利用差异显示法（DDRT-PCR）研究杉木的2个自然变异类型（句容0号及独干杉）木材形成过程中基因表达差异。通过银染后切割回收54个差异条带，经2次扩增和纯化、克隆转化及反向Northern杂交验证后共获得29个阳性克隆。测序后进行比对分析，结果表明： 1）Blastn比对（分值>60）有9个cDNA克隆在GeneBank中找到了相似的功能，分别与核糖体蛋白基因、信号传导功能、泛素蛋白基因、抗性功能、组氨酸磷酸转移蛋白、细胞发生功能及能量代谢相关； 2）Blastx比对有12个序列可进行功能推测； 3）还有8个cDNA在数据库中未发现匹配信息。这些信息可为杉木木材形成相关基因的分离和克隆提供研究基础。
Differentially displayed genes derived from the bark of two natural mutants （Cunninghamia lanceolata var. dugan and Cunninghamia lanceolata var. jurong 0）were analyzed during the wood formation by using mRNA differential display reverse transcriptase polymerase chain reaction (DDRT-PCR). Fifty-four differential display bands were collected after silver stain, and among them 29 bands were positive screening with second amplification and purification, cloning and reverse Northern blot analysis. Positive clones were sequenced and blast, the results showed: 1) nine differentially displayed transcrips matched to sequences of known or unknown function in GeneBank by Blastn (score>60). Functions of this cDNA involve ribosomal protein, signal transferring, polyubiquitin, resistant protein, histidine-containing phosphotransfer protein and ATP synthase respectively. 2) Blastx analysis showed that 12 differentially displayed fragments were able to be used for inferring functions. 3) there were still eight fragments with no hit in the GenBank. The results provided basic information for genes cloning in relation to wood forming in Chinese Fir.
全 文 ：
的菌液送至上海博亚生物有限公司测定序列，利用
!"#$%#&数据库进行 $’%()分析。
* 结果与分析
!"# 总 $%&的完整性和纯度
杉木组织中富含酚类等大量次生代谢物质，用
常规的方法提取总 +,-并不是十分有效。本文采
用改良 ./-$法获得了完整的总 +,-，*01 +,- 的
量约为 201 +,- 的 *倍，说明 +,-无降解，提取效
果较好。总 +,-经 3,%(" 4消化后，用紫外分光光
度计测定 +,-的纯度，*56 #78*06 #7值在 29: ; *96
之间，*56 #78*<6 #7的值在 *92 ; *9<间，说明 +,-
的纯度高，没有蛋白质及其他物质的污染。
!"! ’’$()*+$
*9*92 差异片段的获得 利用 2*个锚定引物和 2*
个随机引物组合，进行 +/=>.+。结果表明，锚定引
物 /?（@/2*）-><、/?（@/2*）->A、/?（@/2*）->5、/?
（@/2*）->? 和随机引物 B2
B2
差显片段（图 *）。
根据是否表达和表达量的强弱，初步把差异条
带的情况分为以下 D类：!类，在句容 6 号杉中表
达，而独干杉未表达；"类，在独干杉表达，句容 6
号杉不表达；#类，在句容 6号杉中表达强，独干杉
表达量弱；$类，句容 6号杉中表达弱，独干杉表达
量强。据此，统计共获得 AD条差异条带。其中 4类
条带占 D69?E，"类占 <09:E，#类和$类合占
*69DE。#类和$类切取的条带少，可能主要是由
于试验误差所引起，因此仅选择了亮度差异十分显
著的条带。
*9*9* 差异片段的回收 总体来看，回收片段长度
图 * 33+/=>.+产物银染显示
FGHI* 33+/=>.+ JCK@LM)( @G(J’%N ON (G’P"C ()%G#
B：B%C&"CI2 Q 25：锚定引物 ->< 和随机引物 -+>2 Q -+>0 组合 >.+
JCK@LM)( JCG7"@ ON %#MRKC JCG7"C ->< MK7OG#"@ SG)R C%#@K7 JCG7"C(
-+>2 Q -+>0 C"(J"M)GP"’NI 2? Q <*：锚定引物 ->D 和随机引物 -+>2 Q
-+>0 组合 >.+ >CK@LM)( KT %#MRKC JCG7"C ->D MK7OG#"@ SG)R C%#@K7
JCG7"C( -+>2 Q -+>0 C"(J"M)GP"’NI 箭头指示不同引物组合对 *个样本
扩增出的差异片段 -CCKS( G#@GM%)" )R" @GTT"C"#)G%’’N @G(J’%N"@ TC%H7"#)( G#
)SK (%7J’"(I
位于 <66 ; :66 OJ之间，大部分集中在
066 OJ的片段有 *69DE。
回收的差异片段 3,-含量很低，不能满足后续
的克隆和测序用量，需作二次扩增放大。对二次
>.+扩增产物的电泳检测（图 <）发现：差异片段（共
AD个片段）的二次 >.+有 D2 个获得了较强的扩增
产物，且都是单条带，没有出现 * 条带或多带的情
况；有 5个片段的产物量较低；还有 ?个片段没有
得到扩增产物，回收率可达 ?A9:E。
图 < 部分差异条带的二次扩增产物的电泳检测
FGHI< /R" ("MK#@ >.+ JCK@LM)( KT @GTT"C"#)G%’’N @G(J’%N"@ TC%H7"#)( ("J%C%)"@ G# %HCK(" H"’
*9*9< 差异条带的克隆与鉴定 差异片段经纯化
与 /载体连接后，转化子用大肠杆菌 3U A%来扩大
繁殖，并通过蓝白斑来筛选。质粒提取后进行酶
切，电泳检测产物是否和原差异片段大小相符。结
果表明有
片段内部也存在着酶切位点，有待进一步研究；另
外，还有 *个质粒酶切后无产物，* 个质粒酶切产
物与原片段大小不符，这 D个片段弃之不用。
33+/=>.+ 存在的主要问题是假阳性偏高。
为了筛除假阳性片段，本试验采用反向 ,KC)R"C#法
来检测获得的差异片段。根据杂交膜上杂交信号
对比（图 A），发现在句容 6 号有杂交信号，而在独
干杉上无杂交信号的点有 2?个；在独干杉有杂交
*< 林 业 科 学 DA卷