全 文 ：第 50 卷 第 7 期
2 0 1 4 年 7 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 50，No. 7
Jul．，2 0 1 4
doi:10．11707 / j．1001-7488．20140705
收稿日期: 2013 － 09 － 11; 修回日期: 2013 － 11 － 19。
基金项目: “十二五”国家科技支撑项目“北方针叶树种高世代育种技术研究与示范”(2012BAD01B01)。
* 王军辉为通讯作者。
云杉体细胞胚萌发前的干化标记*
张建伟 王军辉 张守攻 李青粉 夏 燕
(中国林业科学研究院林业研究所 国家林业局林木培育重点实验室 北京 100091)
摘 要: 针对云杉体细胞胚萌发率极低和萌发质量不高的问题，以高同步化体细胞胚为材料，对干化方式、干化
时间和干化普遍性等影响干化处理的因素进行探讨，并建立基于形态和颜色识别的云杉体细胞胚的干化标记。结
果表明: 采用“滤纸容器法”的干化方式更适用于云杉体细胞胚的干化处理; 干化处理 2 周后能够获得最高的萌发
率; 本试验提供的干化处理方案对萌发促进作用具有普遍的适用性; 以健壮的绿色子叶、胚轴及红色胚根为标记
的体细胞胚能够普遍获得高的萌发率(平均 83. 63% )和较好的萌发质量。
关键词: 云杉; 体细胞胚; 萌发; 干化标记
中图分类号: S718. 46 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2014)07 － 0031 － 06
A Desiccation Indicator before Germination of Picea asperata Somatic Embryos
Zhang Jianwei Wang Junhui Zhang Shougong Li Qingfen Xia Yan
(Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation of State Forestry Administration Ｒesearch Institute of Forestry，CAF Beijing 100091)
Abstract: In order to overcome the low germination rate and plantlet quality of Picea asperata，partial desiccation
factors，such as drying approaches，drying time and universality，were investigated with highly synchronized somatic
embryos，and a crucial partial desiccation indicator was established based on variation in the embryos morphology and
color ． The results indicated that the“paper vessel method”was more appropriate for the partial desiccation treatment，and
the maximum germination rate was obtained with drying treatment for two weeks． Meanwhile，this study provided a drying
treatment program which showed a general applicability for somatic embryos of P． asperata． The marked embryos of green
cotyledon，hypocotyle and red radical could universally obtain high germination rate( average 83． 63% ) and good plantlet
quality．
Key words: Picea asperata; somatic embryo; germination; partial desiccation indicator
植物体细胞胚胎发生技术是利用植物细胞工程
手段实现植株再生的重要途径之一，在针叶树种的
快速繁殖过程中，通常被认为是一种最具生产潜力
和商业前景的植物无性繁殖技术(Klimaszewska et
al．，2007; Ｒose et al．，2010)。一个完整的体细胞胚
胎发生过程包括胚性愈伤组织的诱导、增殖和成熟
体细胞胚的分化、萌发 4 个阶段 ( Stasolla et al．，
2003); 其中，成熟体细胞胚的萌发阶段作为整个技
术体系的最后一步，体细胞胚萌发率及萌发质量的
高低直接决定着最终体胚苗的收获量和整个体胚技
术体系构建的成败( Joshi et al．，2013)。目前，在针
叶树体细胞胚萌发阶段，为提高体细胞胚的萌发率
和萌发质量，国外常用的方法是将体细胞胚萌发之
前进行干化( desiccation)预处理。通常，失水现象
是体细胞胚由成熟阶段向萌发阶段转变的最直接响
应，可以促使体细胞胚由形态成熟向生理成熟转变，
因此，对体细胞胚而言，给予适当的干化失水处理，
不仅能够抑制体细胞胚的提早萌发，还能够提高萌
发阶段中的萌发率和质量( von Arnold et al．，2008)。
一般根据体细胞胚失水速率的变化，可以将体
细胞 胚 的 干 化 处 理 方 法 分 为 完 全 干 化 ( full
desiccation) 和部分干化 ( partial desiccation ) 2 种
(Hay et al．，1999); 前者主要由渗透压调节物质实
现，而后者主要通过水蒸气变化调节。由于渗透物
质进行干燥处理时无菌环境不易实现，因此目前国
外常用的干化处理方法主要为部分干化方法。已经
证实，采用部分干化方法对体细胞胚进行预处理后，
能够极大提高大量针叶树种体细胞胚的萌发率，包
林 业 科 学 50 卷
括欧洲云杉 ( Picea abies) ( Find，1997; Hgberg et
al．，1998; Bozhkov et al．，1998 )、红 云 杉 ( Picea
rubens)(Harry et al．，1991)、白云杉 ( Picea glauca)
( Attree et al．，1991; Kong et al．，1995 )、黑云杉
(Picea mariana)(Beardmore et al．，1995)、高加索冷
杉(Abies nordmanniana) ( Nrgaard，1997)、杂种落
叶松(Larix × leptoeuropaea) ( Lelu et al．，1994)、展
叶松(Pinus patula)( Jones et al．，2001)、黑松(Pinus
thunbergii)、赤松 ( Pinus densiflora)、Pinus armandii
var． amamiana(Maruyama et al．，2012)。尽管干化
处理能够有效提高萌发率，然而影响干化处理效果
的因素有很多: 干化方法的差异、干化处理持续的
时间、树种的不同，甚至相同树种不同基因型之间对
相同干化处理的响应都存在很大差异。因此继续采
用单一的干化处理条件，已经不能够满足体细胞胚
萌发的需要。
云杉(Picea asperata)为我国特有种，同时也是
云杉属树种中分布较广的树种，具有重要的工业价
值(中国植物志编辑委员会，1978; 四川省云杉纸
浆材协作组，2001)。在过去 2 年，本实验室建立了
较为完善和高效的云杉体细胞胚胎发生技术体系。
本文以云杉分化产生的高同步化体细胞胚为研究对
象，针对体细胞胚萌发率极低和萌发质量不高的问
题，首次报道了一种云杉体细胞胚的干化处理技术，
并对其普遍适用性进行讨论，提出了一种基于体细
胞胚形态和颜色变化的干化标记。这种标记排除了
其他一切干化影响因子的干扰，能够极大提高体细
胞胚的萌发效率，为最终实现体细胞胚的工厂化育
苗奠定坚实的基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
云杉高同步化的体细胞胚通过 2 种方式获得:
一种是对建立起悬浮增殖体系的细胞系 1921 和
1931 而言，将悬浮增殖的胚性愈伤组织按照静置体
积和无激素添加的液体培养基体积比 1 ∶ 3的比例混
合，取摇匀的培养基 5 mL 放置在滤纸(WhatmanTM
2)上，用布氏漏斗抽滤后，将附有愈伤组织的滤纸
转接到分化培养基上培养; 另一种是对于半固体增
殖的细胞系 1113，1911，1921，2322，2614 和 2711
而言，将转接增殖 2 周后的胚性愈伤组织直接平铺
到滤纸上，随后在分化培养基上培养。2 种方式采
用相同的分化培养基和培养条件; 培养基成分为
1 /2 LM(Litvay et al．，1985) + 脱落酸(ABA，过滤灭
菌，Gibco#) 16 mg·L － 1 + PEG4000 (Merck#) 50 g·
L － 1 + 蔗糖 30 g·L － 1 + 活性炭( Sigma#)1 g·L － 1 +
凝胶( gellan gum，Sigma #) 4 g·L － 1，附加谷氨酰胺
(过滤灭菌，Sigma#)500 mg·L － 1、水解酪蛋白( Sigma
#)1g·L － 1。pH 5. 8，(24 ± 1)℃黑暗培养，7 周后分
化产生的成熟体细胞胚作为试验材料。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 干化方法的比较 以 1921 悬浮增殖系分化
的体细胞胚为材料，采用目前国外常用的“滤纸桥
法”(Gemperlova et al．，2009)、“空培养皿法”( von
Arnold et al．，2008)和本实验室建立的“滤纸容器
法”进行 3 种干化方法的比较。1)“滤纸桥法”即将
体细胞胚放置在塑料培养皿 (35 mm × 12 mm)中，
随后将塑料皿放置在更大的玻璃培养皿(87 mm ×
15 mm)内，玻璃皿中放置 10 mL 无菌水，用 2 层湿
润滤纸覆盖在塑料皿上做成滤纸桥，最后玻璃皿用
封口膜封口。2)“空培养皿法”操作同“滤纸桥法”，
只是不做滤纸桥。3)“滤纸容器法”即将发育完全
的体细胞胚放置在垫有 2 层滤纸的塑料培养皿(35
mm × 12 mm)中，随后将塑料皿放置在更大的玻璃
培养皿(87 mm × 15 mm)内，玻璃皿中放置 10 mL
无菌水，这样使得体细胞胚处于一面相对干燥四周
相对湿润的环境中，玻璃皿用封口膜封口。每种干
化方式 5 次重复，每个重复 30 个体细胞胚，一个塑
料皿一重复。随后，将这 3 种方法干化处理的体细
胞胚放置在 15 μmol·m － 2 s － 1的弱光下培养 2 周，观
察塑料皿内体细胞胚的形态和颜色变化。
1. 2. 2 干化时间的比较 以 1931 悬浮增殖系分化
的体细胞胚为材料，采用“滤纸容器法”干化方式，
干化处理 0，1，4，7，14，21 天后，分别进行萌发。每
个处理设置 5 次重复，1 个塑料皿放置 30 个发育完
整的体细胞胚作为 1 个重复。萌发培养基为
1 /4LM +蔗糖 20 g·L － 1 + 凝胶 6 g·L － 1 + 活性炭
1 g·L － 1，附加谷氨酰胺 500 mg·L － 1、水解酪蛋白
1 g·L － 1。pH 5. 8，(24 ± 1)℃黑暗培养 1 周，随后转
到20 μmol·m － 2 s － 1光下培养，3 周后统计正常萌发
的体细胞胚数量。
1. 2. 3 干化处理的普遍性 以半固体增殖的细胞
系 1113，1911，1921，2322，2614 和 2711 分化的体
细胞胚为材料，用“滤纸容器法”干化方式，干化处
理 0 天和 14 天后，分别进行萌发。每个处理设置 5
次重复，1 个塑料皿放置 30 个发育完整的体细胞胚
作为 1 个重复。萌发培养基和培养条件同 1. 2. 2。
1. 2. 4 体细胞胚的干化标记 以 1921 和 1931 悬
浮增殖系分化的体细胞胚及 1113，1911，1921，
2614 和 2711 半固体增殖分化的体细胞胚为材料，
23
第 7 期 张建伟等: 云杉体细胞胚萌发前的干化标记
采用“滤纸容器法”干化方式，干化处理 14 天后，根
据干化处理后的形态和颜色变化，将体细胞胚分为
2 种类型:无颜色变化型，绿色子叶、胚轴和红色胚
根型。分别将这 2 种类型的胚进行萌发，每个处理
设置 4 次重复，1 个塑料皿放置 30 个发育完整的体
细胞胚作为 1 个重复。萌发培养基和培养条件
同 1. 2. 2。
1. 3 数据分析
最高失水率(% ) = (未经干化处理的体细胞胚
鲜质量 －干化处理后最低含水率时体细胞胚的鲜质
量) /体细胞胚的鲜质量 × 100% ; 萌发率(% ) = 正
常萌发的体细胞胚数量 /参试萌发的体细胞胚数
量 × 100%。使用 SPSS16. 0 的 Duncan 法进行多重
比较，所有百分率数据分析前先进行反正弦转换。
2 结果与分析
2. 1 干化方法的比较
3 种干化方法处理后的体细胞胚表现见表 1。
“滤纸桥法”由于使得体细胞胚周围的湿度过大，培
养皿中的胚多数被水浸泡，这种处理方式重复性较
差，且操作较为繁琐，经验性较强，滤纸桥稍处理不
当，就容易导致干化失败。相比之下，“空培养皿
法”尽管没有使得胚被水浸泡的风险，但是干化处
理 2 周后发现，重复间的体细胞胚无明显颜色变化;
对水分测定发现，在干化处理 1 天时，胚的最高失水
率只有 15. 75%，随后含水率逐渐升高; 结合后期胚
萌发的标记需要，对云杉体细胞胚干化而言，“空培
养皿法”同样不适用。“滤纸容器法”处理后的体细
胞胚颜色变化明显，刚从分化培养基中分离的体细
胞胚呈淡黄色，子叶明显，胚轴粗壮(图 1a，d); 在
干化处理 1 天时，胚的失水率占鲜质量的 23. 72%，
占总含水量的 41. 83% ; 随着干化时间的延长，胚的
含水量逐渐升高，伴随着水分的变化，胚轴不断伸长
变粗，干化处理 1 周后，胚根部逐渐变红 (图 1b，
e); 随后子叶和胚轴开始变绿，干化处理 2 周后，绿
色子叶和胚轴的胚明显增多(图 1c，f)，继续干化处
理颜色不再明显变化。
表 1 3 种干化方法处理后的体细胞胚表现
Tab． 1 Somatic embryo performance after drying treatment with three approaches
干化方法
Drying method
最高失水率
Highest water loss rate(% )
处理 2 周后体细胞胚表现
Embryo performance after drying for 2 weeks
滤纸桥法
Paper bridge method
—
体细胞胚颜色无变化; 培养皿中湿度较大，60%的胚被水浸泡; 重复性差
No color change， high humidity in petri dish， more than 60% were soaked，
poor reproducibility
空培养皿法
Empty petri dish method
15. 75 干化过程中体细胞胚颜色无明显变化
; 胚水分丢失少; 重复性较好
No obvious color change during partial desiccation，less water loss，reproducible
滤纸容器法
Paper vessel method
23. 72
体细胞胚形态分化和颜色变化明显; 胚水分丢失多; 重复性很好
Obvious morphological differentiation and color change， more water loss，
good repeatability
2. 2 干化时间的比较
由表 2 可知，云杉体细胞胚不经干化处理时萌
发率极低，干化处理时间对云杉体细胞胚的萌发具
有极显著(P ＜ 0. 01)的影响。随着干化时间的延
长，体细胞胚的萌发率逐渐提高。干化处理 14 天
时，体细胞胚的萌发率最高可以提高 52. 15% ; 继续
进行干化处理 21 天时，体细胞胚萌发率显著降低。
说明干化处理 2 周能够有效地提高云杉体细胞胚的
萌发。
2. 3 干化处理促进萌发的普遍性
为了确定干化处理对云杉体细胞胚萌发的促
进作用是否具有普遍性，挑选另外 6 个细胞系的
体细胞胚分别干化 0 天和 14 天对比萌发。结果
(表 3)表明，体细胞胚不经过干化预处理而直接
进行萌发时，萌发率极低或者不能够正常萌发; 而
经过干化 14 天的处理后，不同细胞系间体细胞胚
的萌发率均得到极显著的提高。此外，经过干化
预处理后，不同细胞系间体细胞胚的萌发率存在
极显 著 的 差 异 ( P ＜ 0. 01 )，萌 发 率 提 高 从
30. 79%到 62. 96%不等。因此，在不同细胞系间，
干化处理对云杉体细胞胚萌发的促进作用均具有
普遍性。然而，对于部分细胞系产生的体细胞胚
而言，这种促进作用依旧有限，并不能满足实际生
产的需要，推测可能由不同细胞系所需要的干化
条件存在差异所导致。因此，为了提高云杉体细
胞胚的萌发质量，开发一种不依赖外界条件的干
化标记显得尤为必要。
33
林 业 科 学 50 卷
表 2 干化处理时间对云杉体细胞胚萌发的影响①
Tab． 2 Effect of partial desiccation time on somatic
embryo germination of P． asperata
干化处理时间
Partial desiccation time / d
萌发率
Germination rate( ± SD) (% )
0 4. 67 ± 1． 83 a
1 7. 34 ± 2． 80 ab
4 14. 00 ± 2． 82 b
7 24. 68 ± 3． 93 c
14 56. 83 ± 8． 25 d
21 33. 50 ± 12． 09 e
①同一列中不同字母表示 0. 05 水平差异显著，相同字母表示差
异不显著。下同。Means within a column followed by different letters
show significant difference from each other at a level P = 0. 05，and same
letters indicate no significant difference． The same below．
表 3 干化处理对云杉不同细胞系间体细胞胚萌发的影响
Tab． 3 Effect of partial desiccation on different lines
somatic embryos germination of P． asperata
细胞系 Lines
萌发率 Germination rate( ± SD) (% )
对照
CK
干化 2 周
Drying for two weeks
1113 0 53. 37 ± 8. 04 bc
1911 0 42. 05 ± 7. 81 ab
1921 0. 67 ± 0. 58 31. 46 ± 9. 92 a
2322 0 47. 89 ± 8. 82 b
2614 0 62. 96 ± 4. 17 c
2711 0 47. 90 ± 8. 47 b
2. 4 体细胞胚的干化标记
针对干化处理对云杉体细胞胚萌发率提高不同
步的问题，同时为了进一步提高萌发率，根据干化处
理过程中体细胞胚形态和颜色的变化情况，将干化
处理 14 天后的体细胞胚(图 2a)分为 2 种类型: 颜
色无变化型(图 2b)，绿色子叶、胚轴和红色胚根型
(图 2c)。形态学观察发现，颜色无变化型的体细胞
胚多细小。萌发结果见表 4。具有标记的体细胞胚
的萌发率极显著提高，平均达到 83. 63%，且在不同
细胞系间差异不显著(P ＞ 0. 05); 同时，标记后的
体细胞胚萌发的同步性极大提高(图 1g)，萌发的体
胚苗生长健壮，子叶伸展、胚轴直立、胚根粗壮 (图
1h)。尽管无变化型的体细胞胚在不同细胞系间的
萌发率存在极显著差异(P ＜ 0. 01)，但是萌发率普
遍很低，平均只有 18% ; 此外，萌发苗畸形率较高，
生根后不能继续生长。说明干化处理后的体细胞
胚，绿色子叶、胚轴和红色胚根型，其体细胞胚具有
较高的萌发率和较好的萌发质量，以此作为云杉体
细胞胚高萌发能力的标记，能够满足实际生产的
需要。
表 4 具有干化标记的云杉体细胞胚在
不同细胞系间的萌发比较
Tab． 4 Germination comparison of marked somatic
embryos among different lines in P． asperata
细胞系
Lines
萌发率 Germination rate( ± SD) (% )
颜色无变化型
No color changes
绿色子叶、胚轴和红色胚根型
Green cotyledon，hypocotyl，
and red radicle
1113 32. 06 ± 17． 22 d 90. 43 ± 11． 86
1911 15. 02 ± 5． 06 abc 74. 63 ± 6． 43
1921 22. 51 ± 2． 21 bcd 81. 26 ± 11． 67
1931 23. 45 ± 3． 66 cd 91. 64 ± 27． 58
2614 6. 67 ± 2． 90 a 86. 77 ± 5． 99
2711 8. 37 ± 10． 47 ab 77. 06 ± 12． 31
均值 Mean 18. 00 ± 6． 92 83. 63 ± 12． 64
3 结论与讨论
植物体细胞胚胎发生过程中，体细胞胚的大量
正常萌发，是实现体胚苗工厂化生产的关键。本研
究表明，云杉体细胞胚直接萌发时，体细胞胚的萌发
率极低或者不能正常萌发，而经过适当的干化处理
以后，能够极显著地促进萌发，说明在云杉体细胞胚
萌发之前，进行适当的干化处理对后期萌发来说至
关重要。
分化培养基上产生的体细胞胚往往只能达到形
态学上的成熟，而体细胞胚的正常萌发需要处于生
理成熟状态，干化处理的实质正是促进这种形态学
成熟向生理成熟转变的一个过程(Hay et al．，1999;
Stasolla et al．，2004)。在体细胞胚的干化过程中，干
化持续的时间在不同树种之间具有明显的差异，甚
至同一树种的不同基因型之间亦不相同。Harry 等
(1991)对红云杉体细胞胚分别干化处理 3 天和 6
天后，体细胞胚的萌发率分别为 94% 和 85%，而对
照只有 48%。对白云杉体细胞胚干化处理 10 天后
萌发率极显著提高，而对照不能正常萌发或萌发率
极低(Kong et al．，1995)。对欧洲云杉体细胞胚干
化 2 周后的萌发结果表明，在相同家系来源的不同
细胞系间，体细胞胚的萌发率存在极显著差异
(Hgberg et al．，1998)。 Jones 等(2001)研究表明，
干化处理 4 周最有利于展叶松体细胞胚的萌发。对
黑松、赤松和 Pinus armandii var． amamiana 的体细
胞胚进行干化处理 3 周后，平均萌发率较对照提高
4 倍以上; 然而，干化处理后不同树种间萌发率提
高的程度差异很大，相同树种不同家系间的萌发率
由 55%到 94%不等(Maruyama et al．，2012)。
可以看出，尽管干化处理能够显著提高体细胞
胚的萌发率，然而相同处理在不同树种间效应差异
43
第 7 期 张建伟等: 云杉体细胞胚萌发前的干化标记
图 1 云杉体细胞胚的干化过程和萌发
Fig． 1 Partial desiccation process and germination of
P． asperata somatic embryos
a． 干化 0 天无颜色变化的体细胞胚; b． 干化 7 天后红色胚根开始出
现的体细胞胚; c． 干化 14 天后绿色子叶胚开始增多的体细胞胚; d．
干化 2 周后颜色无变化的体细胞胚; e． 干化 2 周后淡红色胚根的体
细胞胚; f． 干化 2 周后绿色子叶、胚轴和红色胚根的体细胞胚; g． 干
化处理 2 周后萌发 2 周的幼苗; h． 具有绿色子叶、胚轴和红色胚根
为标记的体细胞胚萌发的幼苗。
a． Somatic embryos without color change with 0-day partial desiccation;
b． Somatic embryos with red radicle emerging after partial desiccation for
the first week; c． Some green cotyledonary embryos with red radicles
appeared after partial desiccation for two weeks; d． Somatic embryo
without color change after partial desiccation for two weeks; e． Somatic
embryo with faint red radicle after partial desiccation for two weeks; f．
Green cotyledonary embryo with red radical after partial desiccation for two
weeks; g． Marked somatic embryos germinating for two weeks after partial
desiccation for two weeks; h． Plantlet germinated from marked green
cotyledon，hypocotyl，and red radical embryo．
明显，尤其是相同树种不同基因型乃至细胞系间都
存在显著差异。在云杉体细胞胚干化处理促进萌发
过程中同样存在这种不同步的问题。这说明仅从干
化处理的方式和时间水平上并不能满足所有细胞系
的萌发需要。干化处理后，以绿色子叶、胚轴和红色
胚根作为干化标记，不仅能够普遍获得较高的萌发
率(平均 83. 63% )和较好的萌发质量，同时也可以
图 2 云杉体细胞胚的干化标记
Fig． 2 Desiccation indicator of P． asperata somatic embryos
a． 干化 14 天后，体细胞胚的干化状态; b． 干化 14 天后，无明显
变化的体细胞胚; c． 干化 14 天后，绿色子叶、胚轴和红色胚根
型的体细胞胚
a． After drying for 14 days，somatic embryos of P． asperata; b．
After drying for 14 days， somatic embryos without significant
changes; c． After drying for 14 days，somatic embryos with green
cotyledon，hypocotyl，and red radical．
避免干化处理的盲目性。由于不同系号的体细胞胚
在干化处理过程中都会变色，因此在云杉体细胞胚
萌发前进行干化处理时，以绿色子叶、胚轴和红色胚
根型的体细胞胚作为一种干化标记，不仅具有广泛
的适用性，同时由于颜色变化容易观察，对云杉体细
胞胚干化而言，还具有高效性。
目前，国内外尚未有其他针叶树种开展过有关
体细胞胚的干化标记研究，本研究提供了一种云杉
简单高效的体细胞胚干化处理技术，有可能为其他
相关树种的体胚发生研究提供借鉴。今后可以尝试
开展云杉属其他树种的干化标记研究，观察是否同
样存在类似云杉的标记研究策略。
参 考 文 献
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(责任编辑 徐 红)
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