全 文 ：第 wu卷 第 u期
u s s y年 u 月
林 业 科 学
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ƒ ¥¨qou s s y
我国木本植物致病性土壤杆菌的
分子检测和比较鉴定 3
田国忠t 李 永t 朱水芳u 贾瑞祥v 王慧敏v
kt1 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 北京 tsss|t ~ u1 中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所 北京 tsssu| ~
v1中国农业大学植物病理系 北京 tsss|wl
摘 要 } 根据根癌土壤杆菌 ׬质粒的保守序列设计了 u对引物 o对我国不同木本植物上分离鉴定的 ts株致病性
根癌土壤杆菌进行 °≤• o致瘤性根癌土壤杆菌k Αγροβαχτεριυµ τυµεφαχιενσl扩增出 wuz ¥³和 vv{ ¥³的特异性 ⁄‘„ 片
段 o而发根土壤杆菌 k Αq ρηιζογενεσl仅扩增出 vv{ ¥³片段 o放线土壤杆菌 k Αq ραδιοβαχτερl !丁香假单胞菌
k Πσευδοµονασσψρινγαεl和泡桐丛枝病植原体k³«¼·²³¯¤¶°¤l皆未有特异扩增带 ∀用 ≤≠×Π≤≠×. 引物对也可鉴定 ×2⁄‘„
遗传转化瘤组织 o而 ∂¬µ⁄u„Π∂¬µ⁄u∞可用于工程土壤杆菌株侵染能力鉴定 ∀从北京通州杨树苗圃和河北廊坊桃园的
病树冠瘿组织和土壤中经选择培养基分离菌株 o然后 °≤• 筛选出 y个致病性根癌土壤杆菌菌株 o而未能从施用过
抗根癌生防制剂的北京玉渊潭公园樱花根癌病园中分离和鉴定出典型的致病根癌土壤杆菌株 ∀将杨树根癌土壤
杆菌菌株k≤ƒ≤≤tsstl异戊烯基转移酶基因kιπτl片段克隆和序列测定结果显示与 Αq τυµεφαχιενσ ׬tx|xx 菌株的 ιπτ
基因序列同源性为 {v1yw h ∀用此片段制备的 ιπτ ¦• ‘„基因探针进行斑点杂交和 ‘²µ·«¨µ± ¥¯²·o结果显示此探针与
杨树根癌土壤杆菌以及玫瑰 !樱花 !海棠 !桃树等木本植物上分离鉴定的致病土壤杆菌菌株所扩增出的 wuz ¥³片段
都有明显杂交信号 o但与引起泡桐丛枝病植原体染色质和染色质外 ⁄‘„均未有明显杂交信号 ∀
关键词 } 土壤杆菌 ~多聚酶链式反应 ~ ιπτ和 ςιρ⁄u基因 ~核酸杂交 ~泡桐丛枝植原体
中图分类号 }≥zyv1tv ~±z{ 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussylsu p ssyv p ts
收稿日期 }ussv p tu p vt ∀
基金项目 }中央级科研院所科技基础性工作专项资金项目kusst ⁄∞„tssswl和国家自然科学基金资助项目kvsszsyuutl资助 ∀
3 本研究得到中国林业科学研究院森林生态环境与保护所刘惠珍副研究员 !玉渊潭公园管理处许晓波 !王燕同志 o中国农业科学院生物
技术研究所李汝刚博士等的协助 o特此致谢 ∀
Μολεχυλαρ ∆ετεχτιον ανδ Ιδεντιφιχατιον οφ Πατηογενιχ Αγροβαχτεριυµ σππ qΙσολατεσ Ασσοχιατεδ
ωιτη Ωοοδψ Πλαντ Χροων Γαλλ ∆ισεασεσιν Χηινα
׬¤± Š∏²½«²±ªt ¬≠²±ªt «∏≥«∏¬©¤±ªu ¬¤ •∏¬¬¬¤±ªv • ¤±ª ‹∏¬°¬±v
kt1 Ινστιτυτε οφ Φορεστ Εχολογψo Ενϖιρονµεντ ανδ Προτεχτιον o ΧΑΦ Βειϕινγ tsss|t ~ u1 Ινστιτυτε οφ Ανιµαλανδ Πλαντ Θυαραντινε o ΧΑΙΘ Βειϕινγ tsssu| ~
v1 ∆επαρτµεντ οφ Πλαντ Πατηολογψo Χηινα Αγριχυλτυραλ Υνιϖερσιτψ Βειϕινγ tsss|wl
Αβστραχτ } …¤¶¨§²±·«¨ ¦²±¶¨µ√¨ ¶¨ ∏´¨±¦¨¶²©×¬³¯¤¶°¬§²© Αγροβαχτεριυµ τυµεφαχιενσo·º²³¤¬µ¶²©³µ¬°¨ µ¶o≤≠×Π≤≠×. ¤±§
ςιρ⁄u„Πςιρ⁄u∞ º¨ µ¨ §¨¶¬ª±¨ §¤±§¶¼±·«¨¶¬½¨ §q °≤• º¤¶∏¶¨§©²µ·«¨ ¬§¨±·¬©¬¦¤·¬²± ¤±§§¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²± ²©¶¨√¨ µ¤¯ ¬¶²¯¤·¨¶²©
Αγροβαχτεριυµ ¶³³q¤±§²·«¨µ¥¤¦·¨µ¬¤q…²·«wuz ¥³¤±§vv{ ¥³ ⁄‘„ ³µ²§∏¦·¶º¨ µ¨ ¤°³¯¬©¬¨§©µ²° Αγροβαχτεριυµ τυµεφαχιενσ
¬¶²¯¤·¨¶¦¤∏¶¬±ª¦µ²º± ª¤¯¯ ²© º²²§¼ ³¯¤±·¶q ’±¯¼ vv{ ¥³©µ¤ª°¨ ±·º¤¶¤°³¯¬©¬¨§©µ²° Αq ρηιζογενεσo º«¬¯¨ ±²¶³¨¦¬©¬¦⁄‘„
¥¤±§º¤¶¤°³¯¬©¬¨§©µ²° Αq ραδιοβαχτερo Πσευδοµονασ σψρινγαε ¤±§°¤∏¯²º±¬¤ º¬·¦«¨¶. ¥µ²²° ³«¼·²³¯¤¶°¤q׫¨ °≤• ∏¶¬±ª
≤≠×Π≤≠×. ³µ¬°¨ µ³¤¬µ¶¦²∏¯§¥¨ ∏¶¨§©²µ§¨·¨µ°¬±¬±ª·«¨ ×2⁄‘„·µ¤±¶©²µ°¨ §³¯¤±·ª¤¯¯·¬¶¶∏¨¶oº«¬¯¨ ςιρ⁄u„Π ςιρ⁄u∞¦²∏¯§
¥¨ ¤¯¶²∏¶¨§©²µ·«¨ §¨·¨¦·¬²± ²©·«¨ ¬±©¨¦·¬²± ¦¤³¤¦¬·¼ ²© ±¨ª¬±¨ µ¨¬±ª Αq τυµεφαχιενσ¶·µ¤¬±¶q≥¬¬ Αq τυµεφαχιενσ¶·µ¤¬±¶º¨ µ¨
¬¶²¯¤·¨§¤±§¬§¨±·¬©¬¨§©µ²°·«¨ ³²³¯¤µ±∏µ¶¨µ¼¬± ײ±ª½«²∏o…¨ ¬­¬±ª¤±§³¨¤¦«²µ¦«¤µ§¬± ¤±ª©¤±ªo‹ ¥¨¨¬°µ²√¬±¦¨ q‹²º¨ √¨ µo
±²·¼³¬¦¤¯ ³¤·«²ª¨±¬¦ Αγροβαχτεριυµ ¶·µ¤¬± º¤¶¬§¨±·¬©¬¨§©µ²° ·«¨ ≠²¶«¬±² ¦«¨µµ¼ ¦µ²º± ª¤¯¯ ·¬¶¶∏¨¶¤±§¬±©¨¶·¨§ ¶²¬¯ ²©
≠∏¼∏¤±·¤± °¤µ®o…¨ ¬­¬±ªoº«¨µ¨ ·«¨ ¤±·¬2¦µ²º±ª¤¯¯§¬¶¨¤¶¨ ¤ª¨ ±·¶º¨ µ¨ ¤³³¯¬¨§·²·«¨ §¬¶¨¤¶¨ ¦²±·µ²¯ ©²µ¶¨√¨ µ¤¯ ¼¨ ¤µ¶q׫¨ wuz
¥³¬¶²³¨ ±·¨±¼¯ ¤§¨±²¶¬±¨ ·µ¤±¶©¨µ¤¶¨ ª¨ ±¨ kιπτl ©µ¤ª°¨ ±·©µ²° ³²³¯¤µ¦µ²º± ª¤¯¯ Αq τυµεφαχιενσ¶·µ¤¬±¶≤ƒ≤≤ tsst º¤¶¦¯²±¨ §
¤±§¶¨ ∏´¨±¦¨§o©¬±§¬±ª·«¤·≤ƒ≤≤tsst ¶«¤µ¨§ {v1yw h ±∏¦¯¨ ²·¬§¨ «²°²¯²ª¼ º¬·« Αq τυµεφαχιενσ ׬tx|xx q ⁄²·¥¯²·¤±§
±²µ·«¨µ± ¥¯²·¤±¤¯¼¶¬¶∏¶¬±ª·«¨ ¦• ‘„ ³µ²¥¨ ³µ¨³¤µ¨§¥¼wuz ¥³⁄‘„ ¤¯¥¨¯¯ §¨º¬·«§¬ª²¬¬ª¨±¬± §¨ °²±¶·µ¤·¨§·«¤··«¬¶³µ²¥¨ «¤§
¶·µ²±ª«¼¥µ¬§¬½¤·¬²± º¬·«·«¨ Αq τυµεφαχινεσ¶·µ¤¬±¶©µ²° ³²³¯¤µ¦µ²º± ª¤¯¯§¬¶¨¤¶¨ ¤¶º¨ ¯¯ ¤¶²±¨ ¶©µ²°µ²¶¨ o ≠²¶«¬±²¦«¨µµ¼o
³¨¤¦«oªµ¤³¨√¬±¨ ·¨¦q ‘²µ·«¨µ± ¥¯²·¤±¤¯¼¶¬¶¶«²º¨ §·«¤··«¨ ιπτ ª¨ ±¨ ³µ²¥¨ «¤§ ±² §¬¶·¬±¦·«¼¥µ¬§¬½¤·¬²± ¶¬ª±¤¯ º¬·«·«¨
¦«µ²°²¶²°¤¯ ¤±§ ¬¨·µ²¦«µ²°²¶²°¤¯ ⁄‘„ ²©³¤∏¯²º±¬¤º¬·¦«¨¶. ¥µ²²° ³«¼·²³¯¤¶°¤q
Κεψ ωορδσ} Αγροβαχτεριυµ ¶³³q~ ³²¯¼°¨ µ¤¶¨ ¦«¤¬± µ¨¤¦·¬²±k°≤• l ~ ιπτ ¤±§ ςιρ⁄u ª¨ ±¨ ~ ±∏¦¯¨ ¬¦¤¦¬§ «¼¥µ¬§¬½¤·¬²±~
³¤∏¯²º±¬¤º¬·¦«¨¶. ¥µ²²° ³«¼·²³¯¤¶°¤
土壤杆菌属kΑγροβαχτεριυµl 中的代表种类根癌土壤杆菌k Αγροβαχτεριυµ τυµεφαχιενσl引起植物根癌病 o是
一种世界性的植物根部病害 o可以使植物产生肿瘤等症状 o严重影响植物的生长发育 o甚至引起生长衰退和
死亡 o为我国重要森林植物检疫对象k林业部野生动物和植物保护司 ot||sl ∀该病菌寄主范围广 o为害杨树
kΠοπυλυσl !柳树kΣαλιξl !枣树k Ζιζψπηυσϕυϕυβαl !桃k Πρυνυσ περσιχαl !苹果k Μαλυσl !梨k Πψρυσl !葡萄k ςιτισl !杏
kΠρυνυσl !木瓜k Χηαενονελεσ σινενσισl !板栗k Χαστανεα µολλισσιµαl !胡桃k ϑυγλανσl !月季k Ροσαl !樱花k Πρυνυσ
ψεδοενσισl等 |v个科 !yws余种双子叶植物和裸子植物k游积峰等 ot|{x ~任欣正等 ot||s ~张静娟等 ot|{{ ~倪大
炜等 ot||| ~孙艳丽等 ousssl ∀近些年来 o随着林业生产发展 !造林规模加大 !国内外引种和种苗调运频率的
增加 o出现了林木 !花卉和果树根癌病传播加速和蔓延的趋势 ∀
由于该病害的防治难度大 o如何快速准确地检测和鉴定致病菌 !了解病菌在土壤中的分布 !动态变化以
及在植物体内的存在部位和含量 o对于种苗检疫 !病害预测预报和针对性地制订防治对策都具有重要意义 ∀
我国开展的病菌鉴定方法主要包括病组织或土壤分离培养 !接种指示植物测定致病性 !生理生化指标测定其
生物型及 ≥⁄≥2°„Š∞和血清学鉴定等k李英等 ot|{z ~孙艳丽等 ousssl ∀近些年来 o国外已有用 °≤• 技术和探
针技术检测和鉴定致病性根癌土壤杆菌的研究报道k⁄²±ª ετ αλqot||u ~≤∏¥¨µ² ετ αλqot||| ~‹¤¤¶ετ αλqot||x ~
≥¤º¤§¤ ετ αλqot||x ~t||v ~…∏µµετ αλqot||s ~Ž¤∏©°¤±± ετ αλqot||y ~≥¦«∏¯·½ ετ αλqot||v ~≥¤§²º¶®¤ ετ αλqot||yl ∀
作者根据 ׬质粒上与致病性相关的基因的保守序列设计并合成了 u对特异性引物 o对我国不同来源的土壤
杆菌菌株进行了比较研究 ~从北京及河北的杨树苗圃和桃园内分离鉴定出了致病性菌株 ~从而建立了 °≤•
和探针杂交相结合鉴别致病性土壤杆菌的有效 !准确 !快速的方法 ∀同时 o用制备的基因探针探讨了泡桐丛
枝病植原体及其他病原细菌是否存在类似细胞分裂素相关的基因的问题 ∀
t 材料与方法
111 根癌土壤杆菌 !其他细菌及植原体
根癌土壤杆菌株包括杨树根癌土壤杆菌株k来源于中国林业微生物菌种保藏管理中心 o≤ƒ≤≤tsstl ) ) )
能引发杨树及其他木本植物根瘤和茎瘤k张锡津 ot|{s ~张静娟等 ot|{{l ~桃树根癌土壤杆菌k来自于中国普
通微生物菌种保藏管理中心 o„×ttywslk李英等 ot|{zl o分离自桃树 !樱花 !苹果 !葡萄等植物上 o致病菌株分
别编号为 Šts p t !Štt p t !Žvs{ !Žuz !≤≠w !…u{y p „ !…u{y p …和 Šttkulk由中国农业大学植物病理系
细菌室提供l ~发根土壤杆菌kΑq ρηιζογενεσlk来自中国农业微生物菌种保藏管理中心 o„≤≤≤tssysl ~非致病
菌株放线土壤杆菌kΑqραδιοβαχτερlk来自中国普通微生物菌种保藏管理中心 o≤Š≤≤ttxsl ~剔除致瘤基因的
土壤杆菌工程菌株 „× p Š˜≥和 „× p ׋k由中国农业科学研究院生物技术研究所李汝刚博士惠赠l ∀丁香假
单胞菌k Πσευδοµονασσψρινγαεlk由本室晁龙军提供l ~感染植原体的泡桐丛枝病组织培养苗及用杨树根癌土壤
杆菌转化的泡桐遗传转化瘤组织 „× p ‹k田国忠等 ousstl ∀
112 田间采集样品 !病菌分离培养和致病性测定
分别于 t|||年 tt月和 ussu年 w月 tt日 u次在北京玉渊潭公园樱花园取样 o包括患病樱花根癌瘤及土
样 ~中国农科院南路成年绿化毛白杨行道树患病株基部肿瘤组织及土样 ~ussu年 x月从河北廊坊市白家务
乡王小寨村一桃园和北京通州区台湖镇田家府村 {wŽ杨苗圃内取瘤组织及土样 ∀
采用培养皿稀释分离法和平板划线分离法从病瘤组织和土壤中分离培养细菌k方中达 ot||{l ∀将接种
培养皿放在 u{ ε 恒温培养箱中培养 w{ «o挑取具有菌落特征的菌落转移到斜面培养 ∀所选用培养基包括
°⁄„ !≠∞k酵母膏甘露糖醇培养基l和 Ž¤§²k甘露糖醇培养基l ∀
以番茄kΛψχοπερσιχυµ εσχυλεντυµl和泡桐k Παυλοωνιᶳql组培苗作细菌接种材料 ∀番茄盆载苗接种方法按
常规细菌接种方法k方中达 ot||{l ∀用泡桐组培苗伤口涂菌接种按田国忠等kusstl的方法 ∀
113 细菌和植物瘤组织模板 ∆ΝΑ提取
刮取约 t °°u 菌斑 o放入 s1x °的 ∞³³¨ ±§²µ©管中 o加入 tss ˏ细菌 ⁄‘„抽提液kus °°²¯#pt ×µ¬¶p
≤¯ o³‹{1s ot °°²¯#pt ∞⁄ׄ ot °°²¯#pt ‘¤≤¯ os1x h ×µ¬·²± ÷ p tssl otss ε !处理 u °¬±o冰浴 u °¬±ots sss
wy 林 业 科 学 wu卷
µ#°¬±pt离心 t ∗ u °¬±o取上清液作为细菌模板 ⁄‘„备用k׬¤± ετ αλqousssl ∀植物瘤组织 ⁄‘„提取方法按标
准 ≤ׄ…法k田国忠等 ousstl ∀
泡桐丛枝病植原体的提纯和 ⁄‘„ 的抽提按田国忠等kt||yl方法 ∀
114 ιπτ和 ςιρ∆2基因片段扩增引物的设计和 ΠΧΡ
根据 …¤µ®¨µ等kt|{vl 对 Αγροβαχτεριυµ τυµεφαχιενσ菌株k章鱼碱型 ׬质粒 ³×¬tx|xxl× p ⁄‘„的序列测定
结果和 ‹¤¤¶等kt||xl的研究 o设计并合成了 t对扩增 × p ⁄‘„上异戊烯基转移酶基因kιπτl基因片段的引物
≤≠× }xχ2Š„× ≤ŠŠ Š×≤ ≤„„ ׊≤ ׊×2vχk{{yz p {{{wl o≤≠×χ }xχ2Š„× „×≤ ≤„× ≤Š„ ×≤× ≤××2vχk|u|{ p |uzyl ∀
ςιρ⁄u引物是根据 Αq τυµεφαχιενσ ׬质粒的致病区 ςιρ⁄u保守序列设计的引物 oςιρ⁄u„为 }xχ2„׊ ≤≤≤ Š„×
≤Š„ Š≤× ≤„„ Š×2vχ o ςιρ⁄u∞为 }xχ2≤≤× Š„≤ ≤≤„ „„≤ „×≤ ×≤Š „≤× Š≤≤ ≤„2vχk‹¤¤¶ ετ αλqot||xl ∀
°≤• 反应体系kxs ˏl }t ∗ x ˏ模板 ⁄‘„ ot ˏts °°²¯#pt §‘×° ox ˏts ≅ °≤• ¥∏©©¨µot ∗ w ˏ引物k浓
度达 s1w Λ°²¯#ptl o加重蒸馏水k⁄⁄• l至 xs ˏo加 vs ∗ xs ˏ矿物油 o{{ ε ots °¬±后加 t ˜ Ταγ⁄‘„酶 ∀
扩增条件 }|w ε owx ¶~xu ε o{s ¶~zu ε o|s ¶∀扩增 vs ∗ vx个循环 o然后 zu ε ots °¬±∀
115 ιπτ基因片段克隆和序列测定
经过对 ιπτ基因引物磷酸化 !°≤• 扩增 !产物 ³Š∞2v½©k nΠp l平端连接 !感受态大肠杆菌热击转化 o然
后培养并挑取阳性白色单菌落 !°≤• 筛选鉴定阳性克隆等步骤获得阳性克隆菌株 o送 פ®¤°¤公司k大连l进
行序列测定 ∀
116 ιπτ基因 χΡΝΑ探针制备和 ∆ΝΑ2χΡΝΑ探针杂交
将纯化质粒 ⁄‘„进行单酶切和双酶切鉴定 o然后将经 ΕχοΡ ´单酶切的目的质粒 ⁄‘„进一步纯化获得
线状质粒 ⁄‘„ o制备地高辛标记¦• ‘„探针 ∀探针合成反应体系kus ˏl为 }u ˏ线性化质粒 ⁄‘„k ΕχοΡ ´酶
切l ow ˏx ≅转录缓冲液 ou ˏtss °°²¯#pt ⁄×× ot ˏµ• ‘¤v≥¬±kus ˜l ou ˏw °°²¯#pt ‘×°混合物k含地高
辛标记 p §˜×°l ou ˏ≥°y • ‘„多聚酶k°µ²°¨ ¤ª¤公司l oz ˏ⁄⁄• ovz ε o温育 u «∀然后用加 u1x ˏw °²¯#
pt ¬≤¯ 和 zx ˏ预冷乙醇纯化探针 o加 tss ˏ灭菌 ⁄⁄• 溶解 o并加 t ˏ• ‘¤¶¨ 抑制剂 o于 p us ε 保存备用 ∀
点杂交k§²·¥¯²·l时先将 ⁄‘„样品用 v °²¯#pt ‘¤’‹变性处理 oys ε ot «o然后加 us ≅ ≥≥≤ o用灭菌 ⁄⁄•
系列按 tΒu !tΒw !tΒ{ !tΒty !tΒvu系列稀释 ⁄‘„变性样品后 o点样于尼龙膜k«¼¥²±§2‘n o¤°¨ µ¶«¤°l上 otus ε
烘烤 vs °¬±固定核酸 ~在杂交管中加入预杂交液kx ≅ ≥≥≤ oxs h甲酰胺 os1t h ≥≥ os1su h ≥⁄≥ ous h封闭剂l于
w{ ε 预杂交 t «~然后加入 x ∗ ts ˏιπτ2¦• ‘„探针 ow{ ε 滚动杂交过夜ktw «以上l o然后用 u ≅ ≥≥≤ 洗膜 u
次 !s1x ≅ ≥≥≤洗膜 u次 o每次 tx °¬±~加封闭剂后于摇床上摇动 t «~在封闭剂中加入 y ˏ地高辛标记的碱性
磷酸酯酶 „±·¬2⁄¬ª2„°k…²¨ «µ¬±ª¨µ¤±±¥¨¬°和 •²¦«¨ 公司试剂盒l o室温反应 t ∗ u «o其他操作按试剂盒说明
书进行 ∀采用底物 ≤≥°⁄kt ou p二氧杂环丁烷 p磷酸盐取代物l发光法k…²¨ «µ¬±ª¨µ¤±±¥¨¬°试剂盒l或用碱
性磷酸酯酶底物 ‘…×Π…≤Œ°直接显色k•²¦«¨ 试剂盒l ∀
进行 ±²µ·«¨µ± ¥¯²·时 o先将 ⁄‘„样品用 t h琼脂糖凝胶电泳分离 o然后将凝胶变性处理 !尼龙膜毛细管转
移过夜kt{ «以上l ∀尼龙膜核酸固定 !杂交步骤同点杂交 ∀
u 结果与分析
211 致病性土壤杆菌不同菌株的 ΠΧΡ 检测 !鉴定和比较鉴别结果
用 ≤≠×Π≤≠×χ引物对 o可从引起多种木本植物根癌病的土壤杆菌k除  Štt p t株系外l中扩增出 wuz ¥³
的 ⁄‘„片段 o而不能从发根土壤杆菌 !线土壤杆菌 !丁香假单胞细菌和泡桐丛枝病植原体扩增出此特异性片
段 ∀从葡萄上分离的土壤杆菌株菌株 Šttkul也未能扩增出此片段k表 t o图 tl ∀已人工剔除了 × p ⁄‘„的
致瘤性基因的土壤杆菌工程菌株 „× p Š˜≥和 „× p ׋ 也不能扩增出此特异性片段 ∀在 „× p ×vx瘤组织中
也能扩增出 wuz ¥³特异片段 ∀
用 ςιρ⁄u引物对 o除可从根癌土壤杆菌k除 Štt p t株系外l中扩增出预期的 vv{ ¥³片段外 o发根土壤
杆菌 !„× p Š˜≥和 „× p ׋也可扩增出此片段 ∀说明这些菌株在 ׬质粒上皆存在与侵染性相关的 ςιρ⁄u区
域 ∀在遗传转化的泡桐瘤组织 ⁄‘„中不能扩增出此片段 o也证明此片段未被转移整合到泡桐染色体上 ∀
上述结果充分验证了 wuz ¥³°≤• 产物是与细胞分裂素合成相关的根癌土壤杆菌 ׬质粒的可转移 × p
⁄‘„上的异戊烯基腺苷转移酶基因序列 o为土壤杆菌致瘤所必需区域 ~而 vv{ ¥³⁄‘„片段则存在于 ׬和 •¬
xy 第 u期 田国忠等 }我国木本植物致病性土壤杆菌的分子检测和比较鉴定
表 1 ΠΧΡ 检测和鉴定土壤杆菌结果
Ταβ .1 Ρεσυλτσ οφ ΠΧΡ φορ δετεχτιον ανδ ιδεντιφιχατιον οφ Αγροβαχτεριυµ σππ .
细菌菌株及编号 ≠
…¤¦·¨µ¬∏° ¤±§¶·µ¤¬±¶¦²§¨¶
来源
≥²∏µ¦¨¶¤±§ ²¯¦¤·¬²±
引物 °µ¬° µ¨³¤¬µ¶
ιπτ ςιρ⁄u
土壤
杆菌
Αγροβαχ2
τεριυµ
¶³³q
已鉴定
菌株
Œ§¨±·¬2
©¬¨§
¶·µ¤¬±¶
„× p  Šts p t 中国农业大学 o玫瑰根癌病菌k生物型 ´ l≤«¬±¤ „ªµ¬¦∏¯·∏µ¤¯ ˜±¬√¨ µ¶¬·¼k≤„˜l oµ²¶¨ ¦µ²º± ª¤¯ k¯¥¬²·¼³¨ ´l q n n
„× p  Štt p t 中国农业大学 o玫瑰根癌病菌k生物型 ´l≤„˜ oµ²¶¨ ¦µ²º± ª¤¯ k¯¥¬²·¼³¨ ´l q p p
„× p Žvs{ 中国农业大学 o葡萄根癌病菌k生物型 ¶l ≤„˜ oªµ¤³¨ ¦µ²º± ª¤¯¯ k¥¬²·¼³¨ ¶l q n n
„× p Žuz 中国农业大学 o桃树根癌病菌k生物型 µl≤„˜ o³¨ ¤¦«¦µ²º± ª¤¯¯ k¥¬²·¼³¨ µl q n n
„× p ≤≠w 中国农业大学 o樱桃根癌病菌k生物型 ´l≤„˜ o¦«¨µµ¼ ¦µ²º± ª¤¯¯ k¥¬²·¼³¨ ´l q n n
„× p …u{y p „ 中国农业大学 o葡萄根癌病菌k生物型 ¶l≤„˜ oªµ¤³¨ ¦µ²º± ª¤¯¯ k¥¬²·¼³¨ ¶l q n n
„× p …u{y p … 中国农业大学 o葡萄根癌病菌k生物型 ¶l≤„˜ oªµ¤³¨ ¦µ²º± ª¤¯¯ k¥¬²·¼³¨ ¶l q n n
„× p Šttkul 中国农业大学 o葡萄根癌病菌k生物型 ¶l≤„˜ oªµ¤³¨ ¦µ²º± ª¤¯¯ k¥¬²·¼³¨ ¶l q p n k p l
„× p ≤ƒ≤≤tsst
中国林业微生物菌种保藏管理中心 o杨树根癌病 ∀ ≤«¬±¤ ≤²°°¬·¨¨©²µ≤∏¯·∏µ¨
≤²¯¯¨ ¦·¬²± ²© ¬¦µ²²µª¤±¬¶°¶ ƒ²µ¨¶·µ¼ ≤∏¯·∏µ¨ ≤²¯¯¨ ¦·¬²± ≤ ±¨·¨µo ³²³¯¤µ¦µ²º± ª¤¯¯
§¬¶¨¤¶¨ q
n n
„× ≤Š≤≤ ttyws 中国普通微生物菌种保藏管理中心 o桃树根癌病 ∀ ≤«¬±¤ Š¨ ±¨ µ¤¯ ¬¦µ²¥¬²¯²ª¬¦¤¯≤∏¯·∏µ¨ ≤²¯¯¨ ¦·¬²± ≤ ±¨·¨µo³¨ ¤¦«¦µ²º± ª¤¯¯q n n
„× p ׋
中国农业科学院生物技术研究所 o剔除致瘤基因 !含外源 Ηαρπιν∞¤基因 ∀
Œ±¶·¬·∏·¨ ²© …¬²·¨¦«±²¯²ª¼ o≤«¬±¨ ¶¨ „¦¤§¨ °¼ ²© „ªµ¬¦∏¯·∏µ¤¯ ≥¦¬¨±¦¨ oµ¨°²√¬±ª²±¦²ª¨ ±¨
¬±·«¨ ƒ⁄‘„ ª¨ ±¨ ¤±§«²µ¥²µ¬±ª¬±¶¨µ·¨§ Ηαρπιν∞¤ ª¨ ±¨ q
p n
„× p Š˜≥
中国农业科学院生物技术研究所 o含报道基因 Š˜≥ ∀Œ±¶·¬·∏·¨ ²© …¬²·¨¦«±²¯²ª¼o
≤«¬±¨ ¶¨ „¦¤§¨ °¼ ²© „ªµ¬¦∏¯·∏µ¤¯ ≥¦¬¨±¦¨ o µ¨°²√¬±ª²±¦²ª¨ ±¨ ¬± ·«¨ ƒ⁄‘„ ª¨ ±¨ ¤±§
«²µ¥²µ¬±ª¬±¶¨µ·¨§Š˜≥ µ¨³²µ·¨µª¨ ±¨ q
n p
发根土壤杆菌
Αq ρηιζογενεσ
„≤≤≤tssys
中国农业微生物菌种保藏管理中心 ∀ „ªµ¬¦∏¯·∏µ¤¯ ≤∏¯·∏µ¨ ≤²¯¯¨ ¦·¬²± ≤ ±¨·¨µ²©
≤«¬±¤q p n
Αqραδιοβαχτερ
k„• l≤Š≤≤ttxs
中国普通微生物菌种保藏管理中心 ∀ ≤«¬±¤ Š¨ ±¨ µ¤¯ ¬¦µ²¥¬²¯²ª¬¦¤¯ ≤∏¯·∏µ¨
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菌株
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≠‹kt ou ovl 北京玉渊潭公园樱花根癌病土壤 ∀ ≥²¬¯ º¬·« ≠²¶«¬±² ¦«¨µµ¼ ¦µ²º± ª¤¯¯ §¬¶¨¤¶¨ ¬±…¨ ¬­¬±ª ≠∏¼∏¤±·¤± °¤µ®q p p
≠‹⁄kt ou ovl 北京玉渊潭公园樱花园樱花根癌瘤组织 ∀ Š¤¯¯·¬¶¶∏¨ ²© ≠²¶«¬±² ¦«¨µµ¼o©µ²°…¨ ¬­¬±ª ≠∏¼∏¤±·¤± °¤µ®q p p
≠≥⁄kt oul 北京中国农科院南路成年杨树行道树患病瘤组织 ∀ Š¤¯¯·¬¶¶∏¨¶©µ²° ¤§∏¯·³²³¯¤µ¶«¤§¨ ·µ¨ ¶¨²±·«¨ ≥²∏·« •²¤§²© ≤«¬±¨ ¶¨ „¦¤§¨ °¼ ²© „ªµ¬¦∏¯·∏µ¤¯ ≥¦¬¨±¦¨ o …¨ ¬­¬±ªq p p
≠≥kt oul 北京中国农科院南路患病杨树根围土壤 ∀ ≥²¬¯ ©µ²° ·«¨ ≥²∏·« •²¤§²© ≤«¬±¨ ¶¨„¦¤§¨ °¼ ²© „ªµ¬¦∏¯·∏µ¤¯ ≥¦¬¨±¦¨ o …¨ ¬­¬±ªq p p
×⁄kt ou ov owl 河北廊坊桃树瘤组织 ∀ °¨ ¤¦«ª¤¯¯·¬¶¶∏¨ ©µ²° ¤±ª©¤±ªo ‹ ¥¨¨¬q n n
×׍kt ou ov owl 河北廊坊病桃园土壤 ∀ ≥²¬¯ ©µ²° ³¨¤¦« ¦µ²º± ª¤¯¯ §¬¶¨¤¶¨ ²µ¦«¤µ§ ²© ¤±ª©¤±ªo‹ ¥¨¨¬q n n
⁄kt ou ov ow ox oy ozl 北京通州 {wŽ杨苗瘤组织 ∀ °²³¯¤µ{wŽ¶¨ §¨¯¬±ª ª¤¯¯ ·¬¶¶∏¨¶o©µ²° ײ±ª½«²∏o…¨ ¬­¬±ªq n n
×kt ou ov ow ox oy ozl 北京通州 {wŽ病杨苗圃土壤 ∀ ≥²¬¯ ©µ²° ·«¨ §¬¶¨¤¶¨§ {wŽ³²³¯¤µ±∏µ¶¨µ¼ ¬±×²±ª½«²∏o …¨ ¬­¬±ªq n n
Εριχηονδρια χολι2ιπτ 本试验室克隆的含 ιπτ 基因片段的大肠杆菌 ∀ Εριχηονδρια χολι º¬·« ιπτ ª¨ ±¨©µ¤ª° ±¨·¬±¶¨µ·¬²± ¥¼ ²∏µ¯ ¤¥q n ‘⁄
Πσευδοµονασσψρινγαε 本试验室从杨树叶面上分离菌株 ∀ „ ¶·µ¤¬±¬¶²¯¤·¨§©µ²° ³²³¯¤µ¯ ¤¨©¬± ²∏µ¯ ¤¥q p p
泡桐丛枝植原体
°¤∏¯²º±¬¤ º¬·¦«¨¶. ¥µ²²° ³«¼·²³¯¤¶°¤
本试验室保存泡桐丛枝病组培苗毒源 ∀ °«¼·²³¯¤¶°¤¶ °¤¬±·¤¬±¨ §¬± ³¤∏¯²º±¬¤
·¬¶¶∏¨ ¦∏¯·∏µ¨ ¬± ²∏µ¯ ¤¥q p p
清水对照 • ¤·¨µ¦²±·µ²¯ p p
≠ „× } Αqτυµεφαχιενσ~≠‹o≠‹⁄o≠≥⁄o≠≥o×⁄o×׍o⁄o×分别为不同来源材料分离菌株 o括号内为菌株编号 ∀ ≠‹o≠‹⁄o≠≥⁄o≠≥o×⁄o
×׍o⁄o×µ¨³µ¨¶¨±··«¨ ¬¶²¯¤·¨§¶·µ¤¬±¶©µ²° §¬©©¨µ¨±·¶²∏µ¦¨¶o¶·µ¤¬± ±∏°¥¨µ¶¬¶¬±·«¨ ³¤µ¨±·«¨¶¬¶q  n }阳性结果 °²¶¬·¬√¨ µ¨¶∏¯·~n k p l }可疑阳性结
果 ⁄²∏¥·¯¼ ³²¶¬·¬√¨ ~p }阴性结果 ‘¨ª¤·¬√¨ ~‘⁄}未测定 ‘²·§¨·¨µ°¬±¨ §q
质粒上的与 × p ⁄‘„或 • p ⁄‘„加工和毒性相关的非转移区域k¤°¥µ¼¶®¬ετ αλqot|{| ~≥·¨¦® ετ αλqot||sl ∀
引发毛根症状的 Αqρηιζογενεσ仅能用 ςιµ⁄u引物扩增出 vv{ ¥³的片段而不能用 ιπτ引物扩增出 wuz ¥³片断 o
而放线土壤杆菌为植物非致病菌 o所以用此两对引物都不能扩增出特异片段 ∀由此可见 o根据这两组引物的
°≤• 结果即可以将致病土壤杆菌种与非致病种加以有效地比较鉴别 ∀
不能扩增出 wuz ¥³片段的根癌土壤杆菌 o像 Štt p t株系 o推断很可能是在连续继代培养过程中发生
yy 林 业 科 学 wu卷
图 t 不同来源土壤杆菌的 °≤• 检测结果
ƒ¬ªqt °≤• µ¨¶∏¯·¶²© Αγροβαχτεριυµ ¶³³q©µ²° §¬©©¨µ¨±·¶²∏µ¦¨¶
„ }t q Šts p t ~u q Štt p t ~v qŽvs{ ~w qŽuz ~x q≤≠w ~y q …u{y p „ ~z q …u{y p …~{ qŠtt kul ~| q Šts p t ~ts q Štt p t ~
tt q „×ttyws ~t ) { !tt }ιπτ引物 °µ¬° µ¨ιπτ ~| !ts }ςιρ⁄u引物 °µ¬°¨ µςιρ⁄u ~tu q°≤• 分子量标准 °≤• °¤µ®¨µq
…}t q°≤• 分子量标准 °≤• °¤µ®¨µ~u qŽvs{ ~v qŽuz ~w q≤≠w ~x q …u{y p „ ~y qŠttkul ~z q≤{x p su{⁄2³«¼·²³¯¤¶°¤~{ q×vx p su{ ~
| !ts }清水对照 • ¤·¨µ¦²±·µ²¯ ~tt q „×ttyws ~u p tu }ςιρ⁄u引物 °µ¬°¨ µςιρ⁄u q
了质粒或质粒致病性相关区域的缺失或突变 ∀这有待于对此菌株致病性变化的进一步测定 ∀在 „× p ×vx
瘤组织中只能扩增出 wuz ¥³特异片段而不能扩增出 vv{ ¥³的片段 o也能支持此推论k≥·¨¦® ετ αλqot||s ~
¤°¥µ¼¶®¬ετ αλqot|{|l ∀
图 u 田间分离培养菌株的 °≤• 检测结果
ƒ¬ªqu °≤• ¬§¨±·¬©¬¦¤·¬²± ²© Αq τυµεφαχιενσ¶·µ¤¬±¶¬¶²¯¤·¨§©µ²°©¬¨ §¯¦²¯¯¨ ¦·¨§ª¤¯¯·¬¶¶∏¨¶¤±§¶²¬¯
„ }植物冠瘿组织 ⁄‘„的 °≤• 结果 °≤• µ¨¶∏¯·¶²©³¯¤±·¦µ²º± ª¤¯¯·¬¶¶∏¨¶⁄‘„ t q„× p ‹ ~u q ⁄t f ~v q×⁄t f ~w q ⁄w f ~x q„• ‹ ~y q ⁄u f ~
z q ⁄u f ~{ q⁄v f ~| q×⁄u f ~ts q×⁄x f ~tt q„• ‹ ~t ∗ x oz }ιπτ引物 °µ¬°¨ µιπτ ~其余为 ςιρ⁄u引物 ’·«¨µ¶o³µ¬°¨ µςιρ⁄u qtu q⁄‘„分子量标
准 °≤• °¤µ®¨µq
…}从土壤中分离的细菌菌落的 °≤• 结果 °≤• µ¨¶∏¯·¶²©¥¤¦·¨µ¬¤¯ ⁄‘„ ¬¶²¯¤·¨§©µ²° ¶²¬¯ t q „× p ‹ qu q河北廊坊杨树地 t号 °²³¯¤µ ¤¯±§‘²qt
©µ²° ¤±ª©¤±ªo ‹ ¥¨¨¬°µ²√¬±¦¨ qv q河北廊坊桃地 v号ku≠Žl °¨ ¤¦« ¤¯±§‘²qv ©µ²° ¤±ª©¤±ªo ‹ ¥¨¨¬°µ²√¬±¦¨ qw q河北廊坊杨树地 u号kuŽl °²³¯¤µ
¤¯±§‘²qu ©µ²° ¤±ª©¤±ªo‹ ¥¨¨¬°µ²√¬±¦¨ qx q河北廊坊桃地 u号ku≠Žl°¨ ¤¦« ¤¯±§‘²qu©µ²° ¤±ª©¤±ªo‹ ¥¨¨¬°µ²√¬±¦¨ qy q北京通州 {wŽ杨树地 t号
kuŽl {wŽ³²³¯¤µ¯ ¤±§‘²qt ©µ²° ײ±ª½«²∏o…¨ ¬­¬±ªqz q北京通州 {wŽ杨树地 u号 q{wŽ³²³¯¤µ ¤¯±§ ‘²qu ©µ²° ײ±ª½«²∏o …¨ ¬­¬±ªq{ q Αqρηιζογενεσq
| q „×ttyws qts q⁄‘„分子量标准 °≤• ¤µ®¨µqt ∗ w oy o| }ιπτ引物 ³µ¬° µ¨ιπτ ~其余为 ςιρ⁄u引物 ’·«¨µ¶o³µ¬° µ¨ςιρ⁄u q
≤ q樱花根癌病的 °≤• 结果 °≤• µ¨¶∏¯·¶²© ≠²¶«¬±²¦«¨µµ¼ ¦µ²º± ª¤¯¯ t !ts q ⁄‘„ 分子量标准 °≤• °¤µ®¨µ~u !w q瘤组织 ⁄‘„ Š¤¯¯·¬¶¶∏¨ ⁄‘„ ~
x qŽvs{ ~y q„×ttyws ~z1清水对照 • ¤·¨µ¦²±·µ²¯ ~{ q„× p ³²³¯¤µ~| q Α qρηιζογενεσq
212 田间采集病组织和土壤分离细菌 ΠΧΡ 鉴定结果
从北京玉渊潭公园樱花园 !北京通州 {wŽ杨苗圃等地植物的根部或根茎部产生的肿瘤组织中分离到具
有土壤杆菌特征的单菌落分离物共 vw株 o从根围土壤中共分离菌株 vy株 ∀对这些菌株进行 °≤• 鉴定结果
显示k表 t o图 ul }有 tt个菌落具有典型的 Αqτυµεφαχιενσ特征 o即用 ιπτ引物扩增出 wuz ¥³的产物 o同时也能
用 ςιρ⁄u引物扩增出 vv{ ¥³的片段 ∀用 °⁄„ p ≠∞ p Ž¤§¤选择培养程序 o从河北廊坊桃园和北京通州 {wŽ
zy 第 u期 田国忠等 }我国木本植物致病性土壤杆菌的分子检测和比较鉴定
杨树苗圃获得的菌落被鉴定为根癌土壤杆菌的比率最高 ∀而从北京玉渊潭公园樱花树根围土壤 u次kt|||
年 {月和 ussu年 w月l取样分离的菌落中 o经 °≤• 均未鉴定出具有明确致病特性的根癌土壤杆菌菌株 ∀
从北京玉渊潭采来的一批樱花冠瘿组织和从农科院南路杨树冠瘿样品的检测结果全部为阴性 o这至少
推断瘤组织内未有致病根癌土壤杆菌或浓度很低 ∀有趣的是 o用 ςιρ⁄u引物对采自玉渊潭公园樱花园病树
的另一批瘤组织样品总 ⁄‘„进行 °≤• o扩增出 vv{ ¥³片段 o但用 ≤≠×Π≤≠×χ引物对却未扩增出 wuz ¥³片段 ∀
这意味着可能存在 Αqρηιζογενεσ菌株或产生 Αq τυµεφαχιενσ菌株的 ιπτ基因缺失菌株 ∀有研究也发现过 t株
非致病的 Αqραδιοβαχτερ菌株含有 ςιρ⁄u序列但无 ιπτ基因序列 o并认为是由致病性土壤杆菌的 × p ⁄‘„缺
失造成的k‹¤¤¶ ετ αλqot||x ~ƒ²µ·¬± ετ αλqot||ul ∀本试验所检测到的菌株也可能为此类丧失致瘤特性的突
变体kŒ¤¦²¥¨¯¯¬¶ετ αλqot||w ~…¨ ¤¯±ª¨µετ αλqot||xl ∀用经 °≤• 鉴定为根癌土壤杆菌菌株的 ×⁄t o对泡桐组培苗
在伤口处接种 o可产生肿瘤 o从而证实了其致病特性 ∀而将从玉渊潭公园分离菌株 ≠‹×t !≠‹×u !≠‹×v接
种到番茄苗上 o经过 | §发现番茄茎上产生了小毛根 o而用发根番茄苗提取 ⁄‘„为模板的 °≤• 却未检测到
wuz !vv{ ¥³片段 o进一步支持了玉渊潭公园分离到的菌株多不具有致瘤性的判断 ∀
213 杨树根癌土壤杆菌 ιπτ基因片段克隆和测序结果
将杨树根癌土壤杆菌菌株k≤ƒ≤≤tsstl扩增出的 wuz ¥³片段克隆到质粒载体 ³Š∞ p v½©k nΠp l上 o然后
转化感受态的大肠杆菌 ⁄‹xΑ菌株 ∀经 °≤• 鉴定 o从 t{个阳性克隆菌落中筛选出了 v个含 wuz ¥³片段的阳
性克隆 o³Š∞ p t f !³Š∞ p x f和 ³Š∞ p z f o分别对阳性克隆质粒 ⁄‘„进行 ΕχοΡ ´ΠΗινδ ¶限制性内切
酶切分析 o确认了 ³Š∞ p z f含有 wuz ¥³片段k图 vl ∀将 ³Š∞ p z f送 פ®¤°¤公司测序 o将所测序列与 Αq
τυµεφαχιενσ ׬tx|xx株的 ιπτ基因的相应区域序列比较显示k图 wl o其核苷酸残基数目完全相同 o未发生缺失
或插入现象 o二者的序列同源性为 {v1yw h k…¤µ®¨µετ αλqot|{vl ∀
图 v 杨树根癌土壤杆菌株k≤ƒ≤≤tsstl
ιπτ基因片断克隆质粒的限制性酶切
分析k°„Š∞和银染色l
ƒ¬ªqv ׫¨ µ¨¶·µ¬¦·¬²± ±¨§²¨ ±½¼°¨¤±¤¯¼¶¬¶
²©·«¨ ¦¯²±¨ §³¯¤¶°¬§º¬·« ιπτ ª¨ ±¨
©µ¤ª°¨ ±·©µ²° ³²³¯¤µ¦µ²º± ª¤¯¯¶·µ¤¬±
k°„Š∞ ¤±§¶¬¯√¨ µ¶·¤¬±¬±ªl
t q°≤• 分子量标准 °≤• °¤µ®¨µ~u q用 ΕχοΡ ´ΠΗινδ ¶双酶切 ³Š∞2
v½©空质粒 ⁄¬ª¨¶·¬²± ²©∏±¦¯²±¨ §³Š∞2v½© º¬·« ΕχοΡ ´ΠΗινδ ¶ ~v q含
ιπτ基因克隆的 ³Š∞ p v½©的 ΕχοΡ ´ΠΗινδ ¶双酶切 o箭头示 wuz ¥³
酶切片段 ⁄¬ª¨¶·¬²± ²© ¦¯²±¨ §³Š∞ p v½© º¬·« ΕχοΡ ´ΠΗινδ ¶ o¤µµ²º
³²¬±·¶·²wuz ¥³©µ¤ª°¨ ±·q
图 w 杨树根癌土壤杆菌 ιπτ基因片段与根癌土壤杆菌 ׬质粒
³×¬tx|xx的 ιπτ基因相应区域的序列比较
ƒ¬ªqw ≤²°³¤µ¬¶²± ²©¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶²© ιπτ ª¨ ±¨ ©µ¤ª° ±¨·¦¯²±¨ §©µ²° ³²³¯¤µ
¦µ²º± ª¤¯¯ Αqτυµεφαχιενσ º¬·«·«¨ ¦²µµ¨¶³²±§¨±·µ¨ª¬²± ²©×¬tx|xx Αqτυµεφαχιενσ
¤}杨树根癌农杆菌株系质粒克隆的 ιπτ基因片段 ≤¯ ²±¨ § ιπτ ª¨ ±¨ ©µ¤ª° ±¨·
©µ²° ¦µ²º± ª¤¯¯ „× ²©³²³¯¤µ~¥}章鱼碱型 ׬质粒 ³×¬tx|xx的 ιπτ基因片段 o
下划线指示引物序列 ³×¬tx|xx ²© Αqτυµεφαχιενσ ²³¬±¨ ¶·µ¤¬±q ˜±§¨µ¯¬±¨ ¶
¬±§¬¦¤·¨·«¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶²©·«¨ ³µ¬°¨ µ¶q
214 ιπτ探针制备 !点杂交和 νορτηερν βλοτ杂交结果
用克隆的含 ιπτ基因 wuz ¥³片段的纯化质粒经 ΕχοΡ ´单酶切后 o分别进行转录试验和制备地高辛标记
{y 林 业 科 学 wu卷
的¦• ‘„ 探针 ∀点杂交和 ±²µ·«¨µ± ¥¯²·杂交结果显示 o此探针与克隆的阳性菌株和杨树根癌土壤杆菌总
⁄‘„ !克隆大肠杆菌质粒 ⁄‘„及克隆菌株的 °≤• 产物皆有强杂交信号k图 xl o从而证明了所扩增产物为 ιπτ
目的基因片段 ∀
用木本植物上分离的根癌土壤杆菌的 °≤• 产物与 ιπτ探针进行点杂交分析 o结果显示k图 yl }此探针与
所有扩增出 wuz ¥³片段的不同根癌土壤杆菌菌株都有阳性杂交信号 o与其他类细菌无杂交信号 ∀说明 ιπτ
基因片段在致病性菌株间的同源性很高 ∀因此 o采用此探针进行 ¦• ‘„ p ⁄‘„杂交 o可以进一步鉴定根癌土
壤杆菌中 ιπτ基因的存在和确证其致病性 ∀采用 ≤≥°⁄发光法和 ‘…×Π…≤Œ°显色法所检测到的杂交信号无明
显的差异 o都可很好地检测到阳性杂交结果 ∀但从理论上说 o‹…×Π…≤Œ°显色法检测同源核酸的灵敏度可达
s qt ³ª水平 o而 ≤≥°°发光法的检测灵敏度要比显色法还要高出 v倍以上 ∀
对提取的感染植原体的泡桐总 ⁄‘„和从纯化的植原体中抽提的染色质和染色质外 ⁄‘„ o用 t h琼脂糖
电泳 o然后转移到尼龙膜上 o用 ιπτ基因探针进行 ±²µ·«¨µ± ¥¯²·杂交 o结果此探针与泡桐丛枝植原体 ‘⁄„未有
任何明显的阳性杂交信号出现 ∀说明植原体基因组和染色质外 ⁄‘„中可能不存在类似根癌土壤杆菌 × p
⁄‘„的 ιπτ类细胞分裂素合成基因或同源序列 ∀
图 x 点杂交结果
ƒ¬ªqx ⁄²·«¼¥µ¬§¬½¤·¬²± µ¨¶∏¯·¶
„ }克隆大肠杆菌杂交结果 ‹¼¥µ¬§¬½¤·¬²± µ¨¶∏¯·¶²©¦¯²±¨ § Ε q χολι qt q含克隆 ιπτ片段的质粒 ⁄‘„ 样品 °¯ ¤¶°¬§⁄‘„ «²µ¥²µ¬±ª¦¯²±¨ § ιπτ ª¨ ±¨
©µ¤ª° ±¨·~u ) { q不同阳性克隆菌落 °≤• 扩增产物杂交结果 °≤• ³µ²§∏¦·¶²©§¬©©¨µ¨±·¦²¯²±¬¨¶~ ⁄‘„ 稀释梯度为 tΒu otΒw otΒ{ otΒty ⁄‘„
§¬¯∏·¬²±otΒu otΒw otΒ{ otΒty q底物 ≤≥°⁄发光法检测到的杂交信号 ≥∏¥¶·µ¤·¨ ≤≥°⁄ ° ·¨«²§©²µ§¨·¨¦·¬±ª«¼¥µ¬§¬½¤·¬²±¶¬ª±¤¯ q…o≤ }不同菌株 °≤•
产物的杂交结果 ‹¼¥µ¬§¬½¤·¬²±µ¨¶∏¯·¶²©§¬©©¨µ¨±·¶·µ¤¬±¶²© Αγροβαχτεριυµ ¶³³q…}t q„× p Š˜≥ p ‹ p x{s ~u q„× p ≤ƒ≤≤tsst p η ~v q Αqρηιζογενσp
η ~w q„× p Š˜≥ p ϖ~x q„× p ׋ p ϖ~y q„• p ϖ~z q„× p ≤ƒ÷÷tsst p ιπτ ~{ qŽvs{ p √ q≤ }t1  Šts p t p ιπτ ~u q Štt p t p ιπτ ~v qŽvs{ p ιπτ ~
w qŽuz p ιπτ ~x q≤≠w p ιπτ ~y q…u{y p „ p ιπτ ~z q …u{y p „ p ιπτ ~{ qŠttkul p ιπτ ~| q清水对照 • ¤·¨µ¦²±·µ²¯ ~ts q„×ttyws p ιπτ ~tt q„×ttyws
p ϖ~其中 η oιπτ oϖ分别代表用 Ηαρπιν oιπτ o ςιρ⁄u基因引物扩增产物 η oιπτ oϖµ¨³µ¨¶¨±··«¨ °≤• ³µ²§∏¦·¶∏¶¬±ª³µ¬° µ¨Ηαρπιν oιπτ ¤±§ ςιρ⁄u
µ¨¶³¨¦·¬√¨¯¼ q‘…×Π…≤Œ°显色反应 ≥·¤¬±¬±ªµ¨¤¦·¬²± º¬·«‘…×Π…≤Œ° q
v 讨论
由于致病根癌土壤杆菌 !发根土壤杆菌与非致病放线土壤杆菌等在培养性状 !理化特性上近似 o通常要
通过生物学接种方法才能最终确定其致病特性 ∀用向日葵 !番茄等幼苗接种至获得结果一般需要 t ∗ u周的
时间 o接种试验也会造成病菌在试验室 !温室或大田的污染或病菌潜在人为传播 ∀本研究用 °≤• 结合探针
杂交技术 o成功地快速鉴定致瘤性根癌土壤杆菌 !鉴别诱发植物土壤杆菌及区分非致病的放线土壤杆菌 ∀通
过探针杂交进一步验证和提高 °≤• 结果的可靠性也是口岸及苗木检疫的必需技术环节 ∀从田间样品采集
到初步的 °≤• 鉴定能在 u ∗ w §内完成 ∀如果直接从瘤组织抽提 ⁄‘„进行 °≤• o则可将鉴定时间缩短为 t ∗
u §∀在病区或发病苗圃商业化调运种苗过程中 o发病苗木或发病瘤组织已被人为淘汰 o但苗木被病菌污染
或感染的几率仍很高 o病害潜在传播的危险性也会更大 ∀由于非瘤组织内病菌含量极低 o造成常规的症状诊
断 !分离培养和接种鉴定病菌技术的准确性和应用范围受到很大的限制 o或出现漏检问题 ∀而 °≤• 的高灵
敏度和特异性 o加上选择性培养基的利用 o可以克服常规方法的不足 o做到对低浓度病菌的准确快速检测和
鉴定 ∀这在口岸和国内苗木检疫 !流行学调查 !培养菌株的致瘤能力和致病性变异监测等方面具有很大的应
用潜力和价值 o也为下一步研制适用于大量样本快速检测试剂盒或开发基因芯片技术奠定了必要基础
k≥¤º¤§¤ ετ αλqot||v ~t||x ~⁄²±ª ετ αλqot||u ~≤∏¥¨µ² ετ αλqot|||l ∀笔者将尝试用此技术与 …Œ’’Š自动快
速微生物鉴定仪k¬¦µ²¶·¤·¬²±× l结合用于土壤杆菌属的快速准确鉴定 !鉴别研究和应用 ∀
河北廊坊白家务乡王小寨村桃园 t|||年从辽宁引进 w sss余株桃苗 o至 usss年发现病树花芽发育不正
常 !果实不能成熟或提前脱落 o枝条修剪时发现木质部变色 o挖根后才发现根瘤症状 ∀至调查时全园内桃树
发病率很高 o严重区病株率达 tss h ∀本试验通过分子鉴定方法确证了根癌土壤杆菌已成为该果园土壤内
|y 第 u期 田国忠等 }我国木本植物致病性土壤杆菌的分子检测和比较鉴定
图 y 用 ιπτ基因 ¦• ‘„探针与不同来源 ⁄‘„ 进行的
±²µ·«¨µ± ¥¯²·杂交结果
ƒ¬ªqy ‘²µ·«¨µ± ¥¯²·²© ⁄‘„ º¬·«¦• ‘„ ³µ²¥¨ ²© ιπτ ª¨ ±¨ ©µ²°
Αqτυµεφαχιενσ ¤¶¶²¦¬¤·¨§º¬·«³²¯¤µ¶·¨° ª¤¯¯ §¬¶¨¤¶¨ ¬± ≤«¬±¤
t q克隆菌株质粒 ⁄‘„ ׫¨ ¦¯²±¨ §³¯¤¶°¬§³Š∞2v½©¬±¶¨µ·¨§º¬·« ιπτ
ª¨ ±¨ ©µ¤ª° ±¨·~u q杨树根癌土壤杆菌 ιπτ基因克隆质粒 ³Š∞2v½©
k nΠp l°≤• 扩增产物 °µ²§∏¦·²©¤°³¯¬©¬¨§³¯¤¶°¬§⁄‘„ ²©³Š∞2v½©
¦²±·¤¬±¬±ª ιπτ ª¨ ±¨ ©µ¤ª°¨ ±·²© Αq τυµεφαχιανσ~v q杨树根癌土壤杆
菌转化的泡桐瘤组织 „× p ‹ ⁄‘„ 的 ιπτ 引物扩增产物
„°³¯¬©¬¨§⁄‘„ ²©·µ¤±¶©²µ° §¨³¤∏¯²º±¬¤·∏°²µ·¬¶¶∏¨¶k„× p ‹l ¥¼
³²³¯¤µ„× ~w q杨树根癌土壤杆菌 °≤• 扩增产物 °≤• ³µ²§∏¦·²©
³²³¯¤µ„× ~x q泡桐病组织 ⁄总 ⁄‘„ ײ·¤¯ ⁄‘„ ²© ³¤∏¯²º±¬¤ ⁄
·¬¶¶∏¨¶¬±©¨¦·¨§º¬·«³«¼·²³¯¤¶°¤¶~y q泡桐健组织 ‹ 总 ⁄‘„ ײ·¤¯
⁄‘„ ²©«¨ ¤¯·«¼ ³¤∏¯²º±¬¤‹ ·¬¶¶∏¨¶~z q含 ιπτ wuz ¥³片段的纯化质
粒 ³Š∞2v½©k nΠp l °∏µ¬©¬¨§ ³Š∞2v½© «²µ¥²µ¬±ª ιπτ wuz ¥³ ª¨ ±¨
©µ¤ª° ±¨·q
的优势致病种群 ∀虽然调运种苗时并未对苗木原产地发
病情况和苗木的带菌状况进行调查和检疫处理 o但推断
病菌从此苗木原产地传入该园的可能性极大 ∀本试验从
桃园附近的群众杨k小美旱杨lk Ποπυλυσ≅ Ξιαοζηυανιχα ¦√ q
− ποπυλαρισ. l成年林土壤内也分离鉴定出根癌土壤杆菌 o
但在群众杨林内未有根癌病树 ∀有资料显示 o群众杨为
我国 us世纪 {s年代选育鉴定的一种杂交杨品种 o其母本
为青杨派的河南小叶杨k Πq σιµονιιl o黑杨派的美国钻天
杨k Πq πψραµιδαλισl和旱柳k Σαλιξ µατσυδαναl为混合父本
k赵天锡等 ot||wl ∀已知白杨派杨树品种对根癌病最感
病 o青杨和黑杨派对此病的抗性较强k向玉英 ot|{zl o因而
推断群众杨可能对此病害有强的抗性而不被此病菌感
染 o或虽被侵染 o但未表现明显的根癌症状 ∀也有报道指
出 o杨树对根癌病的抗性与其对细胞分裂素的敏感程度
有相关性 o能耐受更高浓度的细胞分裂素k…„l处理的品
种对根癌病的抗性也强k…¨ ±¨ §§µ¤ ετ αλqot||yl ∀当然 o也
不排除后来由桃园内的病菌通过土壤或流水传入杨树林
内 o在没有损伤的情况下病菌未能侵染杨树而发病的可
能性 ∀
tl 陶玲珠 o王一君 qt|{t q从日本来带有病虫的樱花树苗的处理经过 q植物检疫参考资料
ul 许晓波 o马 玉 o王 燕 qusss q樱花根癌病发生规律和控制措施 q交流材料
关于未能从北京玉渊潭公园樱花园病树根瘤上或病
树根围土中分离到致病根癌或发根土壤杆菌菌株的问题
值得进一步分析 ∀该园自 t|zu年接受日本赠送樱花品种
开始 o即出现根癌病的危害 ∀根据有关资料分析判断 o虽
然当时已将从日本引进的明显表现/根头癌肿病0症状的苗木或瘤组织进行了淘汰和销毁 o但受当时我国检
疫技术条件和水平等方面的局限 o根癌土壤杆菌仍可以附着在受污染的种苗和土壤而传入我全国的各樱花
引种区tl ∀针对此病害 o该公园曾采取了多年连续施用抗根癌生防菌剂处理患病苗木和土壤防治病害的措
施ul ∀很可能非致病生防菌剂的连年施用造成了此类微生物菌群的大量繁殖 o取代或抑制了致病的根癌土
壤杆菌的活动而成为园中根围土壤的优势种群 ∀所以从该地所分离到的具有土壤杆菌培养特征的菌株可能
以非致病的生防菌株为主k张静娟等 ot|{{ ~王慧敏等 ot||{l ∀有时从该园中分离到的个别菌落也扩增出比
典型致病菌株比如 ≤ƒ≤≤tsst !„×ttyws等弱的 wuz ¥³的带 o此时即使增加模板 ⁄‘„浓度和提高检测灵敏度 o
这些菌株也未能扩增出与阳性对照菌株一致强度的特异谱带 ∀这类弱带的出现可能与土壤或植物瘤组织上
存在痕量已部分降解的致病性土壤杆菌 ⁄‘„污染有关 ∀即使分离到活的目标菌 o其繁殖也受到培养基优势
生防菌的强烈抑制 ∀多年施用生防菌防治致病性土壤杆菌对微生物区系变化的影响到底有多大尚待深入探
讨k…∏µµετ αλqot||s ~²«±¶²± ετ αλqot||s ~…¨ ¤¯±ª¨µετ αλqot||x ~²³¨½ ετ αλqot|{|l ∀
土壤杆菌属以下种的分类一直存在以致病性为依据和以生理生化性状及其他特征为依据的不同分类方
案 ∀其中根癌土壤杆菌是最早被确定的种类 ∀在此种以下进一步根据生理生化特性分成 v 个生物型
k¥¬²·¼³¨ l o即 ´ !µ和 ¶型 ∀现在普遍接受土壤杆菌属包括了 w个与植物病害有关的致病种 o即根癌土壤杆
菌kΑq τυµεφαχιενσo原生物型 ´l !发根土壤杆菌kΑq ρηιζογενεσo原生物型 µl !葡萄土壤杆菌k Αq ϖιτισo原生物
型 ¶l和悬钩子土壤杆菌kΑqρυβιl o和一个非致病性种放射土壤杆菌k Αq ραδιοβαχτερl的分类方案k王金生 o
usss ~王慧敏等 ot||{ ~≥¤º¤§¤ ετ αλqot||v ~’³«¨¯ ετ αλqot||sl ∀但围绕此属的命名和分类问题仍存在不同观
点 o今后的分类是否有进一步变动也难有定论kƒ¤µµµ¤±§ ετ αλqoussv ~≥¤º¤§¤ ετ αλqot||v ~≠²∏±ª ετ αλqousst ~
ussvl ∀按本研究仍采用的致病性划分标准 o发根土壤杆菌应不含有 ιπτ基因而不能扩增出 wuz ¥³片段 o与
sz 林 业 科 学 wu卷
‹¤¤¶等kt||xl的研究结果一致 ∀但按生物型归种标准 o中国农业大学分离鉴定的属于不同生物型的根癌土
壤杆菌按新的标准将 Šts p t !Štt p t !≤≠w归为根癌土壤杆菌 oŽuz为发根土壤杆菌k生物型 µl oŽvs{ !
…u{y p „ !…u{y p …和 Šttkul为葡萄土壤杆菌k生物型 ¶lv个种k’³«¨¯ ετ αλqot||sl ∀从本试验的结果
看 oŽuz应该属于引致根癌的土壤杆菌类型 ∀从葡萄上分离鉴定的葡萄土壤杆菌多为窄寄主菌株 o象 Štt
kul常出现因质粒基因缺失检测不到 ιπτ基因片段的情况也属于正常k‹¤¤¶ ετ αλqot||x ~…∏µµετ αλqot||sl ∀
所以按新的种类划分标准 o质粒特性在种类划分上的作用会降低 o只能作为种以下不同致病型的划分依据 ∀
由于根癌土壤杆菌侵入植物组织后将 × p ⁄‘„整合到植物组织中 o因而用以 ≤≠×Π≤≠×.引物 °≤• 扩增整
合到瘤组织细胞染色体 ⁄‘„上的 wuz ¥³基因片段是鉴定和鉴别遗传转化瘤和非遗传转化瘤重要依据 o也是
区分由线虫 !虫瘿 !机械损伤 !根瘤菌等引致类似肿瘤组织的良好途径 ∀当田间采集的瘤组织提取的 ⁄‘„模
板同时扩增出 wuz和 vv{ ¥³两个片段时 o则至少说明瘤组织上存在致病性土壤杆菌 ∀从本实验结果来看 o
°≤• 足以检测到瘤组织中少量的致病菌 o并且有可能直接从土壤中抽提和浓缩 ⁄‘„用于 °≤• 检测 o而不必
经过菌落培养步骤k‹¤¤¶ ετ αλqot||xl ∀这也是环境 ⁄‘„和土壤微生物 ⁄‘„研究的重要途径之一 ∀
已知油橄榄肿枝病菌k Πσευδοµονασσψρινγαε πατηοϖαρσαϖαστανοιl在其质粒上也具有类似 ιπτ基因k πτζl o且
与根癌土壤杆菌的 τζσ位点推导的氨基酸有 xs h序列同源性kŒ¤¦²¥¨¯¯¬¶ ετ αλqot||wl ∀本次所制备的 ¦• ‘„
探针是否与此病菌 !棒杆菌k Χορψνεβαχτεριυµ φασχιανσl及其他具有细胞分裂素合成能力的植物病原细菌或真菌
有杂交信号尚待进一步试验研究k°²º¨ ¯¯ ετ αλqot|{y ~ ²µµ¬¶ot|{yl ∀因而 oιπτ2≤• ‘„探针可以用于从其他
微生物中克隆类似细胞分裂素的基因 o已有的研究已证明固氮根瘤菌k Ρηιζοβιυµ ¶³ql中与细胞分裂素合成
相关基因 ιχρ与 τζσ和 πτζ基因无同源性kפ¯¯¨µετ αλqot||tl ∀
已报道的从根癌土壤杆菌株上克隆的功能 ιπτ基因的序列分别约为 t uut ¥³k³×¬vzl !||s ¥³k³‹≤®±vtul
和 t zss ¥³k„¦‹xlk„¬±¯ ¼¨ ετ αλqot||v ~׫²°¤¶ ετ αλqot||x ~ ¦Ž¨±½¬¨ ετ αλqot||wl o从杨树根癌土壤杆菌上
克隆的片段的序列与已报道的根癌土壤杆菌的同源性较高 o其探针与其他木本植物上分离的致病性土壤杆
菌的杂交结果也进一步表明不同菌株间的同源性都很高 ∀虽然植原体也同为原核生物 o并有报道存在染色
质外类似质粒的 ⁄‘„结构 o病菌能引起泡桐等众多植物丛枝症状 o因而推断植原体可能存在类似根癌土壤
杆菌的细胞分裂素基因 ∀但从以前和本试验进行的 °≤• 和探针杂交结果判断 o在植原体染色质和染色质外
⁄‘„上未检测到与根癌土壤杆菌同源性序列 o故推断植原体不存在与根癌土壤杆菌类似的 ιπτ基因结构 o或
根本无任何自主的细胞分裂素合成能力k田国忠等 ousstl ∀所以 o植原体的生长和繁殖所需要的某些物质特
别是激素类物质的代谢过程尚不清楚 ∀
参 考 文 献
方中达 qt||{ q植病研究法 qv版 q北京 }中国农业出版社
李 英 o王 均 qt|{z q致癌土壤杆菌 Žp {菌株的分离和几株致癌土壤杆菌的初步鉴定 q云南植物研究 owktl }{v p {z
林业部野生动物和森林植物保护司主编 qt||s q森林植物检疫对象和检疫技术 q长春 }吉林科学出版社
倪大炜 o张炳欣 o沈 杰 qt||| q日本樱花根癌病病原菌的鉴定及其防治 q微生物学通报 ouyktl }tt p tw
任欣正 o罗灿辉 o方中达 qt||s q根癌土壤杆菌新生物种的鉴定 q植物病理学报 ouskvl }t|x p uss
孙艳丽 o王慧敏 o王建辉 qusss q苹果根癌病菌系及生物防治的初步研究 q植物病理学报 ovskwl ott
田国忠 qt||| q泡桐丛枝病植原体与泡桐的生化和分子互作研究 q中国农业大学博士学位论文
田国忠 o张锡津 o朱水芳 o等 qt||y q间接免疫荧光显微术检测泡桐丛枝病原 ’的研究 q林业科学研究 o|ktl }t p y
田国忠 o朱水芳 o罗 飞 o等 qusst q根癌农杆菌对感染植原体的泡桐组培苗症状的影响 q林业科学研究 otwkvl }ux{ p uyt
王慧敏 o李健强 o隋新华 o等 qt||{ q玫瑰根癌病原及其敏感的生防菌 q中国农业大学学报 ovk增刊l }{v p {z
王金生主编 qusss q植物病原细菌学 q北京 }中国农业出版社 o{t p {z
向玉英编著 qt|{z q杨树病虫害及其防治 q北京 }中国林业出版社 o{t p {w
游积峰 o马德钦 o相望年 o等 qt|{x q葡萄根癌杆菌的不同生化型对葡萄及其它植物致病性的初步研究 q植物病理学报 otxkul }zv p z|
张静娟 o周 娟 o相望年 qt|{{ q中国毛白杨根癌土壤杆菌的类型和对土壤杆菌素敏感性的研究 q微生物学报 ou{ktl }tu p t{
张锡津 qt|{s q杨树根癌病的病原鉴定 q林业科技通讯 okvl }uu p uw
赵天锡 o陈章水主编 qt||w q中国杨树集约栽培 q北京 }中国科学技术出版社 ov|t p v||
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tz 第 u期 田国忠等 }我国木本植物致病性土壤杆菌的分子检测和比较鉴定
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Αγροβαχτεριυµ ραδιοβαχτερ¶·µ¤¬±¶²± ¶·²±¨ ©µ∏¬··µ¨ ¶¨q „³³¯ ∞±√¬µ²± ¬¦µ²¥¬²¯ oxx }zwt p zwy
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ρηιζογενσo Ρ q ρυβι o Ρ q υνδιχολα ¤±§ Ρ q ϖιτισqŒ±·≥¼¶·∞√²¯ ¬¦µ²¥¬²¯ oxt }{| p tsv
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k责任编辑 朱乾坤l
uz 林 业 科 学 wu卷