全 文 ：第 !" 卷 第 #$ 期
% $ # # 年 #$ 月
林 业 科 学
&’()*+(, &(-.,) &(*(’,)
./01!"!*/1#$
2345!% $ # #
花楸树体细胞胚与合子胚的发生发育!
杨6玲6沈海龙
"东北林业大学林学院 林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室6哈尔滨 #9$$!$$
摘6要!6利用花楸树人工控制授粉后的未成熟合子胚进行体细胞胚的诱导培养!通过石蜡切片%扫描电镜和透射
电镜对合子胚和体细胞胚的发生发育过程进行组织%细胞观察& 结果表明’#$体细胞胚发生进程与合子胚相似!均
经历了球形期%心形期%鱼雷形期!最终发育成成熟胚# %$直接发生和间接发生在愈伤组织表面的体细胞胚均为单
细胞起源!间接发生在愈伤组织内部的体细胞胚存在单细胞起源!同时还存在可能的多细胞起源# 7$子叶和愈伤
组织表面发生的体细胞胚在发育早期均具明显的胚柄!鱼雷形胚期胚柄退化# !$愈伤组织内部发生的体细胞胚没
有胚柄# 9$与合子不同!胚性细胞的第 # 次分裂为均等分裂# 8$多细胞原胚周围降解的细胞具有细胞程序性死亡
的形态特征&
关键词’6花楸树# 体细胞胚发生# 合子胚发生# 胚胎发育
中图分类号! &"#:1!"% &"#:1!8666文献标识码!,666文章编号!#$$# A"!::"%$####$ A$$87 A$"
收稿日期’%$#$ A#% A%"# 修回日期’%$## A$7 A$"&
基金项目’黑龙江省教育厅科学技术研究指导项目"##997$7!$ # 中央高校基本科研业务费专项资金"H-#$G,$!$ # 国家*十一五+林业科
技支撑项目"%$$8G,H$7,$!$ &
! 沈海龙为通讯作者&
39$,&,4%:#&#’(8%/$,&,4%:#&S’7*/$%4#$%,’/,’!,+#$%:#’(‘94,$%:
M+2-9,4*’*/%/,07+*8")’+,"$),$0.0)/)
OIFE-DFE6&?NF TID0/FE
"8%(91:#$1’#$(#;"#$%&’J$%%R%2%’-.CG=$#5%G%2’12A D-#’%./2#*#+(#;I-2-&’$(#;,./##*#;"#$%&’$(! F#$’/%1&’"#$%&’$(42-5%$&-’(6M1$:-2 #9$$!$$
=2/$-#:$’6&/@I4D3N@YCW/V" &)$ MNCNDFUP3NU XC/@W/PFE W^E/4D3N@YCW/V"n)$ /X,#$:0&=#/01&/12%2&-&/Y4IDFNU
IX4NCIC4DXD3DI0K/0DFI4D/F5+?NUN[N0/K@NF4I0KC/3NVV/Xn)IFU &)MIV/YVNC[NU MD4? KICIXDF VN34D/F! V3IFFDFEN0N34C/F
@D3C/V3/KWIFU 4CIFV@DVVD/F N0N34C/F @D3C/V3/KW5+?NCNVP04VV?/MNU 4?I4’ # $ &/@I4D3IFU W^E/4D3N@YCW/ENFNVDV
PFUNCMNF4IVD@D0IC3/PCVN! YWKIVVDFE4?C/PE? E0/YP0IC! ?NIC4‘V?IKNU! 4/CKNU/‘V?IKNU V4IENVIFU 4?NF CNI3?NU @I4PCN
V4IEN# %$ &)UNCD[NU XC/@n)3/4W0NU/FV/CDEDFI4NU UDCN340WXC/@VDFE0NNKDUNC@DV3N0/CDFUDCN340W/33PCCNU XC/@VDFE0N
VPCXI3N3N0/CDFFNC3N0/X4?NN@YCW/ENFD33I0PV! YP4V/@N/X4?NDFUDCN340W/33PCCNU &)MIVK/VVDY0WUN[N0/KNU XC/@
@P04D‘3N0IEECNEI4NVDFVDUN4?NN@YCW/ENFD33I0PV# 7$ &)CNENFNCI4NU XC/@VDFE0N3N0V/Xn)3/4W0NU/F NKDUNC@I0IFU
N@YCW/ENFD33I0PVVPCXI3N?IU /Y[D/PVVPVKNFV/CVUPCDFE4?NNIC0WUN[N0/K@NF4I0V4IEN! YP44?NWUDVIKKNICNU UPCDFE
4/CKNU/‘V?IKNU V4IEN# !$ +?NCNMNCNF/VPVKNFV/CV/YVNC[NU DF &)CNENFNCI4NU DFVDUNN@YCW/ENFD33I0PV59$ +?NXDCV4
UD[DVD/F /X&)N@YCW/ENFD33N0VMIVNlPI0WVK0D4! M?D3? MIVUDXNCNF4XC/@4?I4/Xn)# 8 $ HNECIUI4D[N3N0VIC/PFU
@P04D3N0P0ICV/@I4D3KCNN@YCW/VUDVK0IWNU VD@D0IC@/CK?/0/ED3I0KI4NCFV/XKC/ECI@@NU 3N0UNI4?5
>*9 ?,-(/’6,#$:0&=#/01&/12%2&-&# V/@I4D3N@YCW/ENFNVDV# W^E/4D3N@YCW/ENFNVDV# N@YCW/UN[N0/K@NF4
66花楸树",#$:0&=#/01&/12%2&-&$为我国寒温性针
叶林特有的伴生阔叶树种& 它集观赏%药用%食用%
饲用和材用等多种价值于一身!具有很好的开发利
用前景"郑万钧!#;:9# 周德本!#;:8$& 现有的花楸
树资源主要是天然野生资源!多零散分布于深山老
林和一些自然保护区中& 花楸树的种子在自然条件
下出苗率很低!野生实生苗极少见# 同时花楸树的
引种驯化%人工栽培技术尚不成熟& 近几年国内学
者对花楸树的人工培育相关原理与技术进行了一些
研究!如种子休眠解除 "沈海龙等! %$$8# 杨玲等!
%$$:# %$$;I# %$$;Y$%扦插繁殖"苏喜廷等! %$$9#
郑健等! %$$;I$%野生资源分布和更新 "郑健等!
%$$"# 许建伟等!%$#$I# %$#$Y# 张秀亮等!%$#$$!
以及果实和种子的形态性状"范丽颖等! %$$:# 郑
健等! %$$;Y# 杨玲等! %$$;I$%遗传多样性和种源
变异"郑健等! %$$:# 范丽颖等! %$$:$等!为花楸树
林 业 科 学 !" 卷6
人工栽培和天然种群扩展等奠定了基础& 但对花楸
树离体形态发生的研究报道较少且不系统"王爱芝
等! %$$;# 杨玲等!%$#$$&
由于体细胞胚发生重演了合子胚形态发生的进
程!因此了解合子胚的形态发生对确定体细胞胚诱
导和培养条件!了解体细胞胚发生和细胞分化机制
具有指导作用& 反之!体细胞胚发生体系的建立和
调控又可为合子胚发育机制和生殖生物学的研究提
供信息资料& % 种胚胎发生体系在形态学%生理学%
生物化学%细胞学和分子生物学方面的比较研究已
在多种植物中有报道!如海岸松 "@-20&=-21&’%$$
"J/CUW%’1*5! %$$7$%泰国象腿蕉 "<2&%’%&0=%$:0G$
" fI4?NM %’ 1*5! %$$7 $% 水 曲 柳 " "$1E-20&
G12A&/0$-.1$"孔东梅等! %$$8$%向日葵"M%*-12’/0&
12200&$ "QI@YCDFD%’1*5! %$$8 $%玉米 "Z%1 G1(&$
"n?IFE%’1*5! %$$% $%仙客来 ")(.*1G%2 =%$&-.0G$
" &3?@DU4%’1*5! %$$8 $% 凤 榴 " 3..1 &%*#K-121 $
"SNV3IU/C%’1*5! %$$:$等!但有关花楸树合子胚和
体细胞胚发生的比较研究尚未见报道& 本文利用石
蜡切片技术对花楸树体细胞胚与合子胚的胚胎发生
过程进行了组织学和细胞学上的比对分析!并利用
环境扫描电子显微镜和透射电子显微镜技术对花楸
树体细胞胚的细胞起源进行了超微形态和超微结构
的观察& 研究结果可为花楸树合子胚的生殖生物学
研究奠定基础!同时可为花楸树体细胞胚培养条件
的改善和人工种子的制备提供参考&
#6材料与方法
@F@A试验材料
用于细胞观察和体细胞胚诱导的合子胚均采自
黑龙江省森林植物园西区人工栽培的 8 c" 年生发
育良好的花楸树母树&
@FCA合子胚发生的细胞观察
于 %$$; 年 9 月 %: 日%%; 日对花楸树母树实施
人工控制授粉& 具体方法’对开花前 # c% 天的幼蕾
进行破蕾%去雄%人工异花授粉和套袋& 所套的袋子
一面是牛皮纸"透气$!一面是透明聚乙烯材料"透
光$& 套袋后标记去雄日期和时间& 从授粉的当天
开始!分别取授粉 $19! #! %! !! :! #8! %!! 7%! !:!
98! "9 ?# !! 9! 8! "! #%! #!! %#! 7$! !9! 8$! "9!
;$! #$9 天的花托用 Q5,5,5固定液固定!每次取 !$
个花托固定!分成 % 份于 9 d冰箱中密封保存& 用
爱氏苏木精整体染法染色!常规石蜡制片法制片!切
片厚度 : c#$ $@!在 2-SOfSq& 的 GL9# 系统显微
镜下观察并照相&
@FEA体细胞胚的诱导培养和细胞观察
取授粉后 7$ 天的幼果于流水下冲洗干净后经
"$>乙醇消毒 # @DF!7>的 *I’02浸泡 #9 @DF!无菌
水冲洗干净& 在超净工作台上挤碎幼果!挑出胚珠!
切破子叶端珠被!挤出合子胚!按照胚的根轴面与培
养基表面平行的方式接种到 f& 固体培养基上诱导
体细胞胚& 培养基中附加 #1$ @E)-A# *,,! $1#
@E)-A#8‘G,!9$$ @E)-A#水解酪蛋白!!$ E)-A#蔗
糖和 $18>琼脂粉& 高压灭菌前将 KT值调至 91:!
于 %7 c%9 d的培养室内暗培养& 初代培养 ! 周后
将培养物转至不含生长调节剂的相同培养基上继代
培养& 分别从初代培养第 # 天和继代培养第 # 天
起!每隔 " 天取少量培养物!同前法固定%染色%切
片%镜检!观察愈伤组织的形成及体细胞胚的发生&
@FGA体细胞胚的超微形态观察
将不同培养时期的新鲜培养物用镊子从培养皿
中取出!用去离子水将培养物彻底清洗!直接在低真
空环境扫描电子显微镜"]PIF4I%$$ 型!美国 Q)(公
司$中%加速电压 #91$ Z.下观察并照相&
@FNA体细胞胚的超微结构观察
将不同培养时期的培养物切割成 # @@7 的样
品组织块!室温下用含有 %> "Ka5$ 多聚甲醛和
%19> "5a5$ 戊二醛的 $1# @/0)-A# 磷酸缓冲液
"KT"17$固定 % ?& 固定后的样品经过梯度浓度的
乙醇脱水%环氧树脂包埋%超薄切片机上切片并收集
后!将切片在 9$>乙醇配制的 %> "Ka5$乙酸双氧
铀中染色 #$ @DF!在 $1!>"Ka5$柠檬酸铅中染色 #$
@DF!然后用去离子水彻底清洗!利用美国 Q)(公司
的 +’*,(h% 型透射式电子显微镜观察并照相&
%6结果与分析
CF@A合子胚发生发育的组织细胞观察
观察表明!花楸树胚珠为倒生型胚珠!珠心和珠
被的纵轴与珠柄垂直& 具 % 层珠被(((外珠被与内
珠被& 内外珠被的原基分别在珠心的基部产生& 内
外珠被均参与形成珠孔& 属厚珠心型胚珠!存在周
缘珠心组织& 胚囊属蓼型胚囊!在珠孔端具卵器
"由 % 个助细胞和 # 个卵细胞组成$!合子端具 7 个
反足细胞!胚囊中央为含 % 个极核的中央细胞
"图 #‘#$&传粉受精后!胚乳的发育早于胚的发育&
受精后的初生胚乳核分裂先形成具多核仁的游离核
"图 #‘%$!分裂达到一定程度时!胚的发育才开始&
合子分裂形成一大一小 % 个细胞!其中靠近合点端
的顶细胞体积小!胞质浓厚!靠近珠孔端的基细胞具
大液泡!此时期为 % A细胞原胚& % A细胞原胚进一
!8
6第 #$ 期 杨6玲等’ 花楸树体细胞胚与合子胚的发生发育
步分裂!形成 ! A细胞原胚& 随着合点端原胚细胞
数目增多!开始出现器官分化& 原胚形成后的发育
很快!授粉后 7% ? 可发育成早期球形胚!授粉后 #%
天可发育成心形胚!授粉后 %# 天可发育成鱼雷形
胚!授粉后 7$ 天即可发育至子叶形胚!最后发育成
充满胚囊腔的成熟胚"图 #‘7 c#$$& 早期原胚阶段
具有发育明显的胚柄"图 #‘9$!至鱼雷形胚阶段胚
柄消失"图 #‘:$& 球形胚末期时!胚乳细胞开始解
体"图 #‘8$!当胚胎发育到心形胚时!胚体周围形成
了空腔"图 #‘"$!推测是胚乳为胚胎发育提供营养
而水解成小分子物质所致& 随着胚的形态分化和体
积增大!胚乳细胞的生活力下降!最后胚耗尽胚乳细
胞的内含物并充满整个胚囊腔"图 #‘: c#$$&
CFCA体细胞胚发生发育的组织$细胞观察
%1%1#6体细胞胚的发生途径6在诱导培养基上初
代培养 " 天时!可见到未成熟合子胚的子叶张开&
初代培养 #$ 天时!可见子叶边缘出现少量愈伤组
织!同时子叶表面有细胞凹陷或细胞突起产生& 继
续培养发现!体细胞胚可以从合子胚的子叶近轴端
上表面直接发生"图 #‘## c#!$& 在初代培养的 7$
天内!即可分化形成子叶形体细胞胚& 随着培养时
间延长!部分外植体表面逐渐愈伤化!体细胞胚也可
经愈伤组织细胞的再分化从愈伤组织表面或内部间
接发生"图 #‘#9 c#"$& 花楸树的体细胞胚具有胚
柄!这种顶 A基轴式的极性结构由 7 种类型的细胞
构成’顶端是与胚胎接触的胚柄细胞!另外一端是胚
柄的基细胞!其间是胚柄中间细胞"图 #‘#:$&
%1%1%6体细胞胚的形态发生过程6观察表明!花楸
树的体细胞胚发育过程像合子胚一样!经历了球形
胚%心形胚%鱼雷形胚到分化出子叶%胚根及原维管
束的成熟胚的形态发生过程 "图 #‘#; c%%$& 体细
胞胚在球形胚时期%心形胚时期均具有明显的胚柄
"图 #‘#;!%$$!鱼雷形胚时期胚柄退化!仅见部分残
留"图 #‘#!!%#$& 体细胞胚的初生维管束呈明显的
*O+字形"图 #‘%#!%%$& 体细胞胚与原组织的连接
松散!且没有维管组织的联系!具有生理隔离性!极
易自行脱落"图 #‘%#!%%$&
%1%176体细胞胚的细胞起源 #$间接发生途径的细
胞起源6在花楸树体细胞胚诱导培养中!外植体细
胞经过脱分化产生 % 种愈伤组织’一种为淡黄或黄
色!结构松散!表面不光滑具有球形颗粒状突起的胚
性愈伤组织!可再分化出体细胞胚# 一种为白色或
淡黄色%质地紧密的非胚性愈伤组织!这种愈伤组织
不分化或再分化出不定芽或不定根&
观察表明’胚性愈伤组织细胞染色较深!体积较
小!壁厚!胞质浓厚!核大!核仁明显 "图 %‘# c9$&
非胚性愈伤组织的细胞染色较浅!体积较大!形状不
规则!胞质较稀薄!核小!细胞排列无序!没有明显
的%较大的细胞间空隙"图 %‘8$& 体细胞胚发生于
胚性愈伤组织的表面或内部"图 #‘#8 c#"# 图 %‘#$&
发生于组织内部的体细胞胚存在单细胞起源途径
"图 %‘%$& 胚性细胞先分裂产生 % 个细胞"图 %‘%$!
进而分裂形成胚性细胞团"图 %‘7$!其细胞排列规
则!细胞核大!核仁明显 "图 %‘%!7$& 此外!有的愈
伤组织内部的胚性细胞团是由多个体积较小%胞质
浓厚的胚性细胞和多个体积较大%胞质稀薄的非胚
性细胞共同组成!其形态类似针叶树多细胞起源的
胚性细胞群!因此推测花楸树体细胞胚发生可能还
存在多细胞起源途径"图 %‘!$& 胚性细胞团的周围
分布着大量体积较大%胞质稀薄%无明显细胞核的薄
壁细胞"图 %‘# c9$!有的甚至形成较大的组织内空
腔"图 %‘7!!$& 进一步观察发现!这些细胞中!有的
胞内充满颗粒状自溶物!有的胞内残留少量自溶物!
有的甚至成为细胞壁包围的空腔"图 %‘"$!推测胚
性细胞团周围的组织内空腔是细胞程序性死亡
"S’H$后形成的& 以后整个胚性细胞团形成体细
胞胚!以一圈排列整齐%具明显厚壁的细胞形成界
限与周围细胞隔开 "图 %‘9$ & 这种愈伤组织内部
发生的体细胞胚!在发育过程中未见到明显的胚
柄结构!但通常以周围或下端较大区域"由一些大
而长形的细胞组成$与愈伤组织相连"图 %‘!!9$ !
胚性细胞团中细胞的形状和位置不同!可能预示
着其功能和在进一步分化中发展方向的不同& 发
生于愈伤组织表面的体细胞胚为单细胞起源
"图 %‘: c#%$ &胚性细胞横向分裂形成 # 个顶细胞
和 # 个基细胞!顶细胞再次横向分裂!产生 % 个 #
列的细胞"图 %‘;$ !以后胚性细胞继续分裂形成多
细胞原胚 "图 %‘#$ $ %球形胚 "图 %‘##!#% $ & 体细
胞胚发育过程中存在明显的胚柄状结构"图 %‘; c
#%$ &
%$直接发生途径的细胞起源6合子胚的外植
体表皮细胞和表皮下几层细胞均可分化出胚性细胞
"图 #‘#%$& 胚性细胞分裂产生 % 个细胞"图 %‘#7$!
进而分裂形成多细胞原胚"图 %‘#!$& 这种直接发
生的体细胞胚为单细胞起源!从单个胚性细胞到多
细胞原胚始终被厚壁包围!与周围细胞形成明显的
界限!具有相对的独立性"图 %‘#7$& 原胚时期以后
体细胞胚的形态发生过程同 %1%1% 所述&
98
林 业 科 学 !" 卷6
图 #6花楸树合子胚和体细胞胚发生发育的组织%细胞观察
QDE5#6’W4/0/ED3I0IFU ?DV4/0/ED3I0DF[NV4DEI4D/F /X^WE/4D3N@YCW/ENFNVDVIFU V/@I4D3N@YCW/ENFNVDV/X,#$:0&=#/01&/12%2&-&
#1: 核胚囊"I3’ 反足细胞# KF’ 极核# NI’ 卵器$ # %1胚乳游离核# 71合子# !1! A细胞原胚# 91早期原胚具发达的胚柄"V3’ 胚柄细胞#
K@’ 原胚$ # 81球形合子胚# "1心形合子胚# :1鱼雷形合子胚# ;1子叶形合子胚# #$1充满胚囊腔的成熟合子胚"30’ 子叶# C3’ 胚根# ?C’
胚轴# K4’ 胚芽$ # ## A#!1子叶表面直接发生的体细胞胚"VN’ 体细胞胚# N3’ 胚性细胞$ # #91外植体形成愈伤组织团# #81愈伤组织表面
形成的体细胞胚# #"1愈伤组织内部的体细胞胚# #:1具胚柄的早期原胚"33’ 与胚胎接触的胚柄细胞# D’ 胚柄中间细胞# Y’ 胚柄的基细
胞# 3I’ 愈伤组织$ # #;1球形体细胞胚"VN’体细胞胚# V3’胚柄细胞$ # %$1心形体细胞胚# %#1鱼雷形体细胞胚" K[Y’ 初生维管束$ # %%1
子叶形体细胞胚"30’ 子叶# C3’ 胚根# K4’ 胚芽$5
#1:‘FP30NPVN@YCW/VI3"I3’ ,F4DK/UI03N0# KF’ S/0ICFP30NPV# NI’ )EEIKKICI4PV$ # %1QCNNNFU/VKNC@ FP30NPV# 71nWE/4N# !1!‘3N0
KC/N@YCW/# 91SC/N@YCW/MD4? UN[N0/KNU VPVKNFV/C"V3’ &PVKNFV/C3N0# K@’ SC/N@YCW/$ # 81h0/YP0IC^WE/4D3N@YCW/# "1TNIC4‘V?IKNU W^E/4D3
N@YCW/# :1+/CKNU/‘V?IKNU W^E/4D3N@YCW/# ;1’/4W0NU/FICW W^E/4D3N@YCW/# #$1nWE/4D3N@YCW/4?I4MIVXP0WXD0NU 4?NN@YCW/3I[D4W"30’
’/4W0NU/F# C3’ kIUD30N# ?C’ TWK/3/4W0# K4’ S0IF4P0N$ # ## A#!1HDCN34V/@I4D3N@YCW/ENFNVDV/F 4?NVPCXI3N/X3/4W0NU/F "VN’&/@I4D3N@YCW/# N3’
)@YCW/ENFD33N0V$ # #91’I0PVX/C@NU XC/@N_K0IF4# #81&/@I4D3N@YCW/ENFNVDV/F 4?NVPCXI3N/XN@YCW/ENFD33I0PV# #"1&/@I4D3N@YCW/ENFNVDV
DFVDUNN@YCW/ENFD33I0PV# #:1)IC0WKC/N@YCW/MD4? VPVKNFV/C"33’ &PVKNFV/C3N0V3/FFN34NU MD4? V/@I4D3N@YCW/# D’ (F4NC@NUDI4N3N0V/X
VPVKNFV/C# Y’ GIVI03N0/XVPVKNFV/C# 3I’ ’I0PV$ # #;1h0/YP0ICV/@I4D3N@YCW/"VN’ &/@I4D3N@YCW/# V3’ &PVKNFV/C3N0$ # %$1TNIC4‘V?IKNU
V/@I4D3N@YCW/# %#1+/CKNU/‘V?IKNU V/@I4D3N@YCW/" K[Y’ SCD@ICW[IV3P0ICYPFU0N$ # %%1’/4W0NU/FICWV/@I4D3N@YCW/"30’ ’/4W0NU/F# C3’
kIUD30N# K4’ S0IF4P0N$5
88
6第 #$ 期 杨6玲等’ 花楸树体细胞胚与合子胚的发生发育
图 %6花楸树体细胞胚发生的细胞观察
QDE5%6’W4/0/ED3I0IFU ?DV4/0/ED3I0DF[NV4DEI4D/F /XV/@I4D3N@YCW/ENFNVDV/X,#$:0&=#/01&/12%2&-&
N3’胚性细胞# K3’ 薄壁细胞# 34’ 空腔# 3I’ 愈伤组织# M’ 细胞壁# F’ 细胞核# FP’ 核仁# KY’ 蛋白体# V’ 淀粉粒# DY’ 油脂体# U’ 高尔基体#
[’ 空泡# @’ 线粒体# N’ 白色体5
#1愈伤组织表面和内部的胚性细胞团# %1愈伤组织内部胚性细胞!箭头指胚性细胞分裂后形成 % 个细胞# 71胚性细胞团!箭头指具较大细胞
核的胚性细胞# !1可能起源于多细胞的胚性细胞团!箭头指连接胚性细胞团与愈伤组织的细胞# 91体细胞胚!白色箭头指厚壁细胞!黑色箭头
指体细胞胚的附加结构# 81非胚性愈伤组织# "1胚性细胞周围发生降解的细胞!箭头指残留自溶物的细胞# :1愈伤组织表面的单个胚性细
胞# ;1胚性细胞横向分裂形成顶细胞"黑色箭头$和基细胞"白色箭头$ # #$1愈伤组织表面的多细胞原胚!黑色箭头指胚性细胞团!白色箭头
指胚柄# ## A#%1具胚柄的球形胚!箭头指胚柄# #71合子胚子叶内部均等分裂的胚性细胞# #!1合子胚子叶内部产生的多细胞原胚# #9 A#:1
合子胚子叶表皮细胞体细胞胚发生过程的扫描电镜照片"#91诱导培养 #$ 天的合子胚子叶表皮细胞!黑色箭头指发生平周分裂后形成的 % 个
细胞!白色箭头指形成的多细胞突起# #81诱导培养 #$ 天时形成的多细胞原胚# #"1心形体细胞胚!箭头指发达的胚柄# #:1愈伤组织表面的
胚性细胞!箭头指发达的胚柄$ # #; A%81胚性细胞与非胚性细胞的透射电镜照片0#;1培养前的合子胚子叶细胞# %$1诱导培养 #$ 天时的胚
性细胞!箭头指细胞间隙变大# %#! %%1诱导培养 #$ 天时解体的细胞"%#1箭头指细胞核中核仁发生了染色质凝缩!趋近核膜# %%1黑色箭头指
细胞质浓缩!白色箭头指胞质内出现球状物$ # %7 A%81诱导培养 7$ 天时的球形胚!细胞内有丰富的淀粉粒和细胞器15
N3’ )@YCW/ENFD33N0# K3’ SICNF3?W@I3N0# 34’ ’I[D4W# 3I’ ’I0PV# M’ ’N0MI0# F’ *P30NPV# FP’ *P30N/0PV# KY’ SC/4NDF Y/UDNV# V’ &4IC3? ECIDFV#
DY’ -DKDU Y/UDNV# U’ hI0EDIKKICI4PV# [’ .I3P/0N# @’ fD4/3?/FUCDI# N’ )4D/K0IV45
"8
林 业 科 学 !" 卷6
#1)@YCW/ENFD33N0IEECNEI4NV")’,$ /F NKDUNC@I0/X3I0PVIFU DFVDUN3I0PV# %1)@YCW/ENFD33N0VDFVDUN3I0PV! F/4N4?NYD3N0P0ICKC/N@YCW/
"ICC/MV$ # 71)’,! F/4N4?N0ICENFP30NPVDFVDUN3N0V"ICC/MV$ # !1SC/N@YCW/X/C@NU KC/YIY0WXC/@DF4NCFI0@P04D‘3N0IEECNEI4NV! F/4N4?N3N0V
3/FFN34KC/N@YCW/IFU 3I0PV"ICC/MV$ # 91h0/YP0ICN@YCW/! F/4N4?NV30NCNF3?W@I4/PV3N0"M?D4NICC/M$ IFU 4?NI4I3?NU V4CP34PCNV/XV/@I4D3N@YCW/
" Y0I3Z ICC/M$ # 81*/FN@YCW/ENFD33I0PV# "1HNECIUI4NU 3N0VIC/PFU N@YCW/ENFD33N0V! F/4N4?N3N0VMD4? IP4/0WVI4NV"ICC/MV$ # :1&DFE0N
N@YCW/ENFD33N0/F NKDUNC@I0/X3I0PV# ;1GD3N0P0ICKC/N@YCW/XC/@4CIFV[NCVNUD[DVD/F /XVDFE0NN@YCW/ENFD33N0! F/4N4?NYIVI03N0"M?D4NICC/MV$
IFU 4?NIKD3I03N0" Y0I3Z ICC/M$ # #$1fP04D3N0P0ICKC/N@YCW/V/F NKDUNC@I0/X3I0PV! F/4N4?N@P04D3N0P0ICV4CP34PCNV" Y0I3Z ICC/M$ IFU VPVKNFV/C
"M?D4NICC/M$ # ##!#%1h0/YP0ICN@YCW/MD4? VPVKNFV/C"ICC/M$ # #71+?N4M/‘3N0X/C@NU XC/@VDFE0NN@YCW/ENFD33N0DFVDUN W^E/4D33/4W0NU/F YW
NlPI4D/FI0UD[DVD/F# #!1fP04D3N0P0ICKC/N@YCW/VDFVDUN^WE/4D33/4W0NU/F5#9 A#:1&3IFFDFEN0N34C/F @D3C/V3/KWD@IENV/XNKDUNC@I0VPCXI3NV/X^WE/4D3
3/4W0NU/FVUPCDFEV/@I4D3N@YCW/ENFNVDV’ #91)KDUNC@DV3N0V/X^WE/4D33/4W0NU/F I4#$ UIWV/X3P04PCN/F f& @NUDP@MD4? EC/M4? ?/C@/FN! 4?NY0I3Z
ICC/MDFUD3I4NU 4?N4M/‘3N0X/C@NU XC/@VDFE0N3N0YWKNCD30DFI0UD[DVD/F! IFU 4?NM?D4NICC/MV?/MNU 4?NX/C@NU @P04D‘3N0VMN0# #81fP04D3N0P0IC
KC/N@YCW/I4#$ UIWV/X3P04PCN"ICC/M$ # #"1TNIC4‘V?IKNU V/@I4D3N@YCW/! F/4N4?NUN[N0/KNU VPVKNFV/C"ICC/M$ # #:1)@YCW/ENFD33N0/F NKDUNC@I0
/X3I0PV! F/4N4?NUN[N0/KNU VPVKNFV/C"ICC/M$5#; A%81+CIFV@DVVD/F N0N34C/F @D3C/V3/KWD@IENV/XN@YCW/ENFD3IFU F/FN@YCW/ENFD33N0VUPCDFE
V/@I4D3N@YCW/ENFNVDV’ #;1)KDUNC@DV3N0V/X^WE/4D33/4W0NU/F \PV4N_3DVNU XC/@VNNU# %$1)@YCW/ENFD33N0I4#$ UIWV/X3P04PCN! F/4N4?NNF0ICENU
DF4NC3N0P0ICVKI3N"ICC/M$ # %# A%%1HDVDF4NCECI4NU 3N0I4#$ UIWV/X3P04PCN! F/4N4?N3?C/@I4DF 3/FUNFVNU IFU IKKC/I3?NU 4/FP30NICNF[N0/K "ICC/M
/F 4?ND@IEN%#$ ! 4?N3W4/K0IV@3/F3NF4CI4NU " Y0I3Z ICC/M/F 4?ND@IEN%%$ IFU C/PFU V4CP34PCNIKKNICDF 3W4/K0IV@" M?D4NICC/M/F 4?ND@IEN%%$ #
%7 A%81h0/YP0ICV/@I4D3N@YCW/I47$ UIWV/X3P04PCN! F/4N4?NI@K0NV4IC3? ECIFP0NVIFU /4?NC/CEIFN0NV5
%1%1!6细胞超微形态和超微结构观察6超微形态
观察发现!诱导培养 #$ 天时!合子胚表皮细胞形
成许多不规则的多细胞突起!有的细胞发生了平
周分裂"图 %‘#9$ !同时观察到多细胞原胚的存在
"图 %‘#8$ & 培养 ! 周时!可见分化的两侧对称的
体细胞胚!体细胞胚具发达的胚柄 "图 %‘#" $ & 愈
伤组织表面形成的胚性细胞以发达的胚柄细胞与
组织相连"图 %‘#:$ & 观察结果支持了花楸树体细
胞胚发生中存在单细胞起源的结论&
透射电子显微镜观察发现!培养前的合子胚子
叶细胞排列规则%紧密!壁薄 "图 %‘#;$# 诱导培养
#$ 天时!细胞间隙变大%排列不规则!细胞壁变厚!
形成了核仁明显的胚性细胞"图 %‘%$$& 非胚性细
胞的细胞核内染色质凝聚固缩!趋近核膜 "图 %‘
%#$!细胞质浓缩%内膜系统紊乱%液泡膜破裂崩溃
"图 %‘%%$!胞质内出现许多不同大小和电子致密的
球状物"图 %‘%%$& 这些变化符合细胞程序性死亡
"S’H$的形态学特征!观察结果支持了胚性细胞周
围的细胞发生了程序性死亡的推测& 对诱导培养
7$ 天获得的球形体细胞胚进行观察发现!胚性细胞
体积小!排列紧密!胞质内分布着丰富的淀粉粒"图
%‘%7$!细胞器数量较多!可清晰见到高尔基体%油脂
体%蛋白体%线粒体和白色体的分布"图 %‘%! c%8$&
76结论与讨论
花楸树体细胞胚的发生经历了与合子胚发生类
似的过程!即都经历了从辐射对称向两侧对称发育
过程!经历典型的球形胚%心形胚%鱼雷形胚阶段!最
终发育成分化出子叶%胚根及原维管束的成熟胚&
合子胚和体细胞胚在胚胎发育早期均存在明显的胚
柄结构!发育晚期胚柄退化& 体细胞胚发生与合子
胚发生的区别主要有以下几点’#$体细胞胚发生中
胚性细胞的第 # 次分裂存在均等分裂!这与合子的
第 # 次不均等分裂不同"合子横向分裂产生 # 个大
的基细胞和 # 个小的顶细胞$# %$体细胞胚发生除
了存在单细胞起源途径外!还可能存在多细胞起源
途径# 7$体细胞胚的体积一般小于相同发育阶段的
合子胚# !$体细胞胚在形态发生上不如合子胚精确
和规范!主要表现在相同培养时间下的发育进程不
同步!相同发育阶段的体细胞胚体积大小不等!畸形
胚的发生比较常见&
花楸树胚性愈伤组织表面和合子胚表面发生的
体细胞胚在发育早期均具有明显的胚柄!鱼雷形胚
时期胚柄退化& 这与 &@NC4NFZ/等"%$$7$的研究结
果类似!即在对欧洲云杉 "@-.%1 1:-%&$体细胞胚发
生过程的研究中发现!胚柄通过细胞程序性死亡
"S’H$在早期胚胎形成的后期消失& ’/CCNDI和
’IF?/4/" %$#$ $ 的研究表明!胚柄结构在费约果
""%-Q#1 &%*#K-121$体细胞胚胎发育过程中起提供营
养的作用& 花楸树愈伤组织内部发生的体细胞胚没
有胚柄!但通常以周围或下端较大的细胞区域与愈
伤组织相连& 推测对于花楸树愈伤组织内部发生的
体细胞胚来说!其周围与愈伤组织相连的细胞区域
起到了提供营养的作用&
孤立化的没有超过细胞分化临界期的单个细胞
或细胞团是胚状体发生的必要条件 "崔克明!
%$$"$& 目前!关于植物体细胞胚发生过程中细胞
程序性死亡 "S’H$研究的报道较多& 如在陆地棉
"R#&&(=-0G/-$&0’0G$体细胞胚胎发生中存在 S’H
"吴家和等! %$$7# 夏启中等! %$$9$& &@NC4NFZ/等
"%$$7$利用欧洲云杉体细胞胚发生系统研究了细
胞骨架在植物胚胎发生和 S’H中的作用!认为植物
的胚胎发生需要依赖 S’H!微管网络和丝状肌动蛋
白组织的变化可以作为判断前胚性细胞群"S)f&$
的标志& fICIV3?DF 等 " %$$9 $ 则报 道 了在大麦
"M#$A%0G 50*+1$%$ 小孢子体细胞胚发生中存在
S’H& 本研究在切片观察中发现花楸树早期多细胞
原胚的周围存在大量降解的细胞!对细胞超微结构
的观察表明!这些细胞具有 S’H的形态学特征& 这
些细胞的 S’H可为体细胞胚的发育创造必需的孤
:8
6第 #$ 期 杨6玲等’ 花楸树体细胞胚与合子胚的发生发育
立化的微环境& 但这些细胞的死亡过程是否是
S’H以及发生 S’H的细胞与体细胞胚发生及分化
的关系尚需实验证据"崔克明! %$$"$&
关于植物体细胞胚发生中细胞起源问题尚未定
论& 现在越来越多的报道支持单细胞起源的观点
"崔凯荣等! %$$$# 林荣双等! %$$7# 刘华英等!
%$$!# 张智俊等! %$$!# h?IF4D%’1*5!%$#$$& 花楸
树的体细胞胚发生存在单细胞起源途径!但其是否
存在多细胞起源途径尚需实验证据& 单细胞起源的
体细胞胚具有基因组成完全一致的特点!是基因转
化的良好受体& 花楸树直接起源于合子胚子叶表皮
单细胞的体细胞胚占较高比例!这预示以合子胚子
叶为外植体建立体细胞胚发生系统!将在花楸树遗
传育种工程中发挥巨大潜力&
参 考 文 献
崔凯荣! 戴若兰5%$$$1植物体细胞胚发生的分子生物学5北京’ 科
学出版社5
崔克明5%$$"1植物发育生物学5北京’北京大学出版社5
范丽颖! 任6军! 林玉梅! 等5%$$:1东北地区花楸种子质量的种源
变异研究5东北师大学报’自然科学版! !$ "7$ ’ #7# A#791
孔冬梅! 沈海龙! 冯丹丹! 等5%$$81水曲柳体细胞胚与合子胚发生
的细胞学研究5林业科学! !%"#%$ ’ #7$ A#771
林荣双! 王庆华! 梁丽琨! 等5%$$71+Hn诱导花生幼叶的不定芽和
体细胞胚胎发生的组织学观察5植物研究! %7"%$ ’ #8; A#"%1
刘华英! 萧浪涛! 鲁旭东! 等5%$$!1柑橘体细胞胚发生的组织细胞
学研究5果树学报! %#"!$ ’ 7## A7#!1
沈海龙! 杨6玲! 张建瑛! 等5%$$81花楸种子休眠影响因素与萌发
特性研究5林业科学! !%"#$$ ’ #77 A#7:1
苏喜廷! 王国义! 张淑华!等5%$$91黑龙江省主要阔叶树种绿枝扦
插的效果5东北林业大学学报! 77"9$ ’#7 A#:1
王爱芝!沈海龙! 张6鹏! 等5%$$;1花楸组织培养中玻璃化现象的
发生与防治5东北林业大学学报! 7""#$$ ’#: A%%1
吴家和! 张献龙! 聂以春5%$$71棉花体细胞增殖和胚胎发生中的
细胞程序性死亡5植物生理与分子生物学学报! %; " 8 $ ’ 9#9
A9%$1
夏启中! 张献龙! 聂以春! 等5%$$91撤除外源生长素诱发棉花胚性悬浮
细胞程序性死亡5植物生理与分子生物学学报! 7#"#$’ ": A:!1
许建伟! 沈海龙! 张秀亮! 等5%$#$I5我国东北东部林区花楸树的
天然更新特征5应用生态学报! %#"#$ ’ ; A#91
许建伟! 沈海龙! 张秀亮! 等5%$#$Y5花楸树种子散布%萌发与种群
天然更新的关系5应用生态学报! %#"#$$ ’ %978 A%9!!1
杨6玲! 沈海龙! 刘春苹!等5%$#$1花楸合子胚诱导体细胞胚胎发
生研究5植物研究! 7$"%$ ’#"! A#";1
杨6玲! 崔晓涛! 沈海龙5%$$;I5外源激素与发芽温度对花楸树种
子萌发的影响5植物生理学通讯! !9"8$ ’ 999 A98#1
杨6玲! 沈海龙! 梁立东! 等5%$$;Y5不同产区野生花楸果实和种
子的表型多样性5东北林业大学学报! 7""%$ ’ : A#$1
杨6玲! 沈海龙! 梁立东! 等5%$$:1人工干燥和冷层积过程中的花
楸树种子中内源激素含量变化5植物生理学通讯! !!"!$ ’ 8:%
A8::1
张秀亮! 许建伟! 沈海龙! 等5%$#$1动物对花楸树种实的取食与传
播5应用生态学报! %#"#$$ ’ %8"" A%8:71
张智俊! 金晓玲! 罗淑萍! 等5%$$!1油茶子叶体细胞胚形成的细胞
学观察5植物生理学通讯! !$ "9$ ’ 9"$ A9"%1
郑6健! 郑勇奇! 吴6超5%$$;I5花楸树嫩枝扦插繁殖技术研究5
林业科学研究! %% "#$ ’ ;# A;"1
郑6健! 郑勇奇! 张川红! 等5%$$;Y5花楸树天然群体的异交率5
林业科学! !9"##$ ’ !! A!;1
郑6健! 郑勇奇! 张川红! 等5%$$:1花楸树天然群体的遗传多样性
研究5生物多样性! #8 "8$ ’ 98% A98;1
郑6健! 郑勇奇! 吴6超! 等5%$$"1花楸树的地理分布及天然更新
方式5林业科学! !7 "#%$ ’ :8 A;71
郑万钧5#;:91中国树木志’第 % 卷5北京’ 中国林业出版社! #$%#
A#$%%1
周德本5#;:81东北园林树木栽培5哈尔滨’ 黑龙江科学技术出版
社! ##! A##81
’/CCNDI& f! ’IF?/4/Jf5%$#$1’?ICI34NCD^I4D/F /XV/@I4D3N@YCW/
I4I3?NU V4CP34PCNVDF "%-Q#1 &%*#K-121 GNCE5" fWC4I3NIN$ 5
SC/4/K0IV@I! %!%’ ;9 A#$"1
QI@YCDFDf! HPCIF4N’! ’D/FDFDh! %’1*5%$$81’?ICI34NCD^I4D/F /X
9<3"6)YJ69CN0I4D/FV?DK MD4? W^E/4D3IFU V/@I4D3N@YCW/ENFNVDV5HN[hNFNV
)[/0! %#8’ %97 A%8!1
h?IF4D& B! &P\I4IBh! &CDFI4? kf! %’1*!%$#$1HDCN34V/@I4D3
N@YCW/ENFNVDVIFU K0IF4CNENFNCI4D/F XC/@ D@@I4PCNN_K0IF4V/X
./-.O=%15GD/0/EDIS0IF4ICP@! 9! "#$ ’ #%# A#%91
J/CUWf *! QI[CNJf5%$$71 &KI4D/‘4N@K/CI0[ICDI4D/FVDF V4IC3?
I33P@P0I4D/F UPCDFEENC@DFI4D/F IFU K/V4‘ENC@DFI4D[NEC/M4? /X
W^E/4D3IFU V/@I4D3N@YCW/V/X@-20&=-21&’%$5GD/0/EDIS0IF4ICP@!
!8"!$ ’ 9$" A9#%1
fICIV3?DF & Q! hIPVVIFU h! SP0DU/,! %’1*5%$$91SC/ECI@@NU 3N0
UNI4? UPCDFE4?N4CIFVD4D/F XC/@@P04D3N0P0ICV4CP34PCNV4/E0/YP0IC
N@YCW/VDF YIC0NWIFUC/ENFNVDV5S0IF4I! %%#"!$ ’ !9; A!"$1
fI4?NMff! S?D0DK .J5%$$71&/@I4D3N@YCW/ENFNVDV[NCVPV W^E/4D3
N@YCW/ENFNVDVDF <2&%’%&0=%$:0G5S0IF4’N0! +DVVPNIFU 2CEIF
’P04PCN! "%’ %8" A%"91
SNV3IU/Ck! BNCYIPWhG! BCIPVJ)! %’1*5%$$:1’?IFENVDF V/0PY0N
3ICY/?WUCI4NVIFU V4IC3? I@/PF4V UPCDFE V/@I4D3 IFU W^E/4D3
N@YCW/ENFNVDV/X3..1 &%*#K-121 "fWC4I3NIN$5(F .D4C/’N0HN[
GD/0‘S0IF4! !!’%:; A%;;1
&3?@DU4+! )MI0U ,! &NWCDFEf! %’1*5%$$81’/@KICI4D[NIFI0WVDV/X
3N03W30NN[NF4VDF W^E/4D3IFU V/@I4D3N@YCW/V/X)(.*1G%2
=%$&-.0G DFUD3I4NV V4C/FE CNVN@Y0IF3N /XV/@I4D3 N@YCW/V 4/
CN3I03D4CIF4VNNUV5S0IF4’N0kNK! %9’ 8!7 A89$1
&@NC4NFZ/,S! G/^?Z/[S.! QD0/F/[I-T! %’1*!%$$71kN‘/CEIFDVI4D/F
/X4?N3W4/VZN0N4/F UPCDFEUN[N0/K@NF4I0KC/ECI@@NU 3N0UNI4? DF
@-.%1 1:-%&N@YCW/V5+?NS0IF4J/PCFI0! 77’ :#7 A:%!1
n?IFE&! R/FE-! fNFE-! %’1*!%$$%1 &D@D0ICD4W/XN_KCNVVD/F
KI4NCFV/XO2#’%A[ IFU ZG9<)[ UPCDFEV/@I4D3IFU W^E/4D3
N@YCW/ENFNVDVDF @ID^N"Z%1 G1(&-5$ 5S0IF4I! %#9’ #;# A#;!1
!责任编辑6徐6红"
;8