全 文 ：第 26 卷　第 4期
2004 年 7 月
北　京　林　业　大　学　学　报
JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITY
Vol.26 , No.4
Jul., 2004
2003--09-27收稿
http: www .wanfangdata.com.cn
＊“863”国家高新技术项目(2001AA244031)的部分内容.
第一作者:冯大领 ,硕士生.主要研究方向:植物生物技术.电话:010--62390757　Email:shuqfeng@sina.com　地址:100083 北京林业大学生
物科学与技术学院.
责任作者:孙振元 ,博士 ,研究员.主要研究方向:林木花卉生物技术.电话:010--62889626　Email:sunzy@rif.forestry.ac.cn　地址:100091中
国林业科学研究院花卉研究中心.
爬山虎体细胞胚的发生及组织学研究＊
冯大领　李　云 孙振元
(北京林业大学生物科学与技术学院) (中国林业科学研究院花卉研究中心)
摘要　该文以爬山虎子叶的叶片和叶柄为试验材料 ,对爬山虎体细胞胚发生进行了研究.结果表明:爬山虎子叶在
MS附加 6--BA 0.3 mg L和 NAA 0.1 mg L培养基上或 1/ 2MS 附加 6--BA 0.5 mg L和 NAA 0.1 mg L培养基上都能诱
导产生体细胞胚 ,子叶叶柄在 1/ 2MS 附加 6--BA 0.3 mg L的培养基上也产生了体细胞胚.胚性愈伤组织转移到无
植物生长调节剂的MS 或 B5 培养基上均能发育成正常植株.组织学观察表明 ,爬山虎体细胞胚的形成经历了球形
胚 、心形胚 、鱼雷胚 、子叶胚等几个阶段 , 逐渐发育成正常植株 , 这与合子胚的发育途径相似.体细胞胚在发育过程
中出现了连体胚 、芽端畸形胚 、超度含水状胚等几种畸形胚.
关键词　爬山虎 ,体细胞胚发生 , 组织学
中图分类号　S687.3
FENG Daling;LI Yun;SUN Zhenyuan.Histology and somatic embryogenesis of Parthenocissus
tricuspidata .Journal of Beijing Forestry University(2004)26(4)97-99 [ Ch , 16 ref.] School of Biological
Sciences and Biotechnology ,Beijing Forestry University ,100083 ,P.R.China.
Somatic embryogenesis of Parthenocissus tricuspidata is studied in this paper.The results show that
somatic embryos are obtained from cotyledons of P.tricuspidata induced on MS medium containing 0.3 mg L
6-BA and 0 .1 mg L NAA or 1 2MS medium containing 0.5 mg L 6--BA and 0.1 mg L NAA , and from
cotyledon petioles induced on 1 2MS medium containing 0.3 mg L 6-BA .Embryonic callus cells are developed
to normal seedlings when subcultured on MS or B5 medium without plant growth regulator.Histological
observations reveal that the somatic embryos successively differentiate through globular-shaped , heart-shaped ,
torpedo stages and cotyledon stages , similar to the development of zygotic embryo.There are several abnormal
embryos including joined embryo , abnormal-bud embryo and hyperhydric embryo , etc.in the induction stage of
somatic embryos.
Key words　Parthenocissus tricuspidata , somatic embryogenesis ,histology
　　爬山虎(Parthenocissus tricuspidata)是葡萄科(Vi-
taceae)爬山虎属(Parthenocissus)植物[ 1] .爬山虎攀缘
能力强 ,具有较好的改善和美化环境的效果 ,是垂直
绿化的首选攀缘木本植物.由于爬山虎还具有较强
的耐旱 、耐热 、耐寒性能 ,以及抗根瘤蚜 (Phylloxeri-
dae)和抗病的能力[ 2] , 因此 , 爬山虎的适应范围极
广 ,在世界各地广泛栽培.目前国外专家对爬山虎属
植物的生化产物 、DNA含量 、碱基序列 、微卫星侧翼
序列的特征等进行了研究 ,探讨了葡萄科中爬山虎
属与葡萄属(Vitis)物种之间的亲缘关系[ 3-7] .国内学
者对爬山虎的研究仅限于一些形态解剖 、生理特性 、
栽培措施 、绿化效果及应用 、种质资源调查等[ 8] .有
关爬山虎再生系统的建立国内外极少见报道.研究
植物体细胞胚发生与发育不仅对于揭示细胞分化 、
形态发生和合子胚发生等具有重要意义 ,而且胚性
细胞还是外源基因的良好受体.深入研究爬山虎体细
胞胚的发生还将为爬山虎原生质体培养 、优良无性系
的繁殖 、基因工程和突变体筛选等研究奠定基础.
DOI :10.13332/j.1000-1522.2004.04.020
1　材料与方法
1.1　试验材料
本试验采用由加拿大引进的爬山虎(此品种抗
寒能力较强)种子的子叶叶片和叶柄为试验材料.
1.2　无菌培养体系的建立
将爬山虎种子用室温下的自来水浸泡 10 ～ 15
h ,然后用 70%酒精表面灭菌 2 min ,无菌水冲洗 2
遍 ,接着用 0.1%HgCl2 表面灭菌 10 min ,无菌水冲洗
5遍.接种在不加植物生长调节剂(PGR ,以下均用此
表示)的 B5 空白培养基上.
1.3　爬山虎体细胞胚的诱导
将无菌苗的子叶垂直于主叶脉剪伤 ,叶面贴于
培养基上 ,子叶叶柄剪成 4 mm 长平放在培养基上.
诱导培养基采用基本培养基(MS 、B5 、1 2 MS)、6-BA
(0.3 、0.5 、0.8 mg L)、NAA(0 、0.1 、0.2 mg L)三因素
三水平的正交试验设计 ,培养基组合见表 1 ,每个处
理组合接 30个外植体.将产生体细胞胚的胚性愈伤
组织转移到无 PGR的MS 或 B5培养基上 ,使其发育
成正常植株.
以上培养基中均含有蔗糖 20 g L ,琼脂5 g L.用
1 mol L NaOH或HCl调 pH值为 5.8 ～ 6.2 ,高压蒸汽
灭菌 20 min.培养温度 22 ～ 28℃,光 暗周期 15 h 9
h ,光强 2 000 ～ 2 500 lx ,相对湿度 45%～ 57%.
1.4 　组织学观察
将子叶叶片早期诱导的紧实愈伤组织 、能看到
体细胞胚发生的松散愈伤组织以及正在发育的体细
胞胚 ,分别用FAA固定液固定 48 h ,采用石蜡包埋 ,
脱蜡后依次用 1%番红 、0.5%固绿染色.石蜡切片
厚度为 8 ～ 10 μm ,封片后 ,用 OLYMPUS BH-2显微
镜和OLYMPUS C--35AD-4摄相系统观察照相.后期
体细胞胚发生及发育用 CANONG2数码相机照相.
2　试验结果
2.1 　爬山虎体细胞胚的诱导
将爬山虎无菌苗子叶的叶片和叶柄接种在正交
试验设计的培养基上.体细胞胚的诱导率见表 1.
由表 1可知 ,爬山虎子叶叶片在 MS附加 6-BA
0.3 mg L 和NAA 0.1 mg L 培养基上或 1 2 MS 附加
6-BA 0.5 mg L和 NAA 0.1 mg L 培养基上都能诱导
产生体细胞胚 ,前者的诱导率为 10.0 %,后者的诱
导率为16.7%,而在其他培养基上诱导率为 0 ,未出
现体细胞胚;爬山虎子叶的叶柄在 1/2 MS 附加 6-
BA 0.3 mg L的培养基上也产生了体细胞胚 ,而其他
培养基则没有体细胞胚的发生 ,这说明不同的外植
体有着不同的体细胞胚发生能力.试验结果还表明 ,
基本培养基类型在诱导体细胞胚过程中差异很大 ,
在MS和 1/2 MS上 ,叶片和叶柄都能诱导出体细胞
胚 ,而在 B5 培养基上 ,叶片和叶柄却没有体细胞胚
的发生 ,这说明MS和 1/2 MS 培养基上的营养元素
配比较 B5更适合体细胞胚发生.在同一种基本培养
基不同 PGR配比的培养基上 ,叶片和叶柄的体细胞
胚诱导率也表现出较大差异 ,这说明 PGR的作用是
复杂的 ,因此 ,体细胞胚诱导过程中 ,PGR浓度的不
同会引起不同的试验结果[ 9] .
表 1　体细胞胚在不同培养基上的诱导率
TABLE 1　Induction rate of somatic embryos at the
different culture media
培养基 基本培养基 6-BA NAA 体细胞胚诱导率 %叶片 叶柄
1 MS 0.5 0.2 0 0
2 MS 0.8 0 0 0
3 MS 0.3 0.1 10.0 0
4 B5 0.5 0 0 0
5 B5 0.8 0.1 0 0
6 B5 0.3 0.2 0 0
7 1/2 MS 0.5 0.1 16.7 0
8 1/2 MS 0.8 0.2 0 0
9 1/2 MS 0.3 0 0 6.7
试验观察发现 ,子叶叶片接种在培养基上形成
的早期愈伤组织呈绿色 、白色 ,30 d后生长变缓慢 ,
出现彩色 、白色 、绿色 、黄白色 、黄绿色等多种颜色的
愈伤组织 ,这些愈伤组织有水渍状 、干燥状 、紧实状 、
松散状等几种形态.产生体细胞胚的愈伤组织都是
松散 、白色且不干燥的愈伤组织.将胚性愈伤组织转
移到不含 PGR的MS或 B5 培养基中 ,逐渐形成体细
胞胚 ,图版 I-1是正在发育的胚性愈伤组织.
2.2　组织学观察
在显微镜下观察发现 ,叶片早期形成的愈伤组
织细胞是细胞间隙大的圆形薄壁细胞 ,液泡较大 ,几
乎占据整个细胞 ,比排列整齐的叶片组织的细胞大
得多 ,这些早期形成的愈伤组织是非胚性愈伤组织.
胚性愈伤组织的细胞在形成体细胞胚过程中分裂加
速 ,细胞小 ,细胞质浓 ,并逐渐形成小的突起 ,形成多
细胞原胚 ,在多细胞原胚中能够看到中央部分细胞
进行垂周分裂 ,且分裂较其他细胞快[图版 I-2] .体
细胞胚经过球形胚 、心形胚 、鱼雷胚 、子叶胚等几个
阶段[图版 I--3 ～ 6] 逐渐发育成正常植株[ 图版 I-
7] ,这与合子胚的发育途径相似.体细胞胚的发育伴
随着胚芽和胚根的同时形成[图版 I-8] .在鱼雷胚
中看到了正在发育的 Y形维管组织[图版 I-9] .
2.3　发育中的畸形胚
在本试验中正常发育成完整植株的体细胞胚仅
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占3%,观察到的畸形胚主要有连体胚(胚轴相连 ,
具4个子叶 ,2个胚芽)[图版 I-10] 、芽端畸形胚(子
叶发育不全只有 1个子叶发育 ,甚至 2个都不发育 ,
或子叶过度生长 ,膨大 ,形成超度含水态子叶)[ 图版
I-11] 、超度含水状胚即玻璃化胚[图版 I-12]等.
3　讨　　论
3.1 　体细胞胚的诱导
在体细胞胚的诱导过程中 ,存在着多方面的影
响因子 ,包括基因型及外植体生理状态 、外源 PGR 、
培养基 、培养条件等 ,其中外源 PGR是非常重要的
影响因素[ 10 ,11] .试验得出 ,在爬山虎体细胞胚诱导
中 ,6--BA 与 NAA 配合使用能够诱导出胚性愈伤组
织并发育成体细胞胚 ,这在葡萄 、泡桐 、酸枣等植物
中得到了证实[ 9] .单独使用 6-BA 也能诱导爬山虎
子叶叶柄产生体细胞胚 ,在其他植物如甜橙 、葡萄 、
山地麻黄的研究[ 12]中同样得到了相似的结论.
根据愈伤组织生长发育的细胞学特点 ,可将其
分为诱导期 、分裂期(增殖期)和分化期(器官和体细
胞胚形成期)[ 13] .在本试验中 ,非胚性愈伤组织经过
40 d左右的分裂期 ,少量非胚性愈伤组织才逐渐发
育成胚性愈伤组织而进入分化期.由此说明 ,愈伤组
织由分裂期到分化期是一个非常复杂的过程 ,受多
方面因素的影响.在本试验中体细胞胚的再生率还
不高 ,需进一步探求更为有效的诱导方法.
3.2 　畸形胚的发育
一般说 ,胚状体一旦分化出来甚至只要完成诱
导之后转移到基本培养基上 ,即可发育成熟和形成
小植株 ,如胡萝卜 、芹菜[ 9] .但在很多种植物的体细
胞胚诱导过程中常常会出现畸形胚 ,不能正常发育
成植株 ,严重影响了体细胞胚再生形成植株的频率.
因此 ,控制畸形胚发生非常重要 ,但有关控制其发生
的研究还不是很深入.为了减少畸形胚 ,前人认为 ,
应在体细胞胚发生的早期采取措施 ,如调节生长素
和激动素的浓度 ,防止根原基的过度发育 ,促进子叶
原基的发育和芽原基的形成 ,可明显地降低畸形胚
的发生率[ 14] .在爬山虎体细胞胚诱导中出现了连体
胚 、芽端畸形胚 、超度含水状胚等几种畸形胚.
通过观测 ,超度含水态胚与培养容器内的湿度
有密切关系 ,当封口膜的透气性差时容易产生玻璃
化胚 , 这与很多植物产生玻璃化胚的研究相一
致[ 14] ,这种体细胞胚多半不能发育成正常植株.而
在爬山虎体细胞胚的连体胚和芽端畸形胚中 ,有的
经过培育又发育成正常植株 ,这说明体细胞胚早期
发育的不正常现象没有完全影响其后的器官建成和
正常发育 ,这与 Ъатыгина等的研究相符合[ 15] .
3.3　胚状体发育的不同步性
在爬山虎体细胞胚诱导中发现 ,愈伤组织发育
成体细胞胚时同步性非常差 ,有的已经发育成正常
植株 ,有的处于愈伤组织状态 ,还有的处在发育过程
中.胚状体发育的不同步性是体细胞胚诱导中的普
遍现象 ,在一块愈伤组织或一个胚性细胞复合体中
很容易观察到各个发育时期即从单个细胞到多细胞
原胚 、球形胚 、鱼雷胚一直到成熟的具子叶的体细胞
胚.目前对如何提高体细胞胚发育同步性的研究有
些报道[ 16] ,但其机理及调节机制还需更深入研究.
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(责任编辑　董晓燕)
99第 4期 冯大领等:爬山虎体细胞胚的发生及组织学研究
冯大领等:爬山虎体细胞胚的发生及组织学研究 版图 Ⅰ
FENG Daling et al:Histology and somatic embryogenesis of Parthenocissus tricuspidata Plate Ⅰ
1.正在发育的胚性愈伤组织(×10)　2.胚性愈伤组织上形成小突起(多细胞原胚)(×10)　3.球形胚(×10)　
4.心形胚(×10)　5.鱼雷胚(×4)　6.子叶胚(×4)　7.发育好的正常植株　8.长有胚芽和胚根的体细胞
胚(×4)　9.鱼雷胚中的Y形维管组织(×4)　10.发育晚期的连体胚　11.芽端畸形胚　12.超度含水状胚