舞毒蛾是一种食性很广、危害很大的世界性林木害虫,根据其地理分布和生活特性,现在被分为亚洲型和欧洲型2种。对来自俄罗斯远东地区、蒙古、日本、美国和中国5个地理种群,共26份舞毒蛾样品进行AFLP分子标记研究。成功建立并优化舞毒蛾AFLP分析体系,从16对引物组合中筛选出3对扩增条带多、多态检出率高的荧光标记引物组合,利用CEQ-8000遗传分析仪进行毛细管电泳及数据分析,共检测到507个多态性位点。通过PAUP软件对AFLP数据进行UPGM和NJ树的聚类分析以及遗传距离分析,结果表明: 5个地理种群舞毒蛾明显分成欧洲型(美国种群)和亚洲型,其中亚洲型又可分成俄罗斯、日本、中国及蒙古3个类群。美国种群间遗传变异比其他种群较大,中国种群与美国种群遗传距离最大,而与蒙古种群遗传分化最小。从分子水平上研究舞毒蛾不同种群的遗传分类情况,揭示利用AFLP分子标记技术可以区分舞毒蛾不同地理种群的基因型,为研究舞毒蛾的起源、入侵与扩散、遗传与变异以及检疫措施的制定等方面提供科学依据。
The gypsy moth, Lymantria dispar Linnaeus, is one of the most serious insect pests of palaearctic and nearctic forests. According to their geographical distribution and biology characteristics, they were divided into the Asian and European types of populations. We used amplified fragment length polymorphism (AFLP) to detect genetic diversities within and among the gypsy moth populations. Three fluorescent-labeled AFLP primer combinations were used on 26 L. dispar samples collected from different locations of Russia, Mongolia, Japan, United States of America and China, detecting a total of 507 polymorphic fragments. Genetic similarities based on these data were calculated and cluster analysis was performed to graphically display groupings between populations. L. dispar samples from these areas were grouped together corresponding to their origin. The result supported an observation that American population has greater genetic variation than other populations and has a longest genetic distance with the population of China. There was the smallest genetic differentiation between Mongolian population and the Chinese. The results demonstrate that AFLP analysis is a sensitive technique for distinguishing genotypes from different geographic origins and provides sufficient advice for the study of the origins of the gypsy moth, invasion and proliferation, heredity and variation, as well as developing quarantine measures.
全 文 :第 !" 卷 第 #$ 期
% $ # # 年 #$ 月
林 业 科 学
&’()*+(, &(-.,) &(*(’,)
./01!"!*/1#$
2345!% $ # #
舞毒蛾不同地理种群基于,Q-S分子标记的遗传分析
钱6路6安榆林6徐6梅6杨晓军6朱宏斌
"江苏出入境检验检疫局6南京 %#$$$#$
摘6要!6舞毒蛾是一种食性很广%危害很大的世界性林木害虫!根据其地理分布和生活特性!现在被分为亚洲型
和欧洲型 % 种& 对来自俄罗斯远东地区%蒙古%日本%美国和中国 9 个地理种群!共 %8 份舞毒蛾样品进行 ,Q-S分
子标记研究& 成功建立并优化舞毒蛾 ,Q-S分析体系!从 #8 对引物组合中筛选出 7 对扩增条带多%多态检出率高
的荧光标记引物组合!利用 ’)]A:$$$ 遗传分析仪进行毛细管电泳及数据分析!共检测到 9$" 个多态性位点& 通
过 S,qS软件对 ,Q-S数据进行 qShf和 *J树的聚类分析以及遗传距离分析!结果表明’ 9 个地理种群舞毒蛾明
显分成欧洲型"美国种群$和亚洲型!其中亚洲型又可分成俄罗斯%日本%中国及蒙古 7 个类群& 美国种群间遗传变
异比其他种群较大!中国种群与美国种群遗传距离最大!而与蒙古种群遗传分化最小& 从分子水平上研究舞毒蛾
不同种群的遗传分类情况!揭示利用 ,Q-S分子标记技术可以区分舞毒蛾不同地理种群的基因型!为研究舞毒蛾的
起源%入侵与扩散%遗传与变异以及检疫措施的制定等方面提供科学依据&
关键词’6舞毒蛾# ,Q-S# 分子标记# 遗传多样性
中图分类号! &"#:1"666文献标识码!,666文章编号!#$$# A"!::"%$####$ A$#$! A$"
收稿日期’ %$#$ A$7 A#$# 修回日期’ %$#$ A$: A$!&
基金项目’国家质检总局亚洲型和欧洲型舞毒蛾分子标记研究项目"%$$;(B%88$ # 科技部中美货物木质包装害虫调查监测及处理技术研
究国际合作项目"%$$;HQ,7#;9$$ &
=56.=’#&9/%/,0H%00*-*’$L*,4-#";%:.,"<$%,’/,0$;*L9"/9 D,$;!
=&2$0(*/$ 3/)’$*"6*"%(,"$*-#’ 69+#’$-%(#*$
]DIF -P6,F OP0DF6LP fND6OIFELDI/\PF6n?P T/FEYDF
"X-12+&0 <2’$(\
X/CNV4V5,33/CUDFE4/4?NDCEN/ECIK?D3I0UDV4CDYP4D/F IFU YD/0/EW3?ICI34NCDV4D3V! 4?NWMNCNUD[DUNU DF4/4?N,VDIF IFU
)PC/KNIF 4WKNV/XK/KP0I4D/FV5RNPVNU I@K0DXDNU XCIE@NF40NFE4? K/0W@/CK?DV@ ",Q-S$ 4/UN4N34ENFN4D3UD[NCVD4DNV
MD4?DF IFU I@/FE4?NEWKVW@/4? K/KP0I4D/FV5+?CNNX0P/CNV3NF4‘0IYN0NU ,Q-SKCD@NC3/@YDFI4D/FVMNCNPVNU /F %8 9!
A-&=1$VI@K0NV3/0N34NU XC/@ UDXNCNF40/3I4D/FV/XkPVVDI! f/FE/0DI! JIKIF! qFD4NU &4I4NV/X,@NCD3IIFU ’?DFI!
UN4N34DFEI4/4I0/X9$" K/0W@/CK?D3XCIE@NF4V5hNFN4D3VD@D0ICD4DNVYIVNU /F 4?NVNUI4IMNCN3I03P0I4NU IFU 30PV4NC
IFI0WVDVMIVKNCX/C@NU 4/ECIK?D3I0WUDVK0IWEC/PKDFEVYN4MNNF K/KP0I4D/FV59!A-&=1$VI@K0NVXC/@4?NVNICNIVMNCN
EC/PKNU 4/EN4?NC3/CCNVK/FUDFE4/4?NDC/CDEDF5+?NCNVP04VPKK/C4NU IF /YVNC[I4D/F 4?I4,@NCD3IF K/KP0I4D/F ?IVECNI4NC
ENFN4D3[ICDI4D/F 4?IF /4?NCK/KP0I4D/FVIFU ?IVI0/FENV4ENFN4D3UDV4IF3NMD4? 4?NK/KP0I4D/F /X’?DFI5+?NCNMIV4?N
V@I0NV4ENFN4D3UDXNCNF4DI4D/F YN4MNNF f/FE/0DIF K/KP0I4D/F IFU 4?N’?DFNVN5+?NCNVP04VUN@/FV4CI4N4?I4,Q-SIFI0WVDV
DVIVNFVD4D[N4N3?FDlPNX/CUDV4DFEPDV?DFEENF/4WKNVXC/@UDXNCNF4EN/ECIK?D3/CDEDFVIFU KC/[DUNVVPXD3DNF4IU[D3NX/C4?N
V4PUW/X4?N/CDEDFV/X4?NEWKVW@/4?! DF[IVD/F IFU KC/0DXNCI4D/F! ?NCNUD4WIFU [ICDI4D/F! IVMN0IVUN[N0/KDFElPICIF4DFN
@NIVPCNV5
>*9 ?,-(/’6EWKVW@/4?# @/0N3P0IC@ICZNC# I@K0DXDNU XCIE@NF40NFE4? K/0W@/CK?DV@",Q-S$# ENFN4D3UD[NCVD4W
6 6 舞 毒 蛾 " 9(G12’$-1 A-&=1$$ 属 鳞 翅 目
"-NKDU/K4NCI$! 毒 蛾 科 " -W@IF4CDUIN$! 毒 蛾 属
"9(G12’$-1$!其原产地为欧亚大陆!北到瑞典%挪
威%俄罗斯远东地区!南到非洲西北海岸线!东到日
本岛"hDNVN%’1*5! #;";$& 舞毒蛾的寄主范围广!危
害大!是世界性林业大害虫"王丽珍等! %$$8$&
S/EPN等"%$$"$根据雌性舞毒蛾翅的有无或飞
行能力的强弱!将舞毒蛾分为 7 个亚种!即欧美亚种
"9!A-&=1$A-&=1$$%亚洲亚种" 9!A-&=1$1&-1’-.1$%日
本亚种"9!A-&=1$Q1=#2-.1$& 而在这之前!欧洲亚种
被称为欧洲型舞毒蛾!而亚洲亚种和日本亚种则被
统称为亚洲型舞毒蛾"BNNFI! #;;!# #;;8# RI0FNC
6第 #$ 期 钱6路等’ 舞毒蛾不同地理种群基于 ,Q-S分子标记的遗传分析
%’1*5! #;;!# #;;9# GICIF3?DZ/[! #;:; $& #:8; 年!
欧洲型舞毒蛾被错误引入美国马萨诸塞州"Q/CYPV?
%’1*5! #:;8$!后在美国东北部和加拿大东南部迅速
扩散!为害林木面积达 %$$ 万 ?@% "钱天荣! %$$$$&
#;;# 年在加拿大温哥华港口附近首次发现亚洲型
舞毒蛾!随后在加拿大哥伦比亚%范库弗峰!美国华
盛顿%俄勒冈%北卡莱罗纳%爱达荷%得克萨斯等地也
相继发现"hDYY/FV! #;;;$& 美国对发现的疫情实施
了根除措施& 为了防止亚洲型舞毒蛾再次传入!美国
先后对来自俄罗斯远东地区%日本等地的船舶实施特
别检疫措施& %$$" 年以来!美国也曾多次与中国举
行会谈!提出拟对来自中国的船舶%货物及木包装实
施同类检疫措施& 因此!为了应对相关技术问题的需
要!避免来源地的混淆!研究舞毒蛾不同地理种群的
差异!提出其鉴定方法!显得极为重要&
尽管舞毒蛾存在生物学和形态学上的差异!但
至今仍没有完全可信的形态和行为特征可以用来区
分舞毒蛾不同基因型& 因此!生化标记和基因标记
技术常被用来区分舞毒蛾不同地理种群& 同工酶实
验揭示了日本%欧洲%美国种群间的基因差异
"TICCDV/F %’1*5! #;:7$!G/EUIF/MD3^等"#;;7$报道
了用线粒体 H*,作为舞毒蛾来源的示踪诊断!
SXNDXNC等"#;;9$运用 S’k与内切酶技术分析核糖
体 H*,!区分了亚洲和北美种群& 近年来!k,SH技
术和 ,Q-S技术也被用来作为舞毒蛾不同种群的分
子标记"hICFNC%’1*5! #;;8# kNDFNZN%’1*5! #;;;$&
,Q-S"I@K0DXDNU XCIE@NF40NFE4? K/0W@/CK?DV@$
是在 k,SH和 kQ-S的基础上发展起来的新一代分
子标记技术& 由于它既具有 k,SH标记的随机性!
方便性!又具有 kQ-S标记的专一性和可靠性!所以
被称为*最有力的分子标记+ "nIYNIP %’1*5! #;;7#
郑先云等! %$$7$& 笔者利用 ,Q-S技术研究了采
自俄罗斯远东地区%蒙古%日本%美国和中国 9 个地
理种群%共 %8 份舞毒蛾样品的遗传多样性!为研究
舞毒蛾的起源%入侵与扩散%遗传与变异以及检疫措
施的制定等方面提供科学依据&
#6材料与方法
@F@A供试昆虫
选用来自俄罗斯远东地区%蒙古%日本%美国和
中国 9 个地理种群!%8 份舞毒蛾成虫"卵$!另 % 份
栎毒蛾" 9(G12’$-1 G1’/0$1$样品作外类群分析!详
见表 #& 除黑龙江和吉林品系为作者采集外!其余
虫样均为美国农业部动植物检疫局王宝德博士馈
赠& 所有样品 A"$ d保存&
表 @A试验所用虫样信息!
)#2B@AL*,4-#";%:&,:#$%,’#’(9*#-,0:,&*:$%,’,0
=-3/)’$*#’(=-2$(,"*$ *(0,-=56.#’#&9/%/
地点
-/3I4D/F
简称
&?/C4X/C@
形态
f/CK?/0/EW
采集时间
ONIC/X
3/0N34D/F
俄罗斯! 沃斯托尼
./V4/3?FWW!kPVVDI
k.2# 成虫 IUP04 %$$"
俄罗斯! 沃斯托尼
./V4/3?FWW!kPVVDI
k.2% 卵 NEE %$$"
俄罗斯! 海参崴
.0IUD[/V4/Z! kPVVDI
k.-# 成虫 IUP04 %$$"
俄罗斯! 海参崴
.0IUD[/V4/Z! kPVVDI
k.-% 卵 NEE %$$"
俄罗斯! 海参崴
.0IUD[/V4/Z! kPVVDI
k.-7 成虫 IUP04 %$$"
俄罗斯! 纳霍德卡
*I?/UZI! kPVVDI
k*# 成虫 IUP04 %$$"
俄罗斯! 纳霍德卡
*I?/UZI! kPVVDI
k*% 成虫 IUP04 %$$"
俄罗斯! 斯拉维扬卡
&0I[WIFZI! kPVVDI
k& 卵 NEE %$$"
蒙古 f/FE/0DI fh# 成虫 IUP04 %$$"
蒙古 f/FE/0DI fh% 成虫 IUP04 %$$"
日本 JIKIF J,S# 成虫 IUP04 %$$"
日本 JIKIF J,S% 成虫 IUP04 %$$"
美国! 西弗吉尼亚州
RNV4.DCEDFDI! q&,
R.# 成虫 IUP04 %$$:
美国! 西弗吉尼亚州
RNV4.DCEDFDI! q&,
R.% 成虫 IUP04 %$$:
美国! 马萨诸塞州
fIVVI3?PVN4V! q&,
f,# 成虫 IUP04 %$$:
美国! 马萨诸塞州
fIVVI3?PVN4V! q&,
f,% 成虫 IUP04 %$$:
美国! 缅因州
fIDFN! q&,
f)# 成虫 IUP04 %$$:
美国! 缅因州
fIDFN! q&,
f)% 成虫 IUP04 %$$:
美国! 新泽西州
*NMJNCVNW! q&,
*J# 成虫 IUP04 %$$:
美国! 新泽西州
*NMJNCVNW! q&,
*J% 成虫 IUP04 %$$:
美国! 宾夕法尼亚州
SNFFVW0[IFDI! q&,
S,# 成虫 IUP04 %$$:
美国! 宾夕法尼亚州
SNFFVW0[IFDI! q&,
S,% 成虫 IUP04 %$$:
中国! 吉林
JD0DF! ’?DFI
J-# 成虫 IUP04 %$$;
中国! 吉林
JD0DF! ’?DFI
J-% 成虫 IUP04 %$$;
中国! 黑龙江
TND0/FE\DIFE! ’?DFI
T-J# 成虫 IUP04 %$$;
中国! 黑龙江
TND0/FE\DIFE! ’?DFI
T-J% 卵 NEE %$$;
美国 q&, -f# 成虫 IUP04 %$$;
美国 q&, -f% 成虫 IUP04 %$$;
66! -f#!-f%’ 栎毒蛾样本!作为外类群分析 9!G1’/0$1! X/C
/P4EC/PKV5
9$#
林 业 科 学 !" 卷6
@BCA主要试剂
限制性内切酶 <.#k%%I&%%"fG(公司$!+! A
H*,连接酶%J1SH*,聚合酶"+IZICI公司$# ,Q-S
接头’<.#k% IUIK4NC%I&%% IUIK4NC# ,Q-S引物’)$
和 f$"预扩增引物$%选择性扩增引物 )A,’,%f
A’,h%fA’,+%fA’+’!接头和引物均由英俊公
司合成!序列信息详见表 %# GN3Z@IF 公司 ’)]试
剂’H*,标准分子量"U*,&D^N&4IFUICU BD4A8$$$%
分离缓冲液 "VNKICI4D/F YPXNC$%分离胶 "VNKICI4D/F
EN0$%上样缓冲液"0/IUDFEYPXNC$&
表 CA荧光 =56.分析中的接头$预扩增和
选择性扩增引物序列!
)#2BCA[&%4,’<:&*,$%(*#(#"$,-/#’("-%+*-/
*(0,-=56.#’#&9/%/
名称 *I@N 代码’/UN 序列 &NlPNF3NV
<.#k%接头 9bA’+’h+,h,’+h’h+,’’A7b
<.#k%IUIK4NC 9bA,,++hh+,’h’,h+’+,’A7b
I&%接头 9bAh,’h,+h,h+’’+h,hA7b
I&%IUIK4NC 9bA+,’+’,hh,’+’,+A7b
预扩增引物
SCN‘I@K0DXD3I4D/F KCD@NC
)$ 9bAh,’+h’h+,’’,,++’,A7b
f$ 9bAh,+h,h+’’+h,h+,,’A7b
选择扩增引物
&N0N34D[NI@K0DXD3I4D/F
KCD@NC
)A,’, 9bAh,’+h’h+,’’,,++’,’,A7b
fA’,h 9bAh,+h,h+’’+h,h+,,’,hA7b
fA’,+ 9bAh,+h,h+’’+h,h+,,’,+A7b
fA’+’ 9bAh,+h,h+’’+h,h+,,’+’A7b
66!)A,’,经 ’O9 荧光标记!)A,’,分别与 fA’,h%fA
’,+%f A’+’组成引物对& )A,’, MIV0IYN0NU YW’O9! IFU
3/@YDFNU MD4? fA’,h!fA’,+!fA’+’5
@FEA试验方法
#171#6H*,提取6基因组 H*,的提取参照 G/W3N
等"#;:;$的方法!根据实际情况对试验步骤做了部分
修改& 用镊子挑取舞毒蛾成虫胸部肌肉或单个卵块
中挑 9 粒卵!用蒸馏水冲洗 7 遍!后将样品置于
#19 @-离心管中& 加8$$ $-S+)浸泡液于离心管中
在! d条件下过夜& 弃浸泡液!在解剖镜下挑取所浸
泡胸部肌肉或卵粒于新离心管中!用剪刀充分剪碎后
加匀浆缓冲液8$$ $-!99 d水浴过夜& 取水浴材料
加8$$ $-饱和酚!离心管上下颠倒% @DF混匀后放入
低温离心机: $$$ C)@DF A#离心#$ @DF& 离心结束取
上清液重复上步操作 # 次& 取上清液加8$$ $-氯仿a
异戊 醇! 颠 倒 % @DF 混 匀 后 放 入 低 温 离 心 机
: $$$ C)@DF A#离心#$ @DF& 取上清液加预冷 #$$>乙
醇"预置于 A" d$# @-混匀后放入 A%$ d冰箱保存
% ?沉淀 H*,& 于低温离心机 #% $$$ C)@DF A# 离心
9 @DF!弃 上 清 液 加 预 冷 乙 醇 " "9>$ # @-! 在
#% $$$ C)@DF A#离心9 @DF"此步重复 # 次$& 弃上清
液加预冷乙醇"#$$>$ # @-!在#% $$$ C)@DF A#离心
9 @DF!弃上清液取沉淀!晾干后加 7$ $-# e+)
"#$ @@/0)-A# +CDVA’0! KT:1$# # @/0)-A# )H+,!
KT:1$$溶解 H*,!放入 A%$ d冰箱中保存&
#171%6酶切&连接6采用限制性内切酶 <.#k%和
I&%%对 H*,进行双酶切& 酶切体系包括"总体积
%$ $-$’UUT%2#%1"9 $-!#$ e GPXNC%1$ $-!I&%
% "# q)$-A# $ %19 $-& <.#k% " #$ q)$-A# $
$1%9 $-!模板 H*,"#$$ FE)$-A# $ %19 $-& 7" d
酶切7 ?!89 d 处理#$ @DF& 酶切完成的 H*,加入
+! AH*,连接酶和人工接头!#8 d连接过夜&
#17176预扩增反应6取 ! $-酶切连接产物!加人
f$%)$"79 FE)$-
A#$各 # $-!#! $-,Q-S’/CNfD_!
包 含 UUT%2 "1: $-! fE’0% #18 $-! U*+SV
"%19 @@/0)-A#$ #18 $-! +Il 酶 " # q)$-A# $
# $-! #$ eGPXNC% $-! S’k反应 条件’ ;! d
% @DF# ;! d %$ V! 98 d 7$ V! "% d % @DF!
%$ 个循环# 8$ d 7$ @DF# 产物用 $1# e+)稀释 %$
倍备用&
#171!6选择性扩增反应6取 ! $-稀释后预扩增产
物!加入选择扩增引物组合 % $-!#! $-,Q-S’/CN
fD_& 反应条件’ ;! d % @DF# ;! d %$ V! 88 d
7$ V!"% d % @DF!每个循环降 # d!共 #$ 个循环#
;! d %$ V!98 d 7$ V!"% d % @DF!%$ 个循环#
8$ d 7$ @DF&
#17196’)]毛细管电泳检测 6选择性扩增的
,Q-S产物在 ’)]:$$$ hNFN4D3,FI0WVDV&WV4N@仪器
上进行毛细管电泳检测& 每个反应孔加人 7 $-稀
释 #$ 倍后的选择扩增产物!$1% $-标准分子量!
%$ $-上样缓冲液和约 #$ $-矿物油!上机检测& 电
泳结束后!通过软件自动采集数据!参照分子量内标
选取各引物对在 9$ c!$$ YK 的检测区域内的扩增
片段进行分析&
#17186数据分析6由 ’)]:$$$ 遗传分析仪采集数
据分析得到*$+%*#+矩阵!将每对引物的原始矩阵
合并为综合原始矩阵!用作分析& 用 S,qS! YN4I
!1$Y#$ 软件计算种群遗传距离并进行非加权组平
均法"qShf,$和邻结法"*J$聚类树分析&
%6结果与分析
CF@A舞毒蛾 =56.试验体系的优化
,Q-S分析对样品 H*,的质量要求较高!笔者
曾尝试使用不同方法提取样品的 H*,!最终使用
#171# 中描述的方法进行操作!所提样品的 H*,纯
度较好!2H%8$a%:$值在 #18 c#1; 之间!琼脂糖凝胶电
泳检测结果显示基因组 H*,较为完整!适合 ,Q-S
分析& <.#k%和 I&%%同步酶切和分开酶切效果相
8$#
6第 #$ 期 钱6路等’ 舞毒蛾不同地理种群基于 ,Q-S分子标记的遗传分析
当!建议双酶切同时进行!如图 # 所示& 还比较了酶
切%连接 # 步法和 % 步法的效果!发现酶切后再连接
比 # 步法更加稳定可靠& 预扩增产物经琼脂糖电泳
检测呈现弥散状!片段大小集中在 %$$ c# $$$ YK!
如图 % 所示&
图 76部分样品 ,Q-S荧光图谱
QDE576HI4I/XXD[N9!A-&=1$VI@K0NVX0P/CNV3NF3NVKN34CIYW,Q-SIFI0WVDV
引物组合’)A,’,afA’+’# IAN依次为样品 J-#!fh#!k*#!JS#!S,#5SCD@NC3/@YDFI4D/FV’
)A,’,afA’+’5IAN’ J-#!fh#!k*#!JS#!S,#
图 #6所提部分样品 H*,及酶切电泳
QDE5#6)_4CI34D/F IFU UDENV4D/F /XVI@K0NV4N@K0I4NH*,
# 为 H*,fICZNC%$$$! % 为 H*,样品! 7!! 为 <.#k%单酶切!
9!8 为 <.#k%aI&%%双酶切# %! 7! 9 为样品 -f#!!! 8 为样品
J-#& -IFN#! H*,fICZNC%$$$# -IFN%! -f# H*,# -IFNV7!!!
<.#k% UDENV4D/F# -IFNV9!8! <.#k%aI&%% UDENV4D/FV5
图 %6部分样品预扩产物电泳检测
QDE5%6SCN‘I@K0DXD3I4D/F EN0N0N34C/K?/CNVDV/X
9(G12’$-1 A-&=1$VI@K0NV
#’ H*,fICZNC%$$$# % A;’ k.2#!k.-#!k*#!k&!fh#!J,S#!
R.#!f,#
CFCA=56.扩增片段多态性
试验选用了 #8 对引物组合进行选择扩增!根据
最后的毛细管电泳峰图显示!确定了 )A,’,afA
’,h%)A,’,afA’,+%)A,’,afA’+’这 7 对
引物组合进行 ,Q-S分析& 图 7 是部分代表性样品
的 ,Q-S荧光图谱& ’)]A:$$$ 遗传分析仪是根据
"$#
林 业 科 学 !" 卷6
荧光信号强度来记录多态位点的信息!因此要比传
统银染法更加灵敏%精确!检测到的多态性位点相对
也更加丰富& 上述 7 对引物分别测定到 #8;!#8$!
#": 共计 9$" 个多态性位点&
CFEA种群遗传多样性
用 S,qS! YN4I!1$Y#$ 软件计算 %8 份舞毒蛾样
本基于 ,Q-S数据的遗传距离!7 对引物检测的数据
分析表明’ 俄罗斯种群内遗传距离为$1$7; 77 c
$1#8% ;%# 蒙古种群内遗传距离为$1$9$ 98# 中国种
群内遗传距离为$1$!! ;! c$1#$8 "!# 日本种群内遗
传距离为$1$8# :$# 美国种群内遗传距离$1$!! ;! c
$1%!" #;"表 7$& 中国种群与俄罗斯%蒙古%日本和美
国种群的平均遗传距离分别是$1#"# "!!$1$:" $:!
$1%77 #!!$1%;8 79&以上数据表明’ 美国种群间遗传
变异比其他种群较大!中国种群与美国种群遗传分化
最大!而与蒙古种群遗传分化最小&
表 EACV 份舞毒蛾样本基于 =56.数据的基因差异!
)#2BEAL*’*$%:(%00*-*’:*,0CV =-3/)’$*/#+"&*/2#/*(,’=56.(#$#
6 6 # % 7 ! 9 8 " : ; #$ ## #% #7
# k.2# ( $1$7; 77 $1##" ;$ $1#$9 "! $1##% 78 $1$8" !% $1$:! %" $1$8" !% $1%!# 9" $1%79 ;8 $1#;8 87 $1#:9 7; $1%$" :"
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66!对角线上为遗传距离!对角线下为多态位点差异数& hNFN4D3UDV4IF3N"IY/[NUDIE/FI0$ IFU K/0W@/CK?D3UDXNCNF3N" YN0/MUDIE/FI0$5
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6第 #$ 期 钱6路等’ 舞毒蛾不同地理种群基于 ,Q-S分子标记的遗传分析
CFGA聚类分析
基于 ,Q-S分子标记的 $! # 数据矩阵! 用
S,qS! YN4I!1$Y#$ 软件中 qShf,和 *J法构建
了本试验 %8 份舞毒蛾和 % 份栎毒蛾的树状图 "图
!!9$& 从图 ! 可以看出’ #$ 份来自美国的舞毒蛾
构成一个单系类群!并得到 #$$>的支持率# 余下的
#8 份亚洲舞毒蛾聚为一类!支持率是 "7>& 亚洲型
又可细分为 7 个小类群!俄罗斯%日本各自聚为一
支!支持率分别为 8%>和 #$$>!中国和蒙古聚为一
支!支持率为 #$$>& 本文使用的 7 对引物组合中
任一对都能将不同地理种群的舞毒蛾区分开!但为
了增加准确性和可信度!把 7 组引物所得的所有数
据一同分析!最后通过 % 种计算方法得到的聚类树
结果一致&
图 !6%8 份舞毒蛾样品及 % 份栎毒蛾样品
基于 ,Q-S分析的 qShf,聚类图
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/P4EC/PKVCN[NI0NU YWqShf,30PV4NCIFI0WVDV/XENFN4D3VD@D0ICD4DNV
76讨论
,Q-S分子标记对于检测物种不同种群之间的
遗传变异具有高的灵敏性!是一种高效的分子标记
技术"成飞雪等! %$$9# 罗倩等! %$$"# 杜传印等!
%$$:# 上官凌飞等! %$$;$& kNDFNZN等"#;;;$利用
传统聚丙烯胺银染的方法成功对不同地理种群舞毒
蛾进行遗传分析!本文利用较少的不同引物组合成
图 96%8 份舞毒蛾样品及 % 份栎毒蛾样品
基于 ,Q-S分析的 *J聚类图
QDE59 6 HNFUC/ECI@ /X%8 9!A-&=1$DV/0I4NVIFU % 9!G1’/0$1
/P4EC/PKVCN[NI0NU YW*J30PV4NCIFI0WVDV/XENFN4D3VD@D0ICD4DNV
功建立并优化了舞毒蛾 ,Q-S分析体系!并利用
’)]A:$$$ 遗传分析仪对 ,Q-S的扩增产物进行毛
细管电泳!自动检测条带和分析结果!简化了传统的
电泳及银染的步骤!提高了 ,Q-S结果的灵敏性%准
确性和重复性& 由此可见!,Q-S技术及其改良技
术可以很好地应用于种群遗传分化的研究&
kNDFNZN等 "#;;;$分析了欧洲%亚洲%北美种
群的遗传关系!聚类分析显示欧洲相同地理种群
或邻近地理种群能够聚在一起!但未详细给出亚
洲种群和北美种群的聚类结果!本文在此基础上
利用 7 对荧光引物组合的 ,Q-S多态性分析!准确
测定了亚洲和北美 9 个不同地理来源!共 %8 份舞
毒蛾样品的基因关系!qShf和 *J树的聚类分析
均将能将这 9 个地理种群分为欧洲型"北美种群$
和亚洲型!其中亚洲型又可分为俄罗斯%日本%中
国及蒙古 7 个类群& 聚类结果与地理来源具有明
显的相关性& 美国种群间遗传变异比其他种群较
大!中国种群与美国种群遗传距离最大!而与蒙古
种群遗传分化最小& 本研究丰富了舞毒蛾不同地
理种群的遗传分化研究成果!为揭示舞毒蛾的起
源%入侵与扩散%遗传与变异以及检疫措施的制定
等提供了科学依据&
;$#
林 业 科 学 !" 卷6
参 考 文 献
成飞雪! 成新跃! 谢丙炎5等5%$$91松材线虫种群遗传多样性,Q-S
标记的建立及其应用5植物病理学报! 79 "9$ ’ !#$ A!#;1
杜传印! 王玉军! 李斯深!等5%$$:17; 个烤烟种质亲缘关系的
,Q-S分析5中国农业科学! !# ";$ ’ %"!# A%"!"5
罗6倩! 冯6夏! 吕利华!等5%$$"1小菜蛾对阿维菌素抗性基因的
,Q-S连锁图谱的构建5昆虫学报! 9$ "9$ ’ !"! A!:$1
钱天荣5%$$$1舞毒蛾在美国发生危害及美国农业部采取的措施5
植物检疫! #! "9$ ’ 7#" A7#:1
上官凌飞! 李晓颖! 房经贵!等5%$$;1果梅"@$020&G0G%$品种的荧
光 ,Q-S指纹分析5果树学报! %8 "!$ ’ !"9 A!:$1
王丽珍! 段立清! 特木钦!等5%$$81寄主植物对舞毒蛾生长发育的
影响5中国森林病虫! %9"#$ ’ %# A%71
郑先云! 马恩波! 郭亚平5%$$71,Q-S分子标记技术在昆虫学研究
中的应用5昆虫知识! !$"9$ ’ !$9 A!$;1
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!责任编辑6朱乾坤"
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