全 文 ：第 50 卷 第 8 期
2 0 1 4 年 8 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 50，No. 8
Aug．，2 0 1 4
doi:10．11707 / j．1001-7488．20140816
收稿日期: 2014 － 02 － 17; 修回日期: 2014 － 04 － 07。
基金项目: 国家自然科学基金项目(30872025; 31170602)。
* 田国忠为通讯作者。
泡桐丛枝植原体河北平山和江西吉安株系
胸苷酸激酶基因多态性分析*
宋传生1 胡佳续2 林彩丽1 任争光1 耿显胜3 田国忠1
(1． 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 国家林业局森林保护学重点实验室 北京 100091;
2． 天津出入境检验检疫局 天津 300457; 3． 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 富阳 311400)
摘 要: 设计引物并 PCＲ 扩增河北平山株系 PaWBPs 和江西吉安株系 PaWBJan 的 tmk 基因，直接和克隆测定
tmk 序列，利用 DNAMAN，MEGA 等软件进行序列多样性、序列变异、蛋白功能域、系统进化等比较分析。结果表明:
从 PaWBPs 和 PaWBJan 中克隆测序的 93 条和 41 条 tmk-a 中，分别有 52 和 24 种不同的序列，tmk-a OＲF 可被划分
为 2 类，tmk-a-1 为 639 bp，tmk-a-2 为 627 bp，PaWBPs 株系 tmk-a-1 与 tmk-a-2 序列条数的比值约为 2. 5，而 PaWBJan
株系为 3. 3; PaWBPs 有 5 个相同的 tmk-a-1 序列与 PaWBJan 的一个 tmk-a-1 序列及枣疯植原体 tmk-Y 序列完全一
致。因多位点突变，PaWBPs 含假基因比例达 48. 1%，PaWBJan 的为 41. 7% ; tmk-b 基因为单一序列，两株系的 tmk-
b 核酸序列相似性为 99. 8%，编码蛋白仅有一个氨基酸差异。TMK-a 和 TMK-b 中都具有胸苷酸激酶的 3 个保守功
能域。系统进化分析显示，泡桐丛枝植原体的 2 个株系的所有 tmk-a 序列都与枣疯植原体 tmk-X 和 tmk-Y 等聚为一
个进化枝Ⅰ中; 而 tmk-b 与小麦蓝矮 tmk-2 等聚为另一进化枝Ⅲ，基于 tmk-b 序列和基于 16S rDNA 序列构建的系统
进化树一致，tmk-b 有助于植原体 16Sr 组水平的分类，而 tmk-a 可用于植原体株系变异和遗传多样性分析。
关键词: 泡桐丛枝植原体; 胸苷酸激酶基因; 假基因; 功能域; 变异; 系统进化
中图分类号: S763. 14 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2014)08 － 0108 － 11
Thymidylate Kinase Gene Polymorphism of Two Strains of
Paulownia Witches’-Broom Phytoplasma
Song Chuansheng1 Hu Jiaxu2 Lin Caili1 Ｒen Zhengguang1 Geng Xiansheng3 Tian Guozhong1
(1 ． Key Laboratory of Forest Protection of State Forestry Administration Ｒesearch Institute of Forest Ecology，Environment and Protection，
CAF Beijing 100091; 2 ． Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Tianjin 300457;
3 ． Ｒesearch Institute of Subtropical Forestry，CAF Fuyang 311400)
Abstract: The diversity，variation，predicted protein function domains and evolution of thymidylate kinase gene
( tmk)，which was obtained by cloning DNA sequencing of PCＲ products with designed primer from paulownia witches’-
broom phytoplasmas Pingshan strain (PaWBPs) in Hebei Province and Ji’an strain (PaWBJan) in Jiangxi Province were
comparatively analyzed by DNAMAN and MEGA software． The 52 and 24 different tmk-a homologues respectively from the
cloned 93 sequences of PaWBPs and 41 of PaWBJan in total were identified，whereas the tmk-b gene sequence was
relatively conserved，with 99. 8% similarity and only one amino acid variation of the predicted proteins between the two
strains． All tmk-a OＲFs were classified into tmk-a-1 (639 bp) and tmk-a-2 (627 bp) ． The ratio of tmk-a-1 / tmk-a-2 in
PaWBPs and PaWBJan was 2. 5 and 3. 3，respectively． Five cloned tmk-a-1 sequences of PaWBPs were the same as one in
PaWBJan as well as tmk-Y of jujube witches’ broom phytoplasma． In addition，PaWBPs and PaWBJan respectivety
contained up to 48. 1% and 41. 7% of predicted tmk-a pesudogenes in total tmk-a due to the multiple locus mutation．
Ｒich sequence variability was found in tmk-a homologues of PaWBPs and PaWBJan and there existed three functional
domains in amino acid sequences of both tmk-a and b which are necessary for thymidylate kinase activity． The phylogenetic
analysis showed that all the tmk-a homologues of both strains with tmk-X and Y were clustered into clade I，while tmk-b
with wheat blue dwarf tmk-2 into clade III，suggesting that tmk-b nucleotide sequences consistent with highly conserved
第 8 期 宋传生等: 泡桐丛枝植原体河北平山和江西吉安株系胸苷酸激酶基因多态性分析
16S rDNA could be used for the classification of phytoplasmas on 16Sr group levels whereas diverse tmk-a might be helpful
for analyzing the genetic variation and diversity of different phytoplasma strains．
Key words: paulownia witches’-broom phytoplasma; thymidylate kinase gene; pesudogene; functional domain;
variation; phylogenesis
泡 桐 ( Paulownia sp． ) 丛 枝 病 ( paulownia
witches’-broom，PaWB)是由植原体引起的一种重要
林木病害。植原体隶属柔膜菌纲，不具细胞壁，专性
寄生于寄主植物韧皮部的筛管及介体昆虫的唾液
腺、血淋巴、肠道等组织细胞内，能够引起植物丛枝、
矮化、黄化、花变绿及花变叶等症状，是一类重要的
植物病原原核生物。依据 16S rＲNA 和核糖体蛋白
基因( rp)序列分析结果，我国泡桐丛枝植原体被归
为 16SrI 组 ( aster yellows group，翠菊黄化组) D 亚
组，也是该亚组的唯一成员。泡桐丛枝病在我国发
生和分布于北至山海关、南至长江流域的广大范围
内(Tian et al．，1996)，是国内极具代表性的植原体
病害，具有重要的研究价值。
胸苷酸激酶［thymidylate kinase，TMP kinase
(TMK); EC 2. 4. 7. 9］广泛存在于各种生物中，可催
化磷酰基从 ATP 转移到 dTMP 形成 dTDP，是 dTTP
从头合成和补救途径的关键酶，在 DNA 复制和生物
的生存中不可或缺。该酶提供 DNA 合成和修复所
必需的 dTTP，对植物合子的第 1 次分裂、早期种子
的萌 发 具 有 至 关 重 要 的 作 用 ( Ｒonceret et al．，
2008); 酿酒酵母( Saccharomyces cervisiae)和拟南芥
(Arabidopsis thaliana)胸苷酸激酶基因的表达会受
到细胞周期的调节(Ｒonceret et al．，2008; Sclafani et
al．，1984; White et al．，1987)。Miyata 等(2003)首
次对日本洋葱黄化植原体的 tmk 基因进行了克隆、
测序、原核表达和体外酶活性测定，并发现了序列多
样性。之后的研究发现，已测序的翠菊黄化丛枝
(AYWB)、洋葱黄化(OY-M)、苹果丛簇(Candidatus
phytoplasma mali strain AT)及澳大利亚葡萄黄化
(Candidatus phytoplasma australiense)等植原体的基
因组 中 存 在 着 多 拷 贝 的 潜 在 移 动 单 元 PMUs
(potential mobile units)，PMUs 是由一系列包括 tmk
基因在内的与 DNA 的合成、修复及重组、核苷酸的
合成及转运相关的基因形成的基因簇，并推断类似
转座的机制是不同植原体中存在多个 tmk 基因拷贝
的原因(Tran-Nguyen et al．，2009; Bai et al．，2006)。
徐启聪(2009)发现了与不同地区枣树品种相关的
枣疯植原体不同 tmk 基因型。尽管洋葱黄化和小麦
蓝矮植原体的 tmk 基因已被原核表达、纯化及体外
酶活性测定(Miyata et al．，2003; 李蓓等，2008)，然
而，tmk 基因的功能以及 tmk 多拷贝的存在对植原
体的生存、繁殖、致病性等方面的深层意义依然未知
(Hogenhout et al．，2010)。
本研究选取分布于我国地区环境条件明显不同
的河北平山和江西吉安 2 个泡桐丛枝植原体株系
PaWBPs 和 PaWBJan 为材料，首次从中克隆了许多
不同类型的 tmk 基因，预测了 TMK 功能域并对基因
序列进行了变异位点及系统进化分析比较，以便明
确该植原体的 tmk 基因特征和株系间变异规律，为
进一步开展泡桐丛枝植原体 TMK 原核表达、纯化、
酶活性测定及功能研究奠定了基础，并为植原体的
分子分类、鉴定、遗传多样性及植原体基因的同源重
组研究提供新的线索。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 供试样品 泡桐丛枝植原体河北平山株系
和江西吉安株系保存在本实验室发病组培苗中，编
号分别为 PaWBPs 和 PaWBJan; 前者来自于华北地
区的河北省石家庄市平山县，为泡桐丛枝重病区，后
者来自长江流域的江西省吉安市吉安县，为零星病
区。健康泡桐材料为本实验室组培苗 9501。
1. 1. 2 主要试剂和仪器 2 × Taq Mix、DNA 凝胶回
收试剂盒、植物基因组 DNA 提取试剂盒、DNA
Marker、大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α 感受态购
自天根生化科技有限公司; pMD18-T 载体购自
Takara 公司; 其他化学试剂为国产分析纯。
1. 2 植物基因组 DNA 的提取
参照天根生化科技有限公司植物基因组 DNA
提取 试 剂 盒 说 明 书 ( DP305-02 ) 提 取 PaWBPs，
PaWBJan 及健康泡桐 9501 总 DNA，取样量为 0. 1 g
叶片，DNA 用 100 μL TE 溶解。
1. 3 PCＲ 扩增及序列测定
利用引物 tmka-N(5’-TTG AAT TCC ATA TGA
AAT TAA TCG TTT TTG AAG GAC T-3’) / tmka-C
(5’-TGA GCT CGA GTT AGT TAT GAT CGC CAT
TTG ATA GTA CT-3’) 扩增 PaWBPs 和 PaWBJan
tmk-a 基因(Miyata et al．，2003); 根据已报道植原体
OY，AYWB 的 tmk-b 基 因 序 列，设 计 引 物
PaWBtmkbF(5’-ATG TTT ATT TCT TTT GAA GGT-
901
林 业 科 学 50 卷
3’) / PaWBtmkbＲ(5’-TCA TAA TTC TAT TTG AAA
GAC-3’)扩增 PaWBPs 和 PaWBJan tmk-b 基因。
利用引物 rp ( I) F1A ( 5’-TTT TCC CCT ACA
CGT ACT TA-3’) / rp( I)Ｒ1A(5’-GTT CTT TTT GGC
ATT AAC AT-3’)及 rp(V) F1A(5’-AGG CGA TAA
AAA AGT TTC AAA A-3’) / rp ( V ) Ｒ1A ( 5’-GGC
ATT AAC ATA ATA TAT TAT G-3’)验证泡桐丛枝
组培 苗 PaWBPs 和 PaWBJan 不 含 枣 疯 植 原 体
( JWB)(Martini et al．，2007)。
PCＲ 反应体系: 25 μL 反应体系中含有 2 × Taq
Mix 12. 5 μL，DNA 1 μL，10 mmol·L － 1正反向引物各
0. 5 μL，ddH2O 10. 5 μL。
PCＲ 反应条件: 94 ℃预变性 4 min; 94 ℃变性
30 s，55 ℃ ( tmk-a、tmk-b) /50 ℃ ( rp) 退火 30 s，
72 ℃延伸 45 s( tmk-a、tmk-b) /80 s( rp)，35 个循环;
72 ℃ 10 min; 4 ℃保温。
将 PCＲ 产物送北京华大基因公司测序，当 PCＲ
产物直接测序不成功时，将切胶纯化的 tmk-a 和
tmk-b 基因克隆到 pMD18-T 载体上，转化到 DH5α
感受态大肠杆菌中，分别挑取约 100 个单菌落送华
大基因公司测序。
1. 4 序列分析
利用 DNAMAN 进行序列的拼接、比对，利用
MEGA5. 1 分析序列变异位点及构建进化树。
2 结果与分析
2. 1 tmk-a 和 tmk-b 基因的 PCＲ 扩增
分 别 利 用 引 物 对 tmka-N / tmka-C 和
PaWBtmkbF /PaWBtmkbＲ，从 PaWBPs 和 PaWBJan
基因组 DNA 中扩增到了大小分别约为 640 bp 和
620 bp 的 tmk-a 和 tmk-b 基因; 健康泡桐 9501 基因
组未扩增到特异性片段。
2. 2 tmk-a 和 tmk-b 的序列多样性
PaWBPs 和 PaWBJan 的 tmk-a PCＲ 产物送北京
华大基因公司测序，测序峰图都表现为杂峰，可能是
由于 PCＲ 产物中存在着多种不同的 tmk-a 序列，因
此将 tmk-a 基因进行克隆测序。
在挑取的所有单菌落中，成功测得 93 个
PaWBPs tmk-a 克隆，其中共有 52 种不同的序列，序
列彼此间完全相同的为 PaWBPs tmk-a clone 5，13，
41，72，80 (占 PaWBPs tmk-a 克隆数的 5. 4% );
PaWBPs tmk-a clone 1，8，10，12，17，24，28，34，35，
36，38，43，53，54，56，57，60，65，66，68，70，81，89，90
(25. 8% )，为优势序列; PaWBPs tmk-a clone 33，69
(2. 2% )。成功测定的 41 个 PaWBJan tmk-a 克隆
中，共有 24 种不同的序列，序列完全一致的为
PaWBJan tmk-a clone 1，19(占 PaWBJan tmk-a 克隆
数的 4. 9% ); PaWBJan tmk-a clone 14，20(4. 9% );
PaWBJan tmk-a clone 2，4，5，6，8，9，10，16，18，21，
22，25，31 (31. 7% )，为优势序列; PaWBJan tmk-a
clone 29，35 (4. 9% ); PaWBJan tmk-a clone 30，36，
37 ( 7. 3% )。 PaWBPs 与 PaWBJan 之间，占优势
PaWBPs tmk-a clone 5 序列和 PaWBJan tmk-a clone
12 序列完全一致。
对 PaWBPs 和 PaWBJan tmk-a 所有序列的开放
性阅读框(OＲF)预测后发现，能够编码完整 OＲF 的
序列可以被划分为 tmk-a-1(639 bp)和 tmk-a-2(627
bp)2 大类，tmk-a-1 在 225 位碱基后比 tmk-a-2 多了
GTTCTTCAATTA 的一段序列(226 ～ 237 bp)。52 种
不同的 PaWBPs tmk-a 序列中，tmk-a-1 共 11 个，为
PaWBPs tmk-a clone 5，23，25，26，27，31，45，49，55，
61，67; tmk-a-2 共 16 个，为 PaWBPs tmk-a clone 1，
9，32，37，42，44，46，48，52，59，62，66，73，77，82，88。
24 种 PaWBJan tmk-a 序列中，tmk-a-1 共 6 个，为
PaWBJan tmk-a clone 3，12，13，24，34，41; tmk-a-2
共 8 个，为 PaWBJan tmk-a clone 7，11，15，17，20，21，
23，39。另外，PaWBPs 株系 tmk-a-1 与 tmk-a-2 序列
条数的比值为 2. 5，而 PaWBJan 株系为 3. 3。
测定的所有序列中，除了上述能编码完整 OＲF
的 tmk-a 基因外，PaWBPs，PaWBJan tmk-a 中分别有
25 和 10 个因碱基插入、缺失及突变形成的 tmk-a 预
测假基因(表 1)，占 PaWBPs 和 PaWBJan tmk-a 克隆
序列的比例分别为 48. 1%和 41. 7%。
PaWBPs 和 PaWBJan tmk-b 基因 PCＲ 产物直接
测序峰图表现为单峰，基因序列单一。
2. 3 tmk 基因序列位点变异分析
在 tmk-a-1 和 tmk-a-2 序列中出现频率较高(易
变位点)的单碱基突变(碱基替换)位点为第 39(A /
G)，71(A /T)，72(A /C)，102(T /C)，128(A /G)，166
(T /G)，169(A /T)，175 (C /T)，202 ( T /G)，223 (A /
T)，244(A /C)，303 ( T /C)，309 (C /T)，330 (C /A)，
351(A /G)，352 ( T /A)，354(G /A)，379 (A /C)，402
(T /C)，412(A /C)及 426(T /C)位，在以上碱基替换
中，碱基转换的概率为 47. 6%，碱基颠换的概率为
52. 4%。另外序列中还存在出现频率很低的碱基替
换位点为，第 40 ( A /T)，41 ( A /T)，80 ( C /T)，107
(G /T)，120(T /C)，136 (G /A)，157 (C /G)，161 ( T /
C)，209(T /A)，210(C /A)，240(A /G)，241(A /G)，
242(A /G)，262 (G /A)，286 (G /A)，314(A /T)，343
(A /G)，350(A /G)，373(A /G)，391(A /C)，396( T /
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第 8 期 宋传生等: 泡桐丛枝植原体河北平山和江西吉安株系胸苷酸激酶基因多态性分析
C)，401(A /G)，432(G /A)，507(A /G)，537( T /G)，
579(A /G)，592(C /A)，599( T /C)及 639(A /T)位，
在以上碱基替换中，碱基转换的概率为 65. 5%，碱
基颠换的概率为 34. 5%。对所有碱基替换的类型
统计后发现，tmk 序列中碱基转换的概率为 58. 0%，
碱基颠换的概率为 42. 0% ; A 与 G、T 与 C、A 与 C、
T 与 G、A 与 T、G 与 C 之间替换的概率分别为
36%，22%，16%，8%，16%和 2%。
表 1 从 PaWBPs 和 PaWBJan 株系中克隆到的不同 tmk 序列①
Tab. 1 All cloned different sequences of tmk-a and tmk-b from PaWBPs and PaWBJan strains
克隆号
Clone No．
大小
Size / bp
类型
Type
登录号
GenBank No．
克隆号
Clone No．
大小
Size / bp
类型
Type
登录号
GenBank No．
Ps 1 627 tmk-a-2 KJ452492 Ps 66 627 tmk-a-2 KJ452531
Ps 2 626 ψ KJ452493 Ps 67 639 tmk-a-1 KJ452532
Ps 3 626 ψ KJ452494 Ps 73 627 tmk-a-2 KJ452533
Ps 5 639 tmk-a-1 KJ452495 Ps 76 628 ψ KJ452534
Ps 6 626 ψ KJ452496 Ps 77 627 tmk-a-2 KJ452535
Ps 7 628 ψ KJ452497 Ps 78 629 ψ KJ452536
Ps 9 627 tmk-a-2 KJ452498 Ps 79 628 ψ KJ452537
Ps 11 627 ψ KJ452499 Ps 82 627 tmk-a-2 KJ452538
Ps 14 625 ψ KJ452500 Ps 84 627 ψ KJ452539
Ps 15 628 ψ KJ452501 Ps 85 627 ψ KJ452540
Ps 16 627 ψ KJ452502 Ps 86 629 ψ KJ452541
Ps 18 627 ψ KJ452503 Ps 88 627 tmk-a-2 KJ452542
Ps 19 628 ψ KJ452504 Ps 93 628 ψ KJ452543
Ps 20 628 ψ KJ452505 Ps tmk-b 624 tmk-b KJ452545
Ps 22 628 ψ KJ452506 Jan 3 639 tmk-a-1 KJ452468
Ps 23 639 tmk-a-1 KJ452507 Jan 7 627 tmk-a-2 KJ452469
Ps 25 639 tmk-a-1 KJ452508 Jan 11 627 tmk-a-2 KJ452470
Ps 26 639 tmk-a-1 KJ452509 Jan 12 639 tmk-a-1 KJ452471
Ps 27 639 tmk-a-1 KJ452510 Jan 13 639 tmk-a-1 KJ452472
Ps 31 639 tmk-a-1 KJ452511 Jan 15 627 tmk-a-2 KJ452473
Ps 32 627 tmk-a-2 KJ452512 Jan 17 627 tmk-a-2 KJ452474
Ps 33 628 ψ KJ452513 Jan 19 627 ψ KJ452475
Ps 37 627 tmk-a-2 KJ452514 Jan 20 627 tmk-a-2 KJ452476
Ps 39 628 ψ KJ452515 Jan 21 627 tmk-a-2 KJ452477
Ps 40 628 ψ KJ452516 Jan 23 627 tmk-a-2 KJ452478
Ps 42 627 tmk-a-2 KJ452517 Jan 24 639 tmk-a-1 KJ452479
Ps 44 627 tmk-a-2 KJ452518 Jan 26 626 ψ KJ452480
Ps 45 639 tmk-a-1 KJ452519 Jan 27 638 ψ KJ452481
Ps 46 627 tmk-a-2 KJ452520 Jan 28 628 ψ KJ452482
Ps 48 627 tmk-a-2 KJ452521 Jan 30 627 ψ KJ452483
Ps 49 639 tmk-a-1 KJ452522 Jan 32 629 ψ KJ452484
Ps 52 627 tmk-a-2 KJ452523 Jan 33 628 ψ KJ452485
Ps 55 639 tmk-a-1 KJ452524 Jan 34 639 tmk-a-1 KJ452486
Ps 58 629 ψ KJ452525 Jan 35 628 ψ KJ452487
Ps 59 627 tmk-a-2 KJ452526 Jan 38 638 ψ KJ452488
Ps 61 639 tmk-a-1 KJ452527 Jan 39 627 tmk-a-2 KJ452489
Ps 62 627 tmk-a-2 KJ452528 Jan 40 640 ψ KJ452490
Ps 63 628 ψ KJ452529 Jan 41 639 tmk-a-1 KJ452491
Ps 64 638 ψ KJ452530 Jan tmk-b 624 tmk-b KJ452544
①ψ: 预测的假基因 Predicted pseudogene．
对序列的变异位点比较后发现，除了无规律的
单个或几个碱基的变异之外，多条 tmk-a 序列表现
出有规律的变异，这些序列中的突变碱基都位于易
变位点，并且突变的碱基不是随机地分布在易变碱
基的位点上，而是在连续的多个易变位点上发生碱
基的突变，比如在表 2 中，相对于 a 类型的序列，d
类型的序列仅在 303 bp 后面的每个易变位点都发
生突变，而 g 类型的序列仅在 303 bp 前面的每个易
变位 点 全 部 发 生 突 变 (表 2 )。对 PaWBPs 和
PaWBJan tmk-a 变异类型统计后发现，a，b，c，d，e，f，
g，h 各类型在 tmk-a 中的比例分别为 7. 3%，2. 4%，
2. 4%，24. 4%，2. 4%，4. 9%，51. 2%和 2. 4%。
111
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表 2 PaWBPs，PaWBJan tmk-a 基因序列易变位点①
Tab. 2 Mutable nucleotide sites in PaWBPs and PaWBJan tmk-a genes
39 71 72 102 128 166 169 175 202 223 244 246 303 309 330 351 352 354 379 402 412 426 438 494 495 510 511 520 561 582
a A A A T A T A C T A A C T C C A T G T T A T A C C C A C T C
b C T A
c C T A G A A
d C T A G A A C C C C T A T T G A C T
e G T C C G C T A G A A
f G T T G T C T
g G T C C G G T T G T C T
h G T C C G G T T G T C T C C C C T A T T G A C T
①a． PaWBPs tmk-a clone 3; b． PaWBPs tmk-a clone 61; c． PaWBPs tmk-a clone 25; d． PaWBJan tmk-a clone 12; e． PaWBJan tmk-a clone 34;
f． PaWBJan tmk-a clone 15; g． PaWBJan tmk-a clone 7; h． PaWBPs tmk-a clone 46．
对 35 条 tmk-a 假基因序列分析后发现，共 9 个
位点的碱基突变导致了 tmk-a 的编码提前终止并形
成了与功能基因序列相似但丧失了原有功能的假基
因(表 1)。tmk-a 序列易在第 46 和 47 位之间插入
碱基 T ( PaWBPs tmk-a clone 20，33，58，79，93，
PaWBJan tmk-a clone 32，33，35)、第 167 和 168 位之
间插入碱基 A(PaWBPs tmk-a clone 7，11，16，19，39，
63，76，84，85，PaWBJan tmk-a clone 28，30)、第 367
位缺失碱基 A( PaWBPs tmk-a clone 2，3，14，18，22
及 PaWBJan tmk-a clone19，27)、第 434 位缺失碱基
A( PaWBPs tmk-a clone 6 及 PaWBJan tmk-a clone
26)、第 583 和 584 位之间插入碱基 A(PaWBPs tmk-
a clone 15)、第 439 位碱基 C 突变为 T(PaWBPs tmk-
a clone 40 )、第 145 位缺失碱基 T ( PaWBPs tmk-a
clone 64)、第 18 和 19 位碱基之间插入 T( PaWBJan
tmk-a clone 38 )、第 83 和 84 位碱基之间插入 C
(PaWBJan tmk-a clone 40)。在 35 条 tmk-a 假基因
中，以上突变类型出现的概率分别为 22. 9%，
31. 4%，20. 0%，5. 7%，2. 9%，2. 9%，2. 9%，2. 9%
和 2. 9%。
2. 4 TMK 功能域预测
所有生物 TMK 氨基酸序列中都含有 3 个保守
功能域，即位于 N 端的磷酸基供体结合区 ( the
phosphate-binding motif，P-loop )，序列特征为 N’-
GXXGXGKT-C’(X 代表多种氨基酸); 核苷单磷酸
结合区(TMP binding motif)N’-DＲXXXSXXAYQ-C’
以及位于 C 端的磷酸供体结合位点 ( the LID
domain)。
将 PaWBPs、PaWBJan 与 OY、AYWB、枣疯植原
体( JWB )、小麦蓝矮植原体 (WBD )、大肠杆菌
BL21、Canarypox virus、拟南芥、Acholeplasma laidiawii
等的 TMK 氨基酸序列比对后发现(图 1)，PaWBPs
和 PaWBJan TMK 中都具有上述 3 个保守功能域，并
且 PaWBPs，PaWBJan，OY，WBD 及 JWB 的 TMK-a
和 TMK-b 功能域序列分别完全一致。 PaWBPs，
PaWBJan TMK-a 的 P-loop，TMP binding motif 及 LID
分别为 N’-GLDGSGKT-C’，N’-DＲWLPSTAYQ-C’，
N ’-IGＲTＲKK-C ’; TMK-b 则 分 别 为: N ’-
GCEGTGKT-C ’， N ’-DＲYLDSTIAYQ-C ’， N ’-
IGＲQＲVK-C’。因 此 可 推 断 PaWBPs， PaWBJan
TMK 可能具有与其他植原体 TMK 相同的催化功能
(Miyata et al．，2003; 李蓓等，2008)。然而比对结
果还显示，在核苷单磷酸结合区前端(N 端)9 个氨
基酸处，Ps TMK-a-2，Jan TMK-a-2，OY PAM_521(OY
TMK-a)，WBD TMK － 1 比 Ps TMK-a-1，Jan TMK-a-
1，JWB TMK-x，JWB TMK-y 少了 4 个氨基酸 IVPQ;
比 Ps TMK-b，Jan TMK-b，AYWB_492，OY PAM_230
(OY TMK-b)，WBD TMK-2 少了 4 个氨基酸 IIFA。
二级结构、信号肽及跨膜结构预测结果表明，α-
螺旋 ( α-helix ) 和不规则卷曲 ( Ｒandom coil ) 是
PaWBPs，PaWBJan TMK-a 和 TMK-b 的主要结构元
件，延伸链(Extend strand)和 β －转角(β-turn)散布
于整个肽链中; PaWBPs，PaWBJan 的 TMK 不含有
信号肽和跨膜结构，在植原体的细胞质中发挥功能。
2. 5 tmk 基因序列相似性及系统进化分析
利用 MEGA5. 1 对植原体以及其他物种的 tmk 基
因进行了系统进化分析，构建了系统进化树，该进化
树可被划分为 5 个大的分支Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ(图 2A)。
由于植原体 tmk 基因多而杂，为了便于描述，把与
PaWBPs tmk-b，PaWBJan tmk-b 聚为一支(图 2E)的植
原体 tmk 以及其他物种的 tmk 归为一大类型 IV，统称
为 tmk-b，该类型的 tmk 在每种植原体中序列单一; 其
余Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅴ分枝的 tmk 归为另一大类型，统称为 tmk-
a，该类型的特点是 tmk 拷贝数多。
211
第 8 期 宋传生等: 泡桐丛枝植原体河北平山和江西吉安株系胸苷酸激酶基因多态性分析
图 1 植原体及其他生物 TMK 氨基酸
序列中的 3 个保守功能区
Fig． 1 Three functional domains in phytoplasmal TMK
amino acid sequences and other organisms
图中 的 框 表 示 在 PaWBPs 和 PaWBJan TMK-2，OY
PAM521，WBD TMK-2，JWBTMK-x 氨基酸序列中缺失
DXPX 4 个氨基酸。Boxed residues indicate the deletion
of DXPX sites in PaWBPs ＆ PaWBJan TMK-a-2，OY
PAM521，WBD TMK-2 and JWB TMK-x．
2. 5. 1 泡桐丛枝植原体中含有和枣疯植原体相同
的 tmk-a 基因序列 在进化树 (图 2) 中，PaWBPs，
PaWBJan 的 所 有 tmk-a 基 因 和 JWB tmk-X
(GU196274 )，JWB tmk-Y ( GU196274 )，WBD tmk-1
(EU183350)，OY-M tmk4 ( PAM _521 /AP006628. 2)
以 及 loofah witches ’-broom phytoplasma tmk
(AF251151. 1)聚为一个大的分支Ⅰ(图 2B)，该分
支中除了 JWB 隶属 16SrV 组外，其余全为 16SrI 组
植原体。分支 I 中 PaWBPs 与 PaWBJan 的 tmk-a 核
苷酸序列相似性为 94. 2% ～ 99. 8% ; PaWBPs，
PaWBJan tmk-a 基因与 JWB tmk-Y，WBD tmk-1，OY-
M tmk4 以及 loofah witches’-broom phytoplasma tmk
的核苷酸序列相似性分别为 93. 0% ～ 97. 8%，
90. 7% ～ 93. 3%，87. 2% ～ 88. 8% 和 71. 8% ～
73. 4%。而引人注意的是，进化树中 PaWBPs tmk-a
clone 5 和 JWB(隶属 16SrV 组) tmk-Y 完全一致(徐
启聪， 2009 )。 为 了 排 除 提 取 的 PaWBPs 和
PaWBJan DNA 中 JWB DNA 的污染，利用植原体核
糖体蛋白基因 rp 的 16SrI 和 16SrV 组特异性引物 rp
(Ⅰ)F1A / rp(Ⅰ) Ｒ1A 和 rp (Ⅴ) F1A / rp (Ⅴ) Ｒ1A
对 PaWBPs 和 PaWBJan 进行了 PCＲ 检测(Matini et
al．，2007)，引物 rp(Ⅰ) F1A / rp(Ⅰ)Ｒ1A 从 PaWBPs 和
aWBJan 基因组 DNA 中扩增到了大小为 1 200 bp 的
目的条带(图 3A)，而 rp(Ⅴ)F1A / rp(Ⅴ)Ｒ1A 则未扩
增到该条带 (图 3B )，因此可以断定 PaWBPs 和
PaWBJan 基因组 DNA 中未有 JWB DNA 的污染，
PaWBPs 中的确含有和 JWB tmk-Y 完全一致的序列。
2. 5. 2 植原体 tmk-a 序列多样性丰富而 tmk-b 序列
单一 同种植原体中存在着序列差异较大的 tmk-a，
各种植原体都具有 tmk-a 序列多样性。例如，大部
分 Ca． Phytoplasma australiense tmk 序列和部分 SLY
( strawberry lethal yellows phytoplasma) tmk 序列聚为
一个大的分 支 Ⅱ (图 2C )，而 Ca． Phytoplasma
australiense tmk6，tmk8 则分布在进化树的分支Ⅲ中
(图 2D)，部分 SLY tmk 序列被聚在第Ⅴ分支中(图
2F)。分支Ⅱ中，Ca． Phytoplasma australiense 和 SLY
之间的 tmk 基因核苷酸序列相似性为 90. 8% ～
93. 7%。分支 Ⅱ 和分支 Ⅲ 中的 Ca． Phytoplasma
australiense tmk 序列差异较大，核苷酸序列相似性
为 57. 2% ～ 59. 1% ; 分支Ⅱ和分支Ⅴ中的 SLY tmk
序列间相似性仅为 47. 9% ～ 49. 3%。 JWB tmk-X，
JWB tmk-Y 与 PaWBPs 及 PaWBJan 的 tmk-a 关系最
近，被聚在分支Ⅰ中; 而 JWB tmk-Z 被聚类在分支
Ⅲ中，JWB tmk-Z 与 JWB tmk-X，JWB tmk-Y 的核苷
酸序列相似性仅为 62. 3%，62. 9%。另外，进化树
的分支 Ⅲ 中还分布着 OY-M tmk2、tmk5，AYWB
311
林 业 科 学 50 卷
tmk1、tmk3、tmk4。
图 2 利用 MEGA5. 1 基于植原体 tmk 基因核苷酸序列构建的进化树
Fig． 2 Phylogenetic tree based on phytoplasmal tmk nucleotide sequences with MEGA5. 1 using the Neighbor-Joining method
A. 基于 tmk 基因核苷酸序列的进化树分支 Branches of phylogenetic tree based on phytoplasmal tmk nucleotide sequences; B. 分支ⅠBranch Ⅰ;
C. 分支ⅡBranch Ⅱ; D. 分支ⅢBranch Ⅲ; E. 分支ⅣBranchⅣ; F. 分支ⅤBranch Ⅴ ．
目前，已有许多物种的全基因组序列被测定，在
收集这些物种的 tmk 基因序列时发现，它们仅存在
着单拷贝的 tmk 基因(植原体除外)，并且和单拷贝
的植原体 OY-M tmk1 ( PAM _ 230 /AP006628. 2 )，
AYWB tmk5 ( AYWB _ 492 /CP000061. 2 )，Ca．
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第 8 期 宋传生等: 泡桐丛枝植原体河北平山和江西吉安株系胸苷酸激酶基因多态性分析
图 3 利用 16Sr 组特异性的 rp 引物进行的 PCＲ 扩增结果
Fig． 3 PCＲ amplification with 16Sr group-specific rp-based primers
A. 利用引物 rp ( I) F1A / rp ( I) Ｒ1A 进行的 PCＲ 扩增结果 PCＲ
amplification with 16SrI group-specific rp-based primers rp( I)F1A / rp
( I)Ｒ1A; B. 利用引物 rp(V)F1A / rp(V)Ｒ1A 进行的 PCＲ 扩增结
果 PCＲ amplification with 16SrV group-specific rp-based primers rp
(V) F1A / rp ( V ) Ｒ1A． 1. PaWBPs; 2. PaWBPs; 3. 健康泡桐
Healthy paulownia; 4. JWB; 5. 健康枣树 Healthy jujube．
Phytoplasma australiense tmk3 ( PA0169 /NC _
010544. 1)，Ca． Phytoplasma mali strain AT tmk-b
(CU469464. 1)，SLY tmk28 (NC_021236. 1)，Peanut
witches ’-broom phytoplasma tmk ( NZ _
AMWZ01000013. 1)以及本试验测定的 PaWBPs tmk-
b(序列号)，PaWBJan tmk-b(序列号)聚为一个大的
分支Ⅳ(图 2E)。由此可推断，分支Ⅳ中所有植原体
的 tmk 基因可能和其他物种 tmk 基因属于同一类
型，发挥着相同的功能，即编码的蛋白可催化 dTMP
形成 dTDP。分支Ⅳ中所有 tmk 基因之间核苷酸序
列的相似性为 36. 7% ～ 68. 8% ; 不同植原体 tmk 之
间的 相 似 性 为 45. 6% ～ 99. 8%。 PaWBPs 与
PaWBJan 的 tmk-b 核苷酸序列相似性为 99. 8%，氨
基酸序列相似性为 99. 5%，仅有 1 个氨基酸的差异
(PaWBPs 第 22 位的氨基酸为 E，而 PaWBJan 为
G)。 PaWBPs tmk-b 与 OY-M tmk1，WBD tmk-2，
AYWB tmk5，Phytoplasma mali strain AT tmk-b，Ca．
Phytoplasma australiense tmk3，SLY tmk28，Peanut
witches’-broom phytoplasma tmk 核苷酸序列相似性
分别为 99. 7%，95. 6 %，95. 4%，67. 0%，64. 1%，
63. 9%和 61. 9%。
虽然氨基酸序列中都含有 P-loop，TMP binding
motif 及 LID 功能域，但本试验测定的 PaWBPs，
PaWBJan 的 tmk-a 和 tmk-b 核苷酸序列相似性仅为
50. 3% ～ 52. 5%，氨 基 酸 序 列 相 似 性 为
25. 1% ～ 27. 1%。
由于植原体 tmk-a 基因序列拷贝多，序列丰富
多样，同种植原体 tmk-a 基因可分布在不同的分支
Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ中，因此 tmk-a 序列不能作为植原体
分类的参考基因。而分支Ⅳ中的所有植原体 tmk-b
基因以及其他物种的 tmk 基因都是单拷贝的，为了
确定这些单拷贝的 tmk 基因能否较好地用于植原体
分类，把植原体 tmk-b 基因以及其他物种的 tmk 基
因进行系统进化分析，结果表明，基于植原体 tmk-b
及其他物种 tmk 基因核苷酸序列构建的系统进化树
与基于植原体 16S rDNA 序列构建的系统进化树结
果一致(图 4)。
图 4 基于植原体 tmk-b 及其他物种 tmk 基因核苷酸序列构建的系统进化树
Fig． 4 Phylogenetic tree based on phytoplasmal tmk-b and many other species’tmk
genes constructed with MEGA 5. 1 using the Neighbor-Joining method
3 结论与讨论
由于植原体高度专性寄生的特点，其生长、繁
殖、变异等与寄主环境的变化密切相关。寄主环境
的变化可能会导致植原体不断的变异以确保自己正
常的生存繁衍。 tmk 是 DNA 合成、生物生存过程中
必不可少的基因，tmk 基因的多态性可能是植原体
适应寄主生境变化导致的。本研究选取气候等生境
511
林 业 科 学 50 卷
条件明显不同的河北平山和江西吉安泡桐丛枝病株
系为材料，对于植原体 tmk 基因多态性的研究具有
很强的代表性。
虽然已有多种植原体 tmk 基因序列被公布，但
本研究发现泡桐丛枝植原体比其他植原体含有更丰
富的 tmk 基因型。本研究首次从 2 个泡桐丛枝植原
体中克隆了大量 tmk 基因，了解了不同植原体株系
间的差异，揭示了 tmk-a 基因多拷贝性和丰富的序
列多样性。在已测序的植原体基因组中，与 DNA 复
制、重组、修复等相关的基因聚集在一块，两端为转
座酶插入序列，形成一个被称为 PMU 的基因簇，大
部分的 PMUs 中都含有 tmk 基因。通常，植原体基
因组中的 PMU 为多拷贝，tmk 基因多拷贝可能是由
PMU 复制型转座形成的( Tran-Nguyen et al．，2009;
Bai et al．，2006)。在 DNA 复制过程中，DNA 重组、
碱基的突变可能是植原体 tmk 序列多样性形成的原
因。要明确泡桐丛枝植原体基因组是否有类似的
PMU，全基因组测序尤为必要。
PaWBPs 和 PaWBJan 的 tmk 序列中存在着多种
变异。所有的 tmk-a-1 比 tmk-a-2 序列多了一段序
列 GTTCTTCAATTA(226 － 239 位)。许多 tmk 序列
中存在着单个或几个碱基的突变。另外多条 tmk-a
序列表现出有规律的变异，这些序列中的突变碱基
都位于易变位点，并且突变的碱基不是随机地分布
在易变位点上，而是在连续的多个易变位点上发生
碱基的突变(表 2)，对表 2 中的不同类型序列比较
后推测，或许是同源重组形成了这些类型的序列。
同源重组需要在一些蛋白的催化下完成，在基因组
已测序的 4 个植原体中存在着这些蛋白，如 Ca．
Phytoplasma mali 中的 ruvAB，ＲecU、重组酶 A、类似
ＲecG 的解螺旋酶、重组 DNA 修复蛋白 O 和 Ｒ; OY-
M，AYWB，Ca． Phytoplasma australiense 中的 ＲecA，
ＲecU，ruvA 及 ruvB 等(Kube et al．，2012)。目前，泡
桐丛枝植原体基因组序列未被测定，但其中很可能
也含有这些蛋白。虽然本研究未能揭示 tmk-a 序列
有规律变异的原因，但可能会为植原体基因同源重
组研究提供很重要的线索。
Davis 等(2003)第一个报道了推测不执行功能
的植原体假基因 ψfolP 和 ψfolK，OY-M 基因组也含
有 7 个预测的 tmk 假基因。本研究从 PaWBPs 和
PaWBJan 中克隆到了许多预测的 tmk 假基因序列。
有研究发现，假基因也可能存在功能，也许是产生基
因多样性的源泉，还常常与同源功能的基因重组产
生抗原多样性 (吴昊等，2005 ); 又如人类病菌
Neisseria menigitidis 的纤毛蛋白由 pilE / pilS 基因座
编码，它包含一个表达基因 pilE 和 8 个同源的沉默
基因片段，这些沉默基因可能与对寄主的免疫反应
有关(Andrews et al．，2004)。迄今，还没有关于植原
体假基因功能的报道，植原体 tmk 假基因有待于进
一步的深入研究。
由同一祖先基因重复和变异产生的一系列基因
称为基因家族( gene family)。重复和趋异是产生基
因家族的原因，一个完整的基因被加倍重复，并在一
些拷贝中积累突变而使自然选择向有利的方向进
行，然后该突变的拷贝可以进化形成新的功能，可能
在不同时期或地点表达，并获得不同的活性。家族
成员可以成簇存在，或分散在不同染色体中。虽然
一个结构基因家族的成员可以在不同时期或不同类
型的细胞中表达，但他们通常相互关联甚至具有相
同的功能; 而且大多数基因家族都有一些成员是假
基因(李明刚，2005)。根据已知植原体的 tmk 基因
特征的分析，笔者认为泡桐丛枝植原体 tmk-a 和
tmk-b 及其他可能未被鉴定的具有相同结构域和功
能域的众多同源基因构成了一个 tmk 基因家族。
Miyata 等(2003)和李蓓等(2008)分别对洋葱
黄化植原体 OY-M 和小麦蓝矮植原体 WBD 的 TMK
进行原核表达、纯化及体外酶活性测定后发现，OY-
M PAM _230 和 WBD TMK-2 都具有非常明显的
TMK 活性，而 OY-M PAM_521和 WBD TMK-1 几乎
没有酶活性。本研究中的 PaWBPs tmk-b，PaWBJan
tmk-b 与编码 OY-M PAM_230，WBD TMK-2 的基因
聚为一个大的分支 (图 2E)，并且 PaWBPs TMK-b，
PaWBJan TMK-b 都具有胸苷酸激酶必需的 P-loop，
TMP binding motif 及 LID 功能域(图 1)，据此可推断
PaWBPs TMK-b，PaWBJan TMK-b 在体外具有 TMK
酶活性。但仅仅根据原核表达蛋白进行的体外活性
测定结果判断 tmk-a 基因表达和功能尚需谨慎。比
如，拟南芥过氧化氢酶基因家族编码三种蛋白，
CAT1-3，其中不同蛋白的表达分别受氧应力、水杨
酸等不同因子的特异性诱导，CAT2 表达受干旱和
寒冷激活，而 CAT3 受脱落酸和衰老状态的刺激
(Du et al．，2008)。蛋白的三级结构通常会影响酶
活性，而蛋白的三级结构是由一级序列决定的，在
TMP binding motif 前端(N 端)9 个氨基酸处(图 1)，
具有胸苷酸激酶活性的 OY-M PAM _ 230，WBD
TMK-2 比没有活性的 PAM_521 和 WBD TMK-1 多
了 4 个 氨 基 酸，在 此 位 置，PaWBPs TMK-a-1，
PaWBJan TMK-a-1 比 PaWBPs TMK-a-2，PaWBJan
TMK-a-2 也多了 4 个氨基酸，这 4 个氨基酸是否能
影响酶活性还需进一步在侵染植物体内和体外试验
611
第 8 期 宋传生等: 泡桐丛枝植原体河北平山和江西吉安株系胸苷酸激酶基因多态性分析
验证。因在植原体中，补救途径是提供 dTTP 的唯
一方式，对繁殖极其重要的 tmk 多态性的产生和作
用机制、与植原体的致病性是否相关、在植原体侵染
植物后的不同时期以及症状轻重程度不同的材料中
不同 TMK 蛋白的表达和作用状况都是值得深入研
究的问题。
目前，16S rＲNA 基因是植原体分类的首要依
据，根据 16S rＲNA 基因将植原体划分为许多个不
同的组(Lee et al．，1993; Lee et al．，1998; Wei et al．，
2007)。相对于 16S rＲNA 基因，核糖体蛋白 rp 基因
保守性稍差，变异性更大。Martini 等(2007)对 87
种植原体进行了基于 rp 基因序列的聚类分析，结果
显示基于 rp 基因和 16S rＲNA 基因构建的进化树结
构是一致的，但基于 rp 基因的进化树能够揭示出植
原体之间更为细微的遗传进化关系，因此，根据 rp
基因可以将 16Sr 组中的植原体进一步划分为不同
的亚组。多基因分类会令结果更准确细致，蛋白延
伸因子基因 tuf 及分泌蛋白基因 secY 也成为植原体
分类的重要依据 ( Koui et al．，2003; Lee et al．，
2006)。基于单拷贝的 tmk-b 基因序列构建的进化
树与基于 16S rＲNA 构建的进化树具有较好的一致
性(图 4)，但 tmk-b 基因能否作为植原体 16Sr 组或
亚组水平的分类鉴定依据，有待于更多不同组植原
体和同一植原体不同株系的 tmk-b 基因序列分析结
果的支持。从已知的泡桐丛枝及之前的枣疯植原体
tmk-a 型基因多样性特征来看，虽然它们不适于作
为植原体的分组指标，但有可能是划分同一植原体
不同株系或基因型的重要依据 (徐启聪，2009 )。
Ｒocha 等(2002)对支原体 Mycoplasma pulmoni 的 2
个不同来源寄 主上 分 离 的 株 系 UAB CTIP 和
KD735-15 的编码高变异性表面脂蛋白抗原基因簇
vsa 的研究发现，二者在基因顺序、数目和重复单元
数目上都有非常大的差异，前者含有 7 个 vsa 而后
者含有 11 个，其中 4 个在前者中不存在; 而且前者
表达基因为 vsaI，后者表达基因为 vsaA。本研究选
用的 PaWBPs 和 PaWBJan 株系分别来自地理相隔
遥远、气候和寄主迥异的环境，二者出现明显的 tmk-
a 基因序列的趋异性变异，可能是植原体对环境的
适应性。通过对大量收集的我国不同地区不同泡桐
品系上的泡桐丛枝植原体株系的 tmk-a 型序列的分
析，有可能鉴定和划分不同株系或不同基因型。而
且由于植原体 PMU 的复制和转座作用及随后发生
的基因组重组过程可能导致植原体不同株系致病性
的分化(Arashida et al．，2008)。所以对 tmk 等多基
因簇的深入研究可为植原体致病机制研究提供新的
思路。
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(责任编辑 朱乾坤)
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