菌株进行淡紫拟青霉的遗传转化$
表面上看!菌液浓度越大!转化的机会应该越
大!所以转化率应该高些!但笔者通过试验证实!事
实并非如此$ 其原因可能是因为菌液浓度过大造成
共培养后杀除农杆菌比较困难(农杆菌与淡紫拟青
霉抢占营养而造成淡紫拟青霉形成菌落受到阻碍的
缘故$ 通过试验比较!认为 2D""$值在 $1A ‘$1" 范
围内为农杆菌的最佳侵染浓度$
采用 ! 天以内的新鲜淡紫拟青霉孢子有助于转
化效率的提高$ 另外!曾有试验证明!使用老的皮炎
芽生菌 "36$#*-90&"#?"%9$*+*+?+##菌株进行转化!会
降低转化效率"&J0H[9N "*$65!%$$%#$
试验表明添加 ,& 对淡紫拟青霉 %$Y? 的遗传转
化是必须的"图 %#$ 当 ,& 浓度达到 %$$ 5<’;-=#
时!会得到很高的转化效率$ XH3LHM0PM等"%$$!#在
研究时发现!2#:"%5+6,#$C$9-%+的遗传转化过程依
赖 .(I区的表达!.(I区基因表达的蛋白质 .HS,和
.HSW在识别像乙酰丁香酮类的酚类信号物质后表
现出活性!然后激活整个 +YD*,转化机制$
共培养条件是否合适!对 ,+X+转化的成功与
否有着举足轻重的影响!在一定程度上决定着转化
效率的高低!共培养的条件主要包括% 共培养酸碱
度(共培养温度(共培养时间(共培养方式等$ 本试
验表明%共培养最适酸碱度为 R\A1A!其原因可能
是微酸性条件有利于激活农杆菌的侵染毒性(促进
淡紫拟青霉菌丝生长& 最适温度是 %A d& 最适时
间是 ?% L!时间过长可能会增加多拷贝插入的机会$
利用上述转化体系进行大规模的淡紫拟青霉转
化操作$ 在所得的突变体中!随机选出 #$$ 个进行
系统分析!获得了 A 个菌落形态改变的突变体!其中
8 个为产孢量减少突变体!% 个为菌落形态的突变
体$ 这些突变体的获得!有助于克隆淡紫拟青霉致
病关键阶段的相关基因和开展分子调控机制的研
究!为揭示淡紫拟青霉与植物寄生线虫相互作用的
分子机制(培育高效的生物防治品种策略奠定基础$
参 考 文 献
方卫国! 张永军! 杨星勇! 等5%$$%5根癌农杆菌介导真菌遗传转化
的研究进展5中国生物工程杂志! %%"A# % !$ =!!5
高学彪! 邓穗儿! 周慧娟! 等5#77@5淡紫拟青霉 X’i,(@ 菌株对南
方根结线虫的奇生和防治作用5中国生物防治! ! " ! # % #"8
=#""5
李6芳! 张绍升! 陈家骅5#77@5淡紫拟青霉对烟草根结线虫的防
治效果5福建农业大学学报! %?"%# % #7" =#775
王关林! 方宏筠5#77@5植物基因工程原理与技术5北京% 科学出版
社
赵培静! 任文彬! 缪承杜! 等5%$$?5根癌农杆菌介导的淡紫拟青霉
遗传转化5中国植物病理学会 %$$? 年学术年会论文集5
’LMN m! &4/NMX! &3L09MS’! "*$65%$$$5,>SJH4HN;M4L/U >/S M>H3HMN4 25%-8$&*"%+,9Y;MUH94MU 4S9NP>/S;94H/N />
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RS/UJ3HN< T9PHUH/;V3M4MV0:’-6-9$ #,86$*"%+*+,95’JSSWMNM4!
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林 业 科 学 !" 卷6
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1%0:’-)"&*%+$ :$%$#+*+&$ JPHN<25%-8$&*"%+,9 *,9".$&+")#M FH/4M3LN/0
FH/RS/3MPP)N&9^9309^M0%R 9NU 3903HJ;PH1-6"*-*%+&’,96$5")$%+,95)J^9SV/4H3’M0! ?"## % #$% =###5
&J0H[9N +D! I//NMV:G! E0MHN F&5%$$%525%-8$&*"%+,9*,9".$&+")#
HN4MMSD*,HN4/PHN<0M3LS/;/P/;90PH4MP/>UH;/SRLH3
>JNS/; ;J04HNJ30M94MVM9P45
)J^9SV/4’M0! #""# % @7A =7$A5
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;MUH94MU 4S9NP>/S;94H/N 9P9 4//0>/SS9NU/; ;J49
1-6"*-*%+&’,9*%+.-6+5GWMN :09N4:94L/0! ?$"%# % 78 =7"5
+PJeHW! aJeH&! aJeHL9S9*! "*$65%$$8525%-8$&*"%+,9*,9".$&+")#Y
;MUH94MU 4S9NP>/S;94H/N >/SS9NU/; HNPMS4H/N90;J491-6"*-*%+&’,96$5")$%+,95GWMN :09N4:94L/0! "7"!# % %8$ =%875
.He9V9EJ;9SH*! &Je94L9;;9:! &9[H4L4HW! "*$65%$$%5)>M34/>TH/Y
3/N4S/09S//4^ N/4
NM;94/UMH"6-+?-50)"+)&-5)+*$5,349,#!"8# % #A7 =#"%5
!责任编辑6朱乾坤"
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