全 文 ：第 49 卷 第 6 期
2 0 1 3 年 6 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 49，No. 6
Jun．，2 0 1 3
doi: 10．11707 / j．1001-7488．20130605
收稿日期: 2013 － 01 － 29; 修回日期: 2013 － 04 － 20。
基金项目: 国家自然科学基金项目(30271082，30571496) ，高等学校博士学科点专项科研基金项目(20050466003 )和河南省杰出人才计
划项目(122101110700)。
* 范国强为通讯作者。
基于 Illumina高通量测序的泡桐转录组研究*
邓敏捷1，2 董焱鹏1，2 赵振利1，2 张晓申1，3 范国强1，2
(1. 河南农业大学泡桐研究所 郑州 450002; 2. 河南农业大学林学院 郑州 450002; 3. 郑州市农林科学研究所 郑州 451400)
摘 要: 利用新一代高通量测序技术平台 Illumina Solexa 对泡桐进行转录组测序和数据 de novo 组装，并对得到
的 unigene 进行功能注释、分类及代谢通路分析。结果表明，N50 值为2 278 bp、平均长度为1 410 bp的泡桐 unigene
共有188 019条，将其与 NCBI 的 Nr 和 Swiss-Prot 数据库比对后发现，分别有120 808条和85 880条 unigene 与其他物
种的基因具有同源性。利用 COG 数据库可将有关的41 914条泡桐 unigene 分成 25 类，KEGG 数据库分析发现共有
43 553个 unigene 参与 215 种代谢通路。找到与木质素合成相关的泡桐 unigene。
关键词: 泡桐; 转录组; Illumina 高通量测序; 从头组装
中图分类号: S718. 46 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2013)06 － 0030 － 07
Illumina-Based de novo Sequencing and Characterization of
the Transcriptome of Paulownia Plant
Deng Minjie1，2 Dong Yanpeng1，2 Zhao Zhenli1，2 Zhang Xiaoshen1，3 Fan Guoqiang1，2
(1. Institute of Paulownia，Henan Agricultural University Zhengzhou 450002; 2. College of Forestry，Henan Agricultural University
Zhengzhou 450002; 3. Zhengzhou Research Institute of Agriculture and Forestry Sciences Zhengzhou 451400)
Abstract: The transcriptome Paulownia plant was sequenced by using Illumina technology， and the functional
annotations and metabolic pathways analyses of some unigenes were conducted in this present paper． The results indicated
that 188 019 unigenes with an average length of 1 410 bp and N50 value of 2 278 bp were obtained with de novo assembly．
Comparison with NCBI and Swiss-Prot protein databases showed that 120 808 and 85 880 unigenes had homology with the
genes from other species，respectively． The 41 914 unigenes were able to be assigned to 25 categories with the COG
(Clusters of Orthologous Groups) database． Functional annotation against KEGG ( Kyoto Encyclopedia of Genes and
Genomes) database identified 43 553 unigenes which were mapped to 215 metabolic pathways． Moreover，some Paulownia
unigenes related to lignin biosynthesis were found using this information platform． The result provides reference for future
excavations of new genes，as well as screening and identifying miRNA of Paulownia plants．
Key words: Paulownia; transcriptome; Illumina sequencing; de novo assembly
泡桐属 (Paulownia)落叶乔木，现有 9 种 2 变
种，是中国重要的速生用材和绿化树种，大力发展泡
桐对于改善生态环境，缓解目前中国木材短缺局面
和提高农民生活水平具有重要的经济和生态意义。
过去，国内外泡桐研究主要集中在其种质资源创制
和新品种培育以及丛枝病发生机制与防治等方面
(范国强等，2003; 2006; 2007a; 2007b; 2007c;
2008; 2009; 2010; 黎明等，2008; 田国忠等，2010;
翟晓巧等，2010; 赵振利等，2011; Fan et al．，1997;
Llano-Sotelo et al．，2010; Akyildiz et al．，2010)，而对
泡桐分子生物学研究则相对较少(范国强等，2011;
2012; 陈占宽等，2011)。目前，因泡桐基因组序列
未知，遗传背景不清，造成了其组学研究的困难，急
需了解泡桐遗传信息，加快其基因和基因组学的研
究。转录组测序是基于下一代高通量测序技术建立
的一种高效、快捷分子生物学研究手段，利用该手段
可消除转录本研究对基因组序列的依赖，使科技工
作者能在组学水平上研究基因组序列未知的非模式
第 6 期 邓敏捷等: 基于 Illumina 高通量测序的泡桐转录组研究
生物( Vera et al．，2008; Kristiansson et al．，2009 )。
开展转录组研究能够从整体水平了解植物在特定阶
段的基因功能及基因结构，更加便利地揭示特定生
物学过程的分子机制(祁云霞等，2011)。近年来，
已有多种木本植物，如木榄(Bruguiera gymnorrhiza)
(Miyama et al．，2008)、刚毛柽柳 ( Tamarix hispida)
(Gao et al．，2008 )、红豆杉 ( Taxus ) ( Hao et al．，
2011)、桉树(Eucalyptus) (Mizrachi et al．，2010)、日
本落叶松(Larix leptolepis)(Zhang et al．，2012)、橡胶
树( Hevea brasiliensis ) ( Li et al．， 2012 ) 和 茶 树
(Camellia sinensis) ( Shi et al．，2011)等转录组公布
于世，但至今未见有关泡桐转录组的报道。本研究
利用高通量测序技术平台 Illumina Solexa 先对泡桐
叶片进行转录组测序、拼接组装，再用生物信息学的
方法对得到的 unigene 进行功能注释和功能分类，
以期为泡桐功能基因的发掘利用、特异 miRNA 的鉴
定及功能分析等奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
试验材料为河南农业大学林木生物技术实验室培
养 30 天的二倍体和四倍体白花泡桐 ( Paulownia
fortunei)、二倍体和四倍体毛泡桐(P． tomentosa)、二倍
体和四倍体南方泡桐(P． australis)以及二倍体和四倍
体豫杂一号泡桐(P． tomentosa × P． fortunei)组织培养
苗。培养温度(25 ±2) ℃，光照强度 130 μmol·m －2s － 1，
光照时间为 16 h·d － 1。采集相同质量上述泡桐叶片，
用液氮速冻后存于 －80 ℃冰箱中备用。
1. 2 泡桐叶片 RNA 提取
将适量上述泡桐的叶片组织混合均匀，用奥莱
博植物 RNA 提取试剂盒提取泡桐 RNA，然后使用
RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN) 对 RNA 样品进一
步纯化。利用 Agilent 的 BioAnalyzer 2100 检测 RNA
完整性，样品 RIN≥8。
1. 3 泡桐 cDNA 文库构建
采 用 TruSeq RNA Sample Preparation Kit
( Illumina ) 进行泡桐 cDNA 文库构建。取 4 μg
RNA，用带有 Oligo ( dT) 的珠子分离纯化其中的
mRNA，然后将得到的 mRNA 处理成小片段。以
mRNA 小片段为模板，用随机引物进行逆转录生
成 dsDNA，末端补平后，在 3 末端加 A，然后连接
接 头，用 Agencourt AMPure XP 60 mL Kit
(Beckman)对产物进行 2 次纯化彻底去除多余接
头后，进行 12 个循环的 PCR 扩增，扩增产物进行
琼脂糖凝胶电泳，用 MiniElute Gel Extraction Kit
(QIAGEN)切胶回收长度 300 ～ 350 bp 的条带，得
到测序用双末端文库。
1. 4 高通量测序
用 KAPA SYBR 快 速 PCR 试 剂 盒 ( KAPA
Biosystem)对文库快速定量，得到文库样品准确浓
度，取 10 μL 2 nmol·L － 1文库样品，在 cBot 上进行簇
生成反应后，用高通量测序平台 Illumina GAⅡ x 进
行 DNA 双末端测序，通过 200 /220 个循环的测序反
应，得到 2 × 100 /110 bp 的原始数据。
1. 5 数据拼接和功能注释
碱基读取得到原始序列数据后，去掉其中低质
量数据和污染接头后，将剩余的高质量数据用
Velvet(Zerbino et al．，2008)和 Oases( Schulz et al．，
2012)软件组装得到泡桐的 unigene，接着先用
BLAST 系列软件对泡桐的 unigene 序列分别与 Nr
(NCBI 非冗余蛋白数据库)、Swiss-Prot 和 COGs 比
对，进行功能注释和分类; 再在 InterProScan4. 8 与
数据库 InterPro 进行比对的基础上，对泡桐 unigene
进行 GO 功能注释和分类，然后用 WEGO 软件(Ye
et al．，2006 ) 对 GO 注释结果分类作图。最后，将
unigene 与 KEGG 数据库进行比对，分析其相关的代
谢通路。数据分析流程、使用数据库及有关参数分
别见图 1 和表 1。
2 结果与分析
2. 1 测序结果和 de novo 组装
测序共得到 384 M reads，其中 Q20≥80%的高
质量数据为 376 M reads，平均长度为 95 bp。采用
Velvet 和 Oases 软件，对测序得到的高质量数据进行
de novo 组装，共得到311 728条序列重叠群( contig)，
N50 为 289 bp，平均长度为 257 bp。将这些序列
contig 进一步组装，得到 N50 为2 278 bp，平均长度
为1 410 bp的泡桐 unigene 188 019条(图 2)。其中，
127 891条 ( 68. 02% ) unigene 长度 大 于 500 bp，
99 731条 ( 53. 04% ) 长度大于 1 000 bp，49 959 条
(26. 57% )长度大于2 000 bp，最长的 unigene 长度
为17 029 bp。此外，177 107条 (94. 6% ) unigene 不
含 N(图 3)。这些结果说明，测序和组装效果很好，
可以进行基因功能分析。
2. 2 功能注释
将组装得到的188 019条泡桐 unigene 与 Nr 数
据库比对(E 值≤1e － 5)，有123 062条(65. 5% )与
毛果杨(Populus trichocarpa)、葡萄( Vitis vinifera)和
蓖麻 ( Ricinus communis) 等植物的序列同源; 与
Swiss-Prot 数据库比对(E 值≤1e － 10)，有85 880条
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林 业 科 学 49 卷
图 1 泡桐转录组生物信息学分析流程
Fig. 1 The workflow of bioinformatic analysis of Paulownia transcriptome
Nr: NCBI 非冗余蛋白数据库 NCBI non-redundant protein database; Swiss-Prot: 欧洲生物信息学研究所维护的蛋白数据库 The protein database
supported by European Bioinformatics Institute; GO: 基因本体数据库 Gene Ontology; COGs: 蛋白质直系同源簇数据库 Clusters of Orthologous
Groups of proteins; KEGG: 京都基因与基因组百科全书数据库 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes．
表 1 泡桐 unigene 功能注释所使用的数据库和软件①
Tab. 1 Databases and softwares used for functional annotation of Paulownia unigenes
数据库 Database 数据库版本 Version 使用软件 Software E(≤) 备注 Reference
Nr 20120304 BLASTX 1e － 5
Swissprot 20120304 BLAST 1e － 10
Altschul et al．，1997
COG 20120304 BLAST 1e － 10
KEGG Release58 BLASTX 1e － 10
InterPro
GO
V36
V4. 8
InterProScan
—
—
Zdobnov et al．，2001
① —: 无 E 值。No E value．
图 2 泡桐 unigene 长度分布
Fig. 2 Length distribution of Paulownia unigenes
(45. 7% )泡桐 unigene 找到了同源序列。此外，还
有 71 条和 19 条 unigene 分别与 Nr 和 Swiss-Prot 数
据库中白花泡桐肉桂酰辅酶 A 还原酶(CCR)基因
和 4 － 香豆酸辅酶 A 连接酶基因(4CL)、毛泡桐烟
酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶基因、台湾泡
图 3 泡桐 unigene 的 gap 分布
Fig. 3 Gap distribution of Paulownia unigenes
桐(P． kawakamii)MADS-box 基因和芽形成相关基
因( pksF1)及超氧化物歧化酶基因( sodCC)有一定
的同源性。值得注意的是标注为 Locus _ 2536 _
Transcript_3 /6 的泡桐 unigene 与 Nr 数据库中肉桂
酰 辅 酶 A 还 原 酶 基 因 的 CDS 序 列
( gb | ACD13265. 1 | )的同源性高达 94%。
23
第 6 期 邓敏捷等: 基于 Illumina 高通量测序的泡桐转录组研究
2. 3 功能分类
与 COGs 数 据 库 比 对 ( E 值 ≤ 1e － 10 )，
188 019条泡桐 unigene 中，49 760条 ( 26. 50% )比
对到了同源序列，其中的41 964条泡桐 unigene 分
布于 25 个大类 (图 4)。unigene 最多的为一般功
能预测类，共有9 927条序列(23. 66% )，其余依次
为 转 录 后 修 饰、蛋 白 翻 转 和 分 子 伴 侣 类
(3 829，9. 12% )，翻译、核糖体结构和生物起源类
(3 042，7. 25% )，碳 水 化 合 物 转 运 和 代 谢 类
(2 988，7. 12% )。此外，泡桐 unigene 的 GO 注释
分类结果(图 5 )表明，67 316条泡桐 unigene 被注
释分类。根据其在细胞中所处位置，已注释的
unigene 可分为 13 类，其中，包含 unigene 最多的是
细胞类和细胞组成类 (19 250条，28. 60% )，其次
是细胞器类 (6 764条，10. 04% )。根据其分子功
能，可以将这些 unigene 分为 12 类，其中，unigene
最多的是结合相关蛋白类 ( 44 456条，66. 04% )，
其次是催化相关蛋白类(34 648条，51. 47% )。依
据其参与的生物学过程，可以将其分为 19 类，其
中，代 谢 过 程 类 包 含 unigene 最 多 ( 34 788 条，
51. 68% )，细胞过程类次之(30 328条，45. 05% )。
2. 4 代谢通路分析
KEGG 注释结果 (表 2 )表明，188 019条泡桐
unigene 中，43 553 条被注释 ( 23. 16% ); 并且这
43 553条泡桐 unigene 共涉及到 215 种代谢途径，其
中 unigene 数量最多为内质网蛋白质加工途径
(1 034条，2. 37% ); 其余依次为核糖体 (962 条，
2. 21% )、RNA 转运 (956 条，2. 20% )、植物激素信
号转导 (953 条，2. 19% )、剪接体 (922 条，2. 12% )
等途径。
将泡桐 unigene 映射到木质素生物合成代谢途
径发现，180 条 unigene 参与木质素生物合成，其中:
16 条对应苯丙氨酸解氨酶 ( PAL)，20 条对应肉桂
酸 － 4 － 羟化酶 ( C4H)，22 条对应 4CL，6 条对应
CCR，11 条对应肉桂醇脱氢酶 ( CAD)，11 条对应
对 －羟基肉桂酰基 － 辅酶 A: 奎尼酸 /莽草酸对 －
羟基肉桂酰基转移酶(HCT)，13 条对应对 －香豆酸
3 － 羟化酶 ( C3H)，5 条对应阿魏酸 5 － 羟化酶
(F5H)，73 条对应过氧化物酶 E1. 11. 1. 7，只有 1 条
与过氧化物酶 PRDX6 相对应。其中，对应 CCR 的 6
条和对应 4CL 的 22 条 unigene 分别有 6 条和 7 条为
Nr 数据库中泡桐的相关基因序列。但未发现咖啡
酸 － O －甲基转移酶(COMT)和过氧化氢 － 过氧化
物酶(katG)相关的 unigene。
图 4 泡桐 unigene 的 COG 分类
Fig. 4 Classification of the clusters of orthologous groups
(COG) for Paulownia unigenes
A: 一般功能预测 General function prediction only; B: 翻译后修饰、
蛋白翻转、分子伴侣 Posttranslational modification，protein turnover，
chaperones; C: 翻译、核糖体结构和生物合成 Translation，ribosomal
structure and biogenesis; D: 碳水化合物转运和代谢 Carbohydrate
transport and metabolism; E: 氨基酸转运和代谢 Amino acid transport
and metabolism; F: 复制、重组和修复 Replication，recombination and
repair; G: 能量产生和转化 Production and conversion; H: 脂类转运
和代谢 Lipid transport and metabolism; I: 转录 Transcription; J: 功能
未知 Function unknown; K: 信 号 转 导 机 制 Signal transduction
mechanisms; L: 无机离子转运和代谢 Inorganic ion transport and
metabolism; M: 细胞壁 /膜 /包膜生物合成 Cell wall /membrane /
envelope biogenesis; N: 次 生 代 谢 物 生 物 合 成、转 运 和 代 谢
Secondary metabolites biosynthesis，transport and catabolism; O: 辅酶
转运和代谢 Coenzyme transport and metabolism; P: 细胞内运输、分
泌和 膜 泡 运 输 Intracellular trafficking， secretion， and vesicular
transport; Q: 防御系统 Defense mechanisms; R: 核苷酸转运和代谢
Nucleotide transport and metabolism; S: 细胞骨架 Cytoskeleton; T: 细
胞周 期 控 制、细 胞 分 裂 和 染 色 体 分 区 Cell cycle control， cell
division， chromosome partitioning; U: 染 色 质 结 构 和 动 力 学
Chromatin structure and dynamics; V: RNA 加 工 和 修 饰 RNA
processing and modification; W: 细胞迁移 Cell motility; Y: 核结构
Nuclear structure．
3 讨论
植物转录组数据可因不同试验目的来源于不同
试验样品材料。目前，一种是不同组织材料等量混
合后 测 序 和 组 装 的 结 果 ( Hsiao et al．， 2011;
Parchman et al．，2010; Huang et al．，2012)，另一种
是不同组织材料测序后再一起组装的结果(Garg et
al．，2011; Wang et al．，2012)。前者可以得到更多的
转录组数据，但由于不同组织间存在可变剪切，使
contig 组装变得困难，影响试验结果的精确度( Zhou
et al．，2012)。因此，有研究者将同一组织测序后数
据进行组装(Barrero et al．，2011)。研究表明，组织
特异性的转录组能为基因表达研究提供更全面的参
33
林 业 科 学 49 卷
图 5 泡桐转录组 GO 分类
Fig． 5 GO classification for Paulownia unigenes
细胞内定位 Cellular location: C1． 细胞 Cell; C2． 细胞部分 Cell part; C3． 包膜 Envelope; C4． 胞外区 Extracellular region; C5． 大分子复合体
Macromolecular complex; C6． 膜封闭腔 Membrane-enclosed lumen; C7． 细胞器 Organelle; C8． 细胞器部分 Organelle part． 分子功能 Molecular
function: M1． 抗氧化活性 Antioxidant activity; M2． 结合 Binding; M3． 催化活性 Catalytic activity; M4． 电子传递活性 Electron carrier activity;
M5． 酶调节活性 Enzyme regulator activity; M6． 分子转导活性 Molecular transducer activity; M7． 结构分子活性 Structural molecule activity; M8．
转录调节活性 Transcription regulator activity; M9． 翻译调节活性 Translation regulator activity; M10． 转运活性 Transporter activity． 生物学过程
Biological process: B1． 解剖结构形成 Anatomical structure formation; B2． 生物调节 Biological regulation; B3． 细胞组分生物合成 Cellular
component biogenesis; B4． 细胞组分组织 Cellular component organization; B5． 细胞过程 Cellular process; B6． 细胞死亡 Death; B7． 发育过程
Developmental process; B8． 胞内定位的建立 Establishment of localization; B9． 细胞内定位 Localization; B10． 代谢过程 Metabolic process; B11．
涉及多个有机体的过程 Multi-organism process; B12． 涉及多细胞有机体的过程 Multicellular organismal process; B13． 色素沉积 Pigmentation;
B14． 生殖 Reproduction; B15． 生殖过程 Reproductive process; B16． 对刺激的反应 Response to stimulus．
表 2 Unigene 数量最多的 10 个代谢通路
Tab. 2 Top ten metabolic pathways involving Paulownia unigenes
编号
ID
代谢通路名称
Name of pathway
Unigene 数目
Number of unigenes
所占百分比
Percentage of unigenes (% )
ko04141 内质网中的蛋白质加工 Protein processing in endoplasmic reticulum 1 034 2. 37
ko03010 核糖体 Ribosome 962 2. 21
ko03013 RNA 转运 RNA transport 956 2. 20
ko04075 植物激素信号转导 Plant hormone signal transduction 953 2. 19
ko03040 剪切体 Spliceosome 922 2. 12
ko00230 嘌呤代谢 Purine metabolism 795 1. 83
ko00010 糖酵解 Glycolysis /Gluconeogenesis 785 1. 80
ko04120 泛素介导的蛋白质降解 Ubiquitin mediated proteolysis 757 1. 74
ko00190 氧化磷酸化 Oxidative phosphorylation 718 1. 65
ko03008 真核生物中的核糖体合成 Ribosome biogenesis in eukaryotes 647 1. 49
考数据(Barash et al．，2010)，这对非模式植物转录
组研究尤为重要。Sloan 等(2012)为了最大限度地
找蝇子草属 Silene vulgaris 的多态性序列 ( SNP 和
SSR)，将麦瓶草 3 个亚群混合在一起进行了转录组
测序和从头组装，得到了很好的结果。因此，本研究
将 8 个泡桐相同组织材料混匀测序，目的就是在目
前几乎没有泡桐遗传信息的情况下获得准确度高、
覆盖度广、信息全面的转录组数据，为泡桐分子生物
学研究奠定坚实基础。众所周知，植物具有多倍性、
异质性、重复序列多和基因复杂程度高等特点，其转
录组从头组装较为困难( Schatz et al．，2012)。本研
究也曾使用软件 Trinity 进行泡桐转录组的从头组
装，但效果不能使人满意，随后转为使用 Velvet 和
Oases 2 个软件组装，得到 unigene 的 N50 值为
2 278 bp，该组装方法在闭鞘姜属 Costus pictus 的转
录组中也得到了应用，其 unigene N50 值达到了
1 353 bp(Annadurai et al．，2012)。该方法的优势在
于 Oases 软件使用了复合 k-mer 算法，可消除重复序
列对真正序列重叠的影响，提高组装的精确度
(Zerbino et al．，2008; Schulz et al．，2012)。此外，利
用这个信息平台，本研究将泡桐 unigene 映射到木
质素合成相关途径中，发现了一些参与木质素合成
的泡桐 unigene，为以后开展泡桐材质研究提供了数
据支撑。尽管 BLAST 结果表明，本试验得到的
43
第 6 期 邓敏捷等: 基于 Illumina 高通量测序的泡桐转录组研究
unigene 并不能覆盖整个泡桐蛋白编码区，但这些数
据仍是国内外迄今包含基因最多的泡桐基因表达信
息平台，为以后泡桐功能基因的发掘利用、特异
miRNA 的功能分析及基因组测序、分子育种等奠定
基础。
参 考 文 献
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(责任编辑 徐 红)
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