全 文 ：第 50 卷 第 11 期
2 0 1 4 年 11 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 50，No. 11
Nov．，2 0 1 4
doi:10．11707 / j．1001-7488．20141109
收稿日期: 2013 － 10 － 17; 修回日期: 2014 － 07 － 13。
基金项目: 国家自然科学基金项目(31070576; 30571493) ; 黑龙江省自然科学基金重点项目(ZD201206) ; 黑龙江省杰出青年科学基金项
目( JC201306) ; 黑龙江省大学高层次人才支持计划项目(Hdtd2010 － 12)。
* 常伟为通讯作者。
基于抑制消减杂交技术筛选 AM真菌与
紫穗槐共生相关基因*
宋福强 孔祥仕 李季泽 常 伟
(黑龙江大学生命科学学院 哈尔滨 150080)
摘 要: 利用抑制消减杂交技术筛选 AM 真菌在侵染紫穗槐的过程中紫穗槐差异表达的基因，共获得 47 个
unigenes，其中 35 个显著匹配。根据 GO 分类信息、Blast 注释信息和相关文献信息，显著匹配的 35 个 unigenes 基因
按功能分为防御胁迫(24% )、物质代谢(17% )、能量代谢(14% )、蛋白合成(11% )、信号转导(11% )、细胞结构构
建(11% )、转录(6% )、蛋白折叠和降解(6% )8 类。其中，胁迫防御相关基因和代谢相关基因所占比例最大，表明
二者在 AM 真菌和紫穗槐共生互作过程中起重要作用。这些基因广泛参与生物体生命活动的各个过程，因此 AM
真菌与紫穗槐共生的过程是一个系统涉及各种生物过程的活动。
关键词: 紫穗槐; 丛枝菌根真菌; 抑制消减杂交技术; 共生相关基因
中图分类号: S718. 81 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2014)11 － 0064 － 11
Screening the Ｒelated Genes in the AM Fungi and Amorpha fruticosa Symbiosis
with the Suppression Subtractive Hybridization Technique
Song Fuqiang Kong Xiangshi Li Jize Chang Wei
(College of Life Science，Heilongjiang University Harbin 150080)
Abstract: In this study， the suppression subtractive hybridization ( SSH ) method was employed to screen the
differential expressed genes in Amorpha fruticosa roots induced by AMF during the colonization process． The results
showed that 47 unigenes were obtained，and 35 of them could be aligned with known function genes in GenBank through
Blast． According to GO classified information，Blast annotation and related literatures，the 35 unigenes were assigned
into eight categories including stress and defense (24% )，substance metabolism (17% )，energy metabolism (14% )，
protein synthesis ( 11% )，signaling ( 11% )，cellular structre / cytoskeleton ( 11% )，transcription related ( 6% )，
protein folding and degradation related (6% ) ． Among them，stress and defense genes，and metabolism genes occupied
the largest fraction，implying stress and defense related genes and substance metabolism related genes should play an
important role in the symbiosis process between A． fruticosa and AMF． These genes are widely involved in the biological
process of life activity，thus，the process of AMF and A． fruticosa symbiosis is a system involving a variety of biological
activities．
Key words: Amorpha fruticosa; arbuscular mycorrhizal fungi; suppression subtractive hybridization; symbiosis
related genes
丛枝菌根真菌(AMF)是一类广泛存在并与宿
主植物互利共生的真菌，共生体双方双向转运营养
成分，克服各种生物与非生物的胁迫。AMF 共生对
植物有正面或负面的生长效应(Smith et al．，2011)。
对于同一种丛枝菌根(AM)植物，不同 AMF 定殖产
生不同的生长效应(Klironomos，2003; Munkvold et
al．，2004); 而同一 AMF 在不同植物中产生的生长
效应也不同。AM 对植物的生长效应取决于植物基
因组与 AMF 基因组之间相互关系以及环境条件，但
是其中的控制机制仍然不明确。
菌根是一种很古老的共生体，在进化上比根瘤
更古老 ( Sprent，2007)。植物与 AMF 共生专一性
第 11 期 宋福强等: 基于抑制消减杂交技术筛选 AM 真菌与紫穗槐共生相关基因
小，可以和不同种类 AMF 形成共生体。但是植物对
AMF 也有选择性，从而形成不同的侵染率，在有些
情况下侵染率会非常低( Smith et al．，2009)。AMF
与植物共生是一个精细的分子调控过程，从预共生
时期的信号对话，到共生阶段的植物胁迫防御、细胞
形态重塑，每一步都有大量生物分子参与。到目前
为止，关于木本植物菌根形成的分子机制还鲜见
报道。
抑制消减杂交技术 ( SSH)是由 Diatchenko 等
(1996)在研究真核生物样本间 mＲNA 水平基因表
达差异的技术，可在一个差减杂交过程中将稀有基
因序列富集上千倍，从而可以提高获得低丰度表达
基因 cDNA 序列的概率(Ｒebrikov et al．，2004)，结合
Northern 杂交筛选差异表达基因和对 cDNA 文库的
EST 序列进行生物信息学分析，能够筛选出大量的
功能基因。可以快速完成设定条件下特异表达基因
的筛选，在真菌 (Danielle，2005; Margaret，2005)、
植物(Xu et al．，2013)特异性基因的筛选挖掘研究
中取得了理想的结果。
本研究选用紫穗槐 ( Amorpha fruticosa ) 作为
AMF 的宿主植物，采用抑制消减杂交技术，从转录
水平筛选 AMF 与紫穗槐共生的相关基因，推测木本
植物 AM 形成过程中可能的分子机制，旨在为木本
植物 AM 形成机制研究提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
紫穗槐苗木种子由吉林省林业科学研究院提
供。供试菌种 AMF 为摩西球囊霉(Glomus mosseae，
GM)，孢子含量约为 25 个孢子·g － 1接种物，由黑龙
江大学修复生态研究室保存。苗木培养基质按草炭
土、蛭石、沙子 5 ∶ 3 ∶ 2比例混合，然后灭菌 (121 ℃，
0. 1 MPa，2 h)。将灭后菌的基质装入花盆(53 cm ×
17 cm × 13 cm)。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 苗木培养 紫穗槐种子于 20 ～ 30 ℃温水中
淘洗，搓洗 2 ～ 3 遍，然后用 0. 5% 高锰酸钾溶液浸
泡 3 ～ 4 h，清水淘洗干净。将处理好的种子置于筛
中，用几层湿润纱布覆盖，漂浮于水浴锅中，将水浴
锅水温调制为 35 ℃进行发芽。将萌发的种子播撒
于每盆装有 3. 5 kg 培养基质的花盆中，接种菌剂，
盖薄层土。对照组: 灭活的 AMF + 紫穗槐; 处理
组: AMF +紫穗槐。
1. 2. 2 紫穗槐苗木菌根侵染率测定 采用 Phillip
等(1970)KOH 脱色 －酸性品红染色方法。
1. 2. 3 根系总 ＲNA 提取和 mＲNA 的纯化 采用
TＲIzol 方法提取根部总 ＲNA，应用 Oligotex mＲNA
Mini Kit(Qiagen)分离纯化 mＲNA。
1. 2. 4 紫穗槐菌根相关基因的抑制消减杂交 采
用 Clontech 公司的 PCＲ-SelectTM cDNA Subtraction
Kit 构建消减 cDNA 文库。以接种 AMF 的紫穗槐根
系总 mＲNA 合成的 dsDNA 作为测试组( Tester)，接
种灭活 AMF 的紫穗槐根系总 mＲNA 合成的 dsDNA
作为驱动组 (Driver)，具体操作按照试剂盒使用说
明进行。
1. 2. 5 消减杂交效率的检测 通过 PCＲ 方法检测
消减与未消减第 2 次 PCＲ 产物中紫穗槐内参与基
因 actin 的表达丰度。PCＲ 反应条件为: 75 ℃预变
性 5 min，然后 94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 150 s 扩
增，并分别在第 16，24，28 和 32 循环处各取 4 μL 进
行电泳，检测消减杂交效率。
1. 2. 6 cDNA 消减文库的建立和鉴定 对巢式
PCＲ 产物进行纯化后，直接连接到 pGEM-T Easy
Vectors 进载体中，4 ℃连接过夜，然后再将连接产物
转化至大肠埃希菌(E． coli) DH5α 感受态细胞中，
用含有 X-Gal、IPTG 和 Amp 的 LB 培养皿 37 ℃倒置
培养过夜，然后根据蓝白斑筛选阳性克隆。随机挑
取阳性克隆，重新活化，提取质粒 DNA。以质粒
DNA 为模板，利用载体两端的测序引物对插入片段
进行 PCＲ 扩增鉴定。
1. 2. 7 差异基因的反向 Northern blot 杂交验证
采用 MBI 公司的 Biotin Chomogenic Detection Kit 进
行反向 Northern blot 杂交验证，探针的制备、膜固
定、杂交和显色操作按说明书步骤操作。
1. 2. 8 SSH 库的测序 随机挑取阳性克隆到含氨
苄青霉素的 LB 培养基中，37 ℃摇床中过夜摇菌，将
含 EST 插入的阳性克隆菌液编号，由上海 Invitrogen
公司进行测序。
1. 2. 9 Unigenes 序列的功能注释 序列经去除载
体序列和引物序列后，用 NCBI 的 BLSATX 功能进
行序列相似性搜索，并初步推断差异表达片段的功
能。在 GenBank 数据库中使用 Blastx 程序对测序结
果进行功能注释，在去除内生菌根序列基础上，对紫
穗槐相关功能基因进行分析，根据 GO 分类信息、
Blast 信息，查阅相关文献，对获得的 unigenes 进行
基因功能分类。未知序列编码的肽段一级结构采用
EMBL 上的 Transeq 引擎进行预测 ( http:∥ www．
ebi． ac． uk /Tools / emboss /)。肽段的理化特性采用
ProtParam 工具进行分析 ( http:∥ web． expasy． org /
protparam /)。采用 ProtScale 对肽段的疏水性 /亲水
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林 业 科 学 50 卷
性 进 行 分 析 ( http: ∥ web． expasy． org / cgi-bin /
protscale / protscale． pl); 采用 sopma ( http:∥ npsa-
pbil． ibcp． fr / cgi-bin / npsa _ automat． pl? page = /
NPSA /npsa_sopma． html)对未知序列编码肽段的二
级结构参数进行分析。
2 结果与分析
2. 1 紫穗槐培养和侵染情况检测
苗木培养第 5 天时菌根侵染率很低，只检测到
个别根内有菌丝存在。此时根系小，大部分孢子处
在萌发阶段。到第 10 天时，侵染率开始升高，并且
接种和未接种之间的植株已经出现明显差异。在第
15 天时，侵染率迅速升高，此时根系和菌丝大量繁
殖，随后一直升高。至 30 天时，侵染率接近 90%，
根内可见大量泡囊菌丝，到第 40 天时，有些根内可
见少量孢子。
图 1 紫穗槐根部侵染率随时间的变化
Fig． 1 Changes of the colonization percentage of Amorpha
fruticosa roots by AMF with time
苗木培养至第 15 天时，接种 GM 和未接种之间
紫穗槐生长差异非常显著，AMF 的促生作用非常明
显，这与之前的报道(孟剑侠，2009; 赵晓娟，2010;
宋鸽，2011)一致，其侵染率在 50%左右(图 1)。本
试验选取生长 15 天的紫穗槐根系，进行 ＲNA 提取和
差异基因筛选工作。
2. 2 紫穗槐丛枝菌根相关基因的抑制消减杂交
2. 2. 1 反转录以及酶切效果检测 接种 GM 的紫
穗槐根系 ( Tester) 和空白对照组根系 ( Driver) 的
cDNA 进行 Ｒsa I 酶切后，在 1%琼脂糖上同时电泳，
从图 2 中可以发现，酶切后的 cDNA 片段明显小于
酶切前的 cDNA 片段，分布在 200 ～ 750 bp 之间，说
明酶切消化完全。
2. 2. 2 消减产物的 PCＲ 扩增 消减产物经过 1 轮
巢式 PCＲ 后，在 1% 琼脂糖上进行电泳 (图 3 )。
PCＲ 扩增片段主要分布在 250 ～ 750 bp 之间，呈比
较均匀的弥散状，分辨不出明显的主带，较大的片段
得到了明显的消减，与试剂盒所要求的预期大小符
图 2 Tester 和 Driver 酶切前后 cDNA 变化
Fig． 2 The change of cDNA before and after digested by Ｒsa I
1 和 3 为酶切前; 2 和 4 为酶切后。Lane 1 and 3 represent
cDNA prior to Ｒsa I digestion，
and lane 2 and 4 after Ｒsa I digestion．
合，可进行后续基因产物克隆、抑制消减库的筛选、
差异基因片段的测序以及差异基因的生物信息学
分析。
图 3 紫穗槐与 AMF 共生相关基因抑制
消减杂交后 2 轮 PCＲ 扩增产物的比较
Fig． 3 The comparison of SSH products amplified
by two run PCＲ about symbiotic genes between
A． fruticosa and AMF
1. 第 1轮 PCＲ扩增后的消减杂交产物 Primary PCＲ of SSH products;
2. 第 2 轮 PCＲ扩增后的消减杂交产物 Secondary PCＲ of SSH products．
2. 2. 3 紫穗槐 SSH cDNA 文库的构建和插入片段
的 PCＲ 鉴定 将抑制消减杂交 cDNA 的第 2 次扩
增产物克隆到 pGEM-T 载体中，转化大肠埃希菌，菌
液经 37 ℃过夜培养后，长成蓝白菌落。构建包含
146 个与 AM 共生的紫穗槐根部 SSH 文库。
随机挑取部分文库中的克隆菌落，利用接头两
端引物对重组质粒的插入片段进行 PCＲ 扩增鉴定，
产物经 1%琼脂糖凝胶电泳(图 4)，插入片段呈现
大小不一的带型，长度主要分布在 250 ～ 750 bp 之
间，表明连接转化效果较好，消减后的 cDNA 片段具
有多态性低和重复率低的特点，表明经过差减后高
丰度基因的均一化效果较好，所构建的文库质量合
乎要求，和理论预计的结果大致相符。
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第 11 期 宋福强等: 基于抑制消减杂交技术筛选 AM 真菌与紫穗槐共生相关基因
图 4 紫穗槐 SSH 文库插入片段的部分菌液 PCＲ 鉴定
Fig． 4 The identification of inserted cDNA fragments in SSH
libraries of A． fruticosa with AMF by bacteria liquid PCＲ
2. 2. 4 差异基因的反向 Northern blot 杂交验证
随机挑选阳性克隆库中的 63 个进行反 Northern 杂
交验证，将 Tester 和 Driver 进行探针标记后，分别与
点在尼龙膜上的 cDNA 文库阳性克隆的菌落 PCＲ
产物进行斑点杂交，杂交结果如图 5 所示:大部分
(49)出现阳性反应，14 个阴性反应。阳性反应点在
以 Driver 为探针的反 Northern blot 中均为阴性反
应。因此，这些阳性反应的克隆均为紫穗槐与 AMF
共生相关的基因。
图 5 斑点杂交筛选含有差异 cDNA 片段的克隆
Fig． 5 The screening of colonies with differential cDNA fragment from subtractive cDNA libraries by reverse northern blot analysis
每个克隆在 2 张杂交尼龙膜的相同位置，分别用 Tester(左)和 Driver(右)做探针进行杂交。
Each clone in the same position of the two hybrid nylon membrane，Tester ( left) and Driver ( right)
respectively were used as probes for hybridization．
2. 3 序列测定和基因的功能注释
将经过反 Northern blot 筛选并包含 EST 插入的
高质量阳性克隆质粒进行测序。一共随机挑选 600
个阳性克隆，获得 400 个非冗余 ESTs，经过组装拼
接后获得 47 个 unigenes。在 GenBank 数据库中使
用 BLASTx 程序对 47 个差异表达的 unigenes 序列
进行注释，其中 35 个 unigenes 序列与已知序列显著
性匹配，剩余 12 个 unigenes 序列在 GenBank 数据库
中没有获得显著性匹配(表 1)。
2. 4 已知共生相关基因的功能分类
为了深入分析 AMF 在定植紫穗槐的过程中紫
穗槐差异表达基因的生物学功能，利用 GO 分类信
息、Blast 注释信息和相关文献信息，对 35 个获得显
著匹配的 unigenes 进行基因功能分类，结果表明:35
个差异表达的 unigenes 可以被分为 8 类，分别是防
御胁迫(24% )、物质代谢(17% )、能量代谢(14% )、
蛋白合成 ( 11% )、信号转导 ( 11% )、细胞结构
(11% )、转录(6% )、蛋白折叠和降解(6% )(表 1)。
其中，胁迫防御相关基因和物质代谢相关基因所占
比例最大，说明胁迫防御相关基因和物质代谢相关
基因在 AMF 和紫穗槐共生互做过程中发挥着重要
的作用。这些基因广泛参与生物体生命活动的各个
过程，因此 AMF 与紫穗槐共生的过程是一个系统涉
及各种生物过程的活动。
2. 5 未知基因序列编码肽段的预测分析
从表 2 中可以看出这些未知基因编码的肽段，
氨基酸长度大小不等，最少的 65 个氨基酸(AG10)，
最大的 140 个氨基酸(AG42)，相对应的相对分子质
量为 6 903. 8 ～ 16 553. 8。总带正电残基 ( Asp +
Glu)和总带负电残基(Asp + Glu)相互作用决定了
预测肽段氨基酸的 pI 特性，两者持平的肽段显中性
(pI = 7 左右，AG12)，其他预测肽段 pI 偏酸或者偏
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林 业 科 学 50 卷
表 1 消减 cDNA 文库 ESTs 同源性比对结果
Tab． 1 BLASTx analysis of the 47 unigenes obtained from the sequences in the subtractive library against the GenBank database
编号
No．
长度
Length / bp
登录号
Accession No．
蛋白质名称
Protein name
相似度
Identity
(% )
E 物种
Species
胁迫与防御 Stress and defense
AG02 515 gi | 1150654 金属硫蛋白 Metallothionein protein 99 2E － 174 蚕豆 Vicia faba
AG03 558 gi | 380005615 疾病相关蛋白
1( PＲ1) Pathogenesis-related protein
1 (PＲ1)
99 1E － 120 蚕豆 V． faba
AG04 501 gi | 47076863 金属硫蛋白 Metallothionein 100 2E － 44 豌豆 Pisum sativum
AG05 310 gi | 357489617 膜联蛋白 Annexin 93 7E － 29 蒺藜苜蓿 Medicago truncatula
AG06 341 gi | 356549924 似环氧化物水解酶 Epoxide hydrolase 2-like 52 2E － 16 大豆 Glycine max
AG07 552 gi | 357449119 抗病反应蛋白
Pi49 Disease resistance response
protein Pi49
92 1E － 23 蒺藜苜蓿 M． truncatula
AG08 607 gi | 18375 同源脱水蛋白 Dehydrin-cognate 80 3E － 14 豌豆 Pisum sativum
AG09 421 gi | 209572858 防御蛋白 Defensin 100 3E － 15 兵豆 Lens culinaris
物质代谢 Substance metabolism
AG20 480 gi | 357517836 GDSL 酯酶 /脂肪酶 GDSL esterase / lipase 100 3E － 97 蒺藜苜蓿 M． truncatula
AG21 491 gi | 356499583
CSＲ1 样磷脂酰肌醇转移蛋白 Phosphatidylinositol
transfer protein CSＲ1-like
77 2E － 26 大豆 G． max
AG26 372 gi | 356518342 类 胡 萝 卜 素
9，10 ( 9，10) 裂 解 双 加 氧 酶
Carotenoid 9，10(9，10)-cleavage dioxygenase-like
73 2E － 26 大豆 G． max
AG28 404 gi | 37515399 酰基载体蛋白 1Acyl carrier protein 1 98 9E － 47 鹰嘴豆 Cicer arietinum
AG31 211 gi | 357484611 乙酰辅酶 A 结合蛋白 Acyl-CoA-binding protein 86 3E － 07 蒺藜苜蓿 M． truncatula
AG34 529 gi | 20649 天冬酰胺合成酶 Asparagine synthase 100 9E － 83 豌豆 P． sativum
能量代谢 Energy metabolism
AG27 337 gi | 357490464 缩醛酶 Fructose-bisphosphate aldolase 95 4E － 84 蒺藜苜蓿 M． truncatula
AG29 495 gi | 358638068
NADH 脱 氢 酶 B 亚 基 NADH dehydrogenase
subunit B
53 0. 28 固氮弧菌属 Azoarcus
AG30 430 gi | 392354923 甘 油 醛
－ 3 － 磷 酸 脱 氢 酶 Glyceraldehyde-3-
phosphate dehydrogenase
76 3E － 35 大鼠 Ｒattus norvegicus
AG32 507 gi | 357521042 乙醛脱氢酶 Aldehyde dehydrogenase 93 6E － 99 蒺藜苜蓿 M． truncatula
AG33 578 gi | 356558075 胞 浆 样 磷 酸 丙 糖 异 构 酶
Triosephosphate
isomerase，cytosolic-like
96 8E － 24 大豆 G． max
蛋白合成 Protein synthesis
AG43 512 gi | 336283376
EF1a 样蛋白 (细胞翻译延长因子 ) EF1a-like
protein(Cell translational elongation factor)
79 4E － 16 长叶美洲兜兰
Phragmipedium longifolium
AG45 528 gi | 38232568 翻译延伸因子亚基
Bβ 链 Translational elongation
factor 1 subunit B beta
100 6E － 31 豌豆 P． sativum
AG46 490 gi | 359840822 转录起始因子 1A Translation initiation factor 1A 100 1E － 08 小果野芭蕉 Musa acuminata
AG48 293 gi | 6094021 核糖体蛋白 L18 Ｒibosomal protein L18 93 4E － 18 鹰嘴豆 C． arietinum
细胞骨架 Cellular strucure / Cytoskeleton
AG13 413 gi | 330370636 延伸蛋白 Extension 93 3E － 41 豌豆 P． sativum
AG15 484 gi | 15021751 延伸蛋白 Extension 99 4E － 71 豌豆 P． sativum
AG16 530 gi | 20759 β － 2 微观蛋白 Beta-tubulin 2 100 1E － 110 豌豆 P． sativum
AG17 407 gi | 357452660 类驱动蛋白 Kinesin-like protein 94 1E － 104 蒺藜苜蓿 M． truncatula
信号转导 Signaling
AG25 507 gi | 356504559 漆树蓝样蛋白 Stellacyanin-like 71 0. 043 大豆 G． max
AG36 399 gi | 1742988 钙调节蛋白 CaM protein 93 3E － 51 鹰嘴豆 C． arietinum
AG38 294 gi | 357475628 分 裂 素 激 活 蛋 白 激 酶
Mitogen-activated
protein kinase
100 6E － 72 蒺藜苜蓿 M． truncatula
AG40 223 gi | 357454700 丝氨 酸
/苏 氨 酸 蛋 白 磷 酸 酶 Serine / threonine
protein phosphatase
98 6E － 46 蒺藜苜蓿 M． truncatula
蛋白折叠与降解 Protein folding and degradation
AG11 479 gi | 357456513 α
－ 淀粉酶 /枯草杆菌 蛋 白 酶 抑 制 剂 Alpha-
amylase / subtilisin inhibitor
95 1E － 48 蒺藜苜蓿 M． truncatula
AG47 396 gi | 266743 蛋白质二硫键异构酶 Protein disulfide-isomerase 97 7E － 10 紫花苜蓿 M． sativa
转录相关 Transcription related
AG39 224 gi | 356576453
ＲNA 结合蛋白，类武藏同源物 2 ＲNA-binding
protein，Musashi homolog 2-like
99 8E － 50 大豆 G． max
86
第 11 期 宋福强等: 基于抑制消减杂交技术筛选 AM 真菌与紫穗槐共生相关基因
续表 1 Continued
编号
No．
长度
Length / bp
登录号
Accession No．
蛋白质名称
Protein name
相似度
Identity
(% )
E 物种
Species
AG41 410 gi | 357514131 ＲNA 结合蛋白 ＲNA-binding protein 100 4E － 16 蒺藜苜蓿 M． truncatula
未知 Unknown
AG10 201 gi | 386022113 假想蛋白 Hypothetical protein 38 6. 0
施氏假单胞杆菌
Pseudomonas stutzeri
AG14 267 gi | 406892676 假想蛋白 Hypothetical protein 37 4. 0
未能培养的细菌
Uncultured bacterium
AG24 408 gi | 357463247 假想蛋白 Hypothetical protein 48 4. 9 蒺藜苜蓿 M． truncatula
AG23 395 gi | 388507052 未知蛋白 Unknown protein 84 4E － 40 蒺藜苜蓿 M． truncatula
AG42 448 gi | 255631712 未知蛋白 Unknown protein 64 0. 072 大豆 G． max
AG12 297 gi | 388498726 未知蛋白 Unknown protein 97 4E － 14 蒺藜苜蓿 M． truncatula
AG01 394 无相似 No homology
AG19 212 无相似 No homology
AG18 293 无相似 No homology
AG22 228 无相似 No homology
AG37 300 无相似 No homology
AG44 242 无相似 No homology
表 2 预测肽段的理化特性分析①
Tab． 2 The physical and chemical parameters analysis on the predicated polypeptides encoded by the unknown sequences
Unigenes
编号
No． of
unigenes
氨基酸长度
Number of
amino acids
( aa)
相对分子质量
Ｒelative
molecular
weight
等电点
Theoretical
pI
总带正
电残基
(Asp + Glu)
总带负
电残基
(Asp + Glu)
消光系数
Extinction
coefficients
估测半衰期
Estimated
half-life / h
不稳定
性指数
Instability
index
脂肪指数
Aliphatic
index
总平均
亲水性
Grand average
hydropathicity
AG01 127 14 501. 3 8. 74 8 11 13 200 1. 3 33. 34 S 124. 25 0. 419
AG10 65 6 903. 8 8. 41 6 7 7115 ＞ 20 51. 75 U 82. 77 － 0. 132
AG12 95 11 000. 0 6. 90 10 10 14 230 5. 5 45. 38 U 102. 63 0. 161
AG14 84 9 755. 9 10. 28 8 19 6 085 7. 2 62. 84 U 47. 74 － 1. 068
AG18 91 10 798. 9 11. 76 4 22 250 1. 3 90. 09 U 75. 93 － 0. 336
AG19 67 7 735. 1 11. 72 2 13 125 20 84. 52 U 77. 01 － 0. 182
AG22 66 7 439. 0 10. 57 3 10 5 960 7. 2 44. 32 U 66. 52 － 0. 480
AG23 128 14 146. 5 12. 15 1 28 25 230 1. 3 35. 08 U 51. 95 － 0. 826
AG24 134 15 286. 8 5. 87 15 8 26 275 7. 2 47. 49 U 53. 13 － 0. 766
AG37 90 10 620. 7 9. 39 6 13 19 160 2. 8 3. 78 S 116. 89 0. 286
AG42 140 16 553. 8 9. 35 8 17 39 460 ＞ 20 33. 60 S 92. 43 0. 184
AG44 80 9 593. 6 9. 03 3 6 11 585 ＞ 30 24. 72 S 143. 62 1. 34
① S:稳定蛋白 Stable protein; U: 不稳定蛋白 Unstable protein．
碱，总体分布于 5. 87(AG24)与 12. 15(AG23)之间，
pI 偏碱的肽段占大部分。
对未知基因序列编码肽段进行二级结构预测，
结果如表 3 所示。各个片段编码的肽段均含有
α 螺旋、β 折叠、转角和卷曲 4 种二级结构，含量不
均一。
3 讨论
3. 1 抑制消减杂交技术
抑制消减杂交技术( SSH)由于假阳性率较低，
灵敏性高，重复性强，通量大，因而能一次性分离上
百个差异表达基因。已经广泛用于非靶向差异基因
分离。Die 等 ( 2007 ) 用 SSH 技术分离锯齿列当
(Orabanche crenata)寄生诱导的紫花苜蓿(Medicago
表 3 未知序列编码的肽段的各种二级结构百分比
Tab. 3 Percentage of every predicted secondary
structure of the unknown encoding polypeptides %
Unigenes 编号
No． of unigenes
α 螺旋
Alpha helix
β 折叠
Beta sheet
转角
Turn
卷曲
Coil
AG01 27. 56 29. 13 6. 30 37. 01
AG10 44. 62 10. 77 12. 31 32. 31
AG12 13. 68 45. 26 14. 74 26. 32
AG14 15. 48 28. 57 9. 52 46. 43
AG18 28. 57 27. 47 6. 59 37. 36
AG19 17. 91 32. 84 8. 96 40. 30
AG22 43. 94 15. 15 9. 09 31. 82
AG23 2. 34 14. 06 3. 13 80. 47
AG24 23. 13 11. 94 11. 94 52. 99
AG37 53. 33 21. 11 7. 78 17. 78
AG42 37. 86 27. 86 9. 29 25. 00
AG44 53. 75 27. 50 3. 75 15. 00
96
林 业 科 学 50 卷
sativa)推防御基因表达。Klosterman 等 ( 2011 ) 用
SSH 来发掘莴苣(Lactuca sativa)中衰老相关的蛋白
酶与黄萎病 (Orobanche cumana)之间的关系。Kuo
等(2010)用 SSH 鉴定海葵( Sea anemone)与甲藻之
间的共生和非共生相关基因。而有关 AM 方面的研
究，SSH 作为非靶向方法用于构建在菌根组织上调
表达的基因库，并发现一些重要的 AM 诱导基因，也
用 SSH 库来克隆 AM 发育早期和晚期诱导的特异
表达基因( Kuo et al．，2010; Brechenmacher et al．，
2004)。但是关于 SSH 方法用于紫穗槐与 AMF 共
生相关基因的研究还没有报道。本研究采用这种非
靶向的方法，全面系统地分析了紫穗槐与 AMF 共生
之间的相关基因。经过序列分析，发现这些序列参
与防御胁迫、物质代谢、能量代谢、蛋白合成、转录、
信号转导、蛋白折叠和降解、细胞结构等生物体生命
活动的各个过程，代表了共生过程中部分转录组。
3. 2 AMF 与紫穗槐共生相关基因
3. 2. 1 参与紫穗槐胁迫和防御的相关基因 AMF
与植物的互利共生关系表现为 AMF 可以诱导植物
产生防御反应，激活植物防御分子，抵抗生物胁迫。
在与 AMF 共生的紫穗槐根系内检测到病原相关蛋
白(pathogenesis protein，PＲ) 和防御素 (Defensin)。
PＲ 蛋白与抗病性有关 ( Gianinazzi-Pearson et al．，
1996)，在丛枝形成前，AMF 就可以激活 PＲ 编码基
因。植物防御素是高等生物防御病源体入侵的重要
防御物质 ( Takeuchi et al．，2012)。这些被 AMF 诱
导的病原相关基因可增强菌根植物对生物胁迫的抵
抗力，如对根腐病的抗性，但并不影响 AMF 在紫穗
槐内定植。
除 PＲ 外，在紫穗槐菌根内还检测到 Annexin，
金属硫蛋白 (metallothionein，MT)等金属相关蛋白
以及环氧化物水解酶(Epoxide hydrolase)等。这些
相关蛋白通常与抵抗氧化胁迫相关，通过与重金属
结合可以有效地减轻重金属对机体的毒害，是体内
清除自由基能力最强的一类蛋白质 ( Hu et al．，
2013)。有研究用 AM 共生树种来治理重金属胁迫
的土壤(Gaur et al．，2004; Hildebrandt et al．，2007)，
就是利用 AMF 隔离一些重金属从而避免其对植物
的毒害作用。
3. 2. 2 参与紫穗槐物质代谢的相关基因 酰基载
体蛋白( acyl carrier protein，ACP)、乙酰辅酶 A 结合
蛋白( acyl-CoA-binding protein，ACBP)、天冬酰胺合
成酶 ( Asparagine synthatase)以及 GDSL esterases /
lipases 等代谢相关基因在本研究的紫穗槐菌根根系
内上调表达。植物中含有多种 ACP 异构体，表达具
有组织特异性，中长链脂肪酸仅仅存在于储存三酰
甘油的组织中，不存在于膜脂上 ( Schütt et al．，
1998)。ACBP 广泛存在于生物体中，在大分子合成
转运乙酰基团中起重要作用，参与多种功能和调节
过程 (Kiruthika et al．，2013)。此外，ACBP 可以增
强 ABA 信号 (Du et al．，2013)。ACBP 缺失使植物
外皮发育受损，同时影响由抗性蛋白介导的对病原
细菌和真菌的基础性防御作用(Xia et al．，2012)。
GDSL esterases / lipases 主要参与调解植物发育、形
态建成、次级代谢物的合成、防御反应(Chepyshko et
al．，2012)。
天冬酰胺由于具有高的 N /C 比，是植物理想的
氮储存和运输物质，可参与生物和非生物胁迫的氮
循环、氮素从源组织到库组织的移动和运输过程的
氮循环(Gaufichon et al．，2010)。此外，当处于胁迫
环境如干旱、盐化、营养缺陷条件下，天冬酰胺会在
共生植物的根瘤中大量富集，调节苜蓿等豆科植物
(Sulieman et al．，2010)的固氮特性，因而可以在豆
科植物紫穗槐的菌根根内检测到天冬酰胺合成酶的
上调表达。AMF 除了能为植物提供 P 营养外，还能
提供一定量的 N 素营养，对 N 素有一定的吸收
能力。
胡萝卜代谢相关的基因即类胡萝卜素裂解双加
氧酶 ( carotenoid cleavage dioxygenase，CCDs)也在
紫穗槐菌根根系内检测到。Lohse(2005)证实 CCD
在玉米(Zea mays)AM 共生根系中具有较高的转录
活性。CCD 可切割类胡萝卜素特异双键，产生脱辅
基类胡萝卜素，参与类胡萝卜素裂解。脱辅基类胡
萝卜素能提高发枝菌根的共生效率，影响丛枝形成。
在共生根系中 AMF 能够诱导类胡萝卜素生物合成及
氧化裂解(Akiyama，2007)，而 AM 根系中类胡萝卜
素前体经过 2 个连续的裂解反应产生的脱辅基类胡
萝卜素，反过来诱导 AM 菌丝分枝 (Akiyama et al．，
2005)。在 小 麦 ( Triticum aestivum )、玉 米、大 麦
(Hordeum sp． ) AM 中，类胡萝卜素氧化裂解为 C14
的 Mycorradicin 和 C13 的 环 己 烯 酮 衍 生 物，
Mycorradicin 在共生后期强烈影响功能丛枝，并能保
护功 能 菌 根，并 具 有 缓 解 H2O2 毒 害 的 作 用
(Klingner et al．，1995)。环己烯酮衍生物无杀菌性，
是一种土传植物病原菌的抑制剂，但能够控制发枝
菌根与植物根系共生。
参与磷代谢的基因即磷酸肌醇 转移 蛋白
(phosphatidylinositol transfer protein，PITP)基因在紫
穗槐与 AMF 共生的根系中也发现上调表达。PITP
参与信号传导、膜运输、脂代谢、细胞分裂等很多生
07
第 11 期 宋福强等: 基于抑制消减杂交技术筛选 AM 真菌与紫穗槐共生相关基因
物学 过 程，此 外，PITP 还 是 磷 脂 途 径 调 节 子
(Cockcrof，2012)。AMF 对植物最大的贡献是提供
P，在丛枝膜上分布很多磷转运体，用于转运有机磷
分子。PITP 在紫穗槐菌根根系上发现上调表达，可
能对紫穗槐根系的磷转运有促进作用。
3. 2. 3 参与紫穗槐能量代谢的相关基因 果糖二
磷酸醛缩酶(FDA)、NADH 脱氢酶复合体(NADH)、
甘油醛 － 3 － 磷酸脱氢酶 ( GAPDH)、乙醛脱氢酶
(AD)、磷酸丙糖异构酶 ( TIM)等能量代谢相关基
因均在紫穗槐菌根根系上调表达。FDA 是糖酵解
和糖异生过程中的一个关键酶，对细胞生命活动起
到至关重要的作用(Yadav et al．，2013)。此外，FDA
与植物体内多种植物激素有一定相关性 (路玮，
2011)，而这些植物激素在 AMF 共生中起信号传导
的作用，影响菌丝侵染和根内菌丝发育。NADH 脱
氢酶则起催化作用，将 NADH 上的氢原子传递给与
其结合牢固的辅基 FMN、铁 － 硫中心，再将氢从辅
基上脱下转移给呼吸链中的下一个成员 CoQ，参与
能量代谢中的电子传递。这些酶在 AMF 共生的能
量代谢中起重要作用。
3. 2. 4 参与紫穗槐蛋白合成的相关基因 本试验
结果显示参与蛋白合成的相关基因在 AMF 共生的
紫穗槐根系中上调表达，如核糖体大亚基中的一个
蛋白核糖体蛋白 L18 (Ｒibosomal protein L18)，其用
于稳定 5S rＲNA 的 4 级结构，并介导其和大亚基其
他部分的相互关系。此外还有参与植物蛋白质合成
过程中的翻译起始因子( eIF1A)和延伸因子(EF1a)
的合成，其中，eEFlA 具有类似分子伴侣的活性，能
够与新生的肽链结合，而且能够和在胞质中不能正
确折叠的蛋白相互作用并加速这些蛋白的降解。有
报道称 EF1A 和 eEF1B 是烟草花叶病毒入侵烟草所
必须的，可以直接与病毒 ＲNA 依赖性 ＲNA 聚合酶
的甲基化转移酶域相互作用(Hwang et al．，2013)，
可能在 AMF 定殖于紫穗槐的过程中起一定作用。
这些蛋白合成相关的基因协同蛋白折叠降解基因，
能保证紫穗槐根系内 AM 相关蛋白的快速准确
合成。
3. 2. 5 参与蛋白折叠与降解的相关基因 蛋白二
硫键异构酶 ( protein disulfide-isomerase，PDI)在新
生蛋白折叠和形成二硫键中起重要作用，并且参与
新合成的分泌性蛋白质的修饰和折叠 (Kim et al．，
2012)，以及逆境胁迫下受损蛋白的修复和重折叠
等生理过程中起重要作用。此外，PDI 还具有分子
伴侣的部分功能，可通过 ATP 依赖等方式介导其他
不同底物蛋白的多肽组装与异构、二硫键状态调控
等过程，因此它与真核类生物中的糖转运及蛋白合
成等代谢环节也可能存在较密切联系。
在 AMF 在与紫穗槐共生的过程中，宿主细胞中
蛋白组分会发生剧烈变化，细胞骨架重排，新的蛋白
合成或者有些蛋白上调表达，有些蛋白下调表达。
为了确保这些蛋白的正确折叠，起分子开关作用的
蛋白质二硫键、分子伴侣如 PDI 的上调表达必不
可少。
3. 2. 6 参与紫穗槐细胞骨架构建的基因 β －
tubulin 基因以及与细胞器移动有关的驱动蛋白
Kinesin 在形成共生结构过程中出现特异表达
(Sasabe et al．，2011)，在形成丛枝和泡囊的过程中，
植物细胞形态发生剧烈的变化，形成入侵栓，在丛枝
发育的过程中必然会导致植物细胞骨架的改变以及
细胞器的转移，以前也有关于骨架相关蛋白变化的
报道(Genre et al．，1998)，其中涉及 ESTs 编码的蛋
白质，一些基因编码的蛋白质参与细胞壁修饰，如
Extensins 在细胞壁组装、细胞成型和大小、疾病抗
性，以及生殖隔离和物种形成中起作用，有助于根毛
扩增和延伸生长(Lamport et al．，2011)。
3. 2. 7 参与紫穗槐信号辅导的相关基因 信号传
导是 AMF 与植物共生的第 1 步，通过双方信号对
话，植物打开防御大门，AMF 则准备定殖。即便侵
染后期丛枝形成后，因为营养关系，两者之间也进行
即时动态信号对话。这个信号过程是从始至终的。
本试验检测到一类蓝铜蛋白 Stellacyanin，为原核生
物和真核生物的电子传递体，除了有铜结合域，还有
细胞壁 结 构 的 蛋 白 质 结 构 域 ( Dennison et al．，
2003)。有报道称，受到致病性、非致病性辣椒斑点
病菌以及非病原性萤光假单孢菌 ( Pseudomonas
fluorescens)侵染后，五彩椒(Capsicum annuum)叶子
会富集 stellacyanin cDNA clone ( CASLP1)，机械损
伤诱导的 CASLP1 转录本局部性、系统性的积累呈
现甲基化茉莉酸依赖性，当五彩椒暴露于脱落酸环
境中时，盐和干旱胁迫也能诱导其表达(Kong et al．，
2002)。AMF 在定殖于紫穗槐根部的过程中，会压
迫其根内皮层细胞，造成一定程度的机械损伤，从而
诱导 Stellacyanin 的表达。
钙调素蛋白 (CaM protein)是一类广泛存在的
的蛋白，通过 Ca2 + 依赖性与多种靶蛋白，如蛋白激
酶、磷酸激酶、离子通道和细胞骨架等相互作用调节
各种细胞功能(Kuttner et al．，2013)。在 AMF 共生
中，钙调蛋白是核心蛋白之一，当菌根因子诱导核周
质钙出现峰值后，释放到核周质的钙离子被钙调素
识别并与之结合，同时与 CCaMK 结合解读内共生
17
林 业 科 学 50 卷
诱导的钙摆动模式，然后结合其他相关信号分子产
生下游的共生级联反应。这种对钙摆动模式的识别
可能是开启根瘤共生还是开启菌根共生的切换
开关。
此外，在紫穗槐根部还检测到其他信号相关蛋
白，如 丝 裂 原 激 活 蛋 白 激 酶 ( mitogen-activated
protein kinase，MAPK)和丝氨酸 － 苏氨酸蛋白磷酸
酶 ( serine / threonine protein phosphatase， STK )。
MAPK 是细胞受激发后因发生磷酸化而被激活的一
类丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，可使某些关键性转录因
子发生磷酸化而诱导新基因的表达 ( Sasabe et al．，
2011)。MAPK 信号级联是一类在进化上保守的基
础信号传导途径。一个 MAPK 级联有几个不同的
MAPKKK-MAPKK-MAPK，它们通过连续磷酸化和级
联组分的活化来调节连接到各种上游受体和下游靶
分子。这些级联相互合作，用于传递各种细胞外信
号，控制细胞反应和过程，比如生长、分化、细胞死
亡、转导激素信号和胁迫反应( Singh et al．，2013)。
这种级联反应具有广泛性和古老性，在长期的进化
历程中可能一直伴随 AMF 这种古老的真菌。蛋白
磷酸化和去磷酸化在生物分子水平上起着分子开关
的作用，控制着信号传导途径。相对于 MAPK，STK
则是一类蛋白磷酸酶，在转录、翻译、分化、细胞周期
和信号传导中起多种作用。其成员之一蛋白磷酸酶
2A (protein phosphatase 2A，PP2A)调节着植物形态
建成、肌动蛋白分布以及细胞有丝分裂。有报道称
PP2A 可 调 节 非 病 原 性 真 菌 粗 糙 链 孢 霉
(Neurosporocrassa)(Yatzkan et al．，1998)菌丝的生长
以及构巢曲霉 ( Aspergillus nidulans)菌丝形态建成
(Kosmidou et al．，2001 )。稻瘟病菌 (Magnaporthe
oryzae)入侵水稻叶的方式与 AMF 真菌定植植物根
系极其相似，先形成附着泡，然后通过内部机械压力
和分泌的酶破壁，再进行组织内菌丝生长，进行活体
寄生，只是前者导致细胞死亡，而后者与细胞进行营
养交换。PP2A 的催化亚基突失活可导致稻瘟病菌
营养菌丝生长缺陷，并且不能侵入到宿主植物细胞
中(Du et al．，2012)。STK 在与紫穗槐与 AMF 共生
体系中高表达，表明其在调节 AMF 根内菌丝建成中
可能起重要作用。由于 PP2A 可被 ABA 诱导，AMF
可以增加植物中 ABA 的含量，因此可以推测紫穗槐
中相应的基因不是直接被共生真菌诱导，而是间接
通过增加植物激素的水平诱导的。
3. 2. 8 参与紫穗槐转录的相关基因 转录的调节
控制是基因表达调节控制中的一个重要环节，上承
接信号对话过程，下参与基因的调控表达。本研究
检测到紫穗槐菌根系中 2 个与大豆 ＲNA 结合的蛋
白以及与苜蓿中 ＲNA 结合的蛋白同源性较高，因
此，在 AMF 侵染紫穗槐的过程中，基因转录也受到
调控。
3. 2. 9 对未知序列编码肽段的预测 未知序列可
能参与 AMF 与植物共生某一重要过程，也可能是紫
穗槐在 AMF 特异诱导下产生的，因此可以对未知序
列肽段的编码进行预测。本研究从序列编码肽段的
一级结构进行预测，并对这些肽段的理化特性和二
级结构进行预测。肽段的理化特性影响着未知基因
编码肽段在细胞内的分布，而其二级结构则涉及这
些肽段的高级折叠和跨膜特性。结果表明，这些未
知基因编码的肽段都含有一定量的 α 螺旋、β 折叠、
转角和卷曲。α 螺旋含量越高越有可能是跨膜片
段，这样的蛋白可能作为信号或者营养转运体参与
AM 特异性活动;而 β 折叠、转角和卷曲含量高则水
溶可能性更大，因而分布于胞质核质中作为调节分
子。从理化特性上看，大部分序列编码的肽段偏碱
性(pI ＞ 7)，只有少数偏酸性。肽段稳定性和周转
周期在一定程度上代表肽段是调节分子还是结构分
子，调节分子稳定性较弱，周期较短，AG01、AG37、
AG42 和 AG44 比较稳定，可能是结构蛋白，其他为
不稳定肽段，可能更多地参与到生物调节过程中。
参 考 文 献
路 玮 ． 2011． 拟南芥果糖 1，6 － 二磷酸醛缩酶家族分析 ． 泰安:山
东农业大学硕士学位论文 ．
孟剑侠 ． 2009． 丛枝菌根真菌对紫穗槐固氮能力的影响 ． 哈尔滨:黑
龙江大学硕士学位论文 ．
宋 鸽 ． 2011． AM 真菌对紫穗槐防御性调控及共生相关蛋白的
SDS-PAGE 分析 ． 哈尔滨:黑龙江大学硕士学位论文 ．
赵晓娟 ． 2010． AM 真菌 －紫穗槐共生体引起根瘤菌的趋化性及对
结瘤因子诱导的研究 ． 哈尔滨:黑龙江大学硕士学位论文 ．
Akiyama K． 2007． Chemical identification and functional analysis of
apocarotenoids involved in the development of arbuscular mycorrhizal
symbiosis． Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，71 (6 ) :
1405 － 1414．
Akiyama K，Matsuzaki K， Hayashi H． 2005． Plant sesquiterpenes
induce hyphal branching in arbuscular mycorrhizal fungi． Nature，
435(7043) : 824 － 827．
Brechenmacher L，Weidmann S，Van Tuinen D，et al． 2004． Expression
profiling of up-regulated plant and fungal genes in early and late
stages of Medicago truncatula-Glomus mosseae interactions．
Mycorrhiza，14(4) : 253 － 262．
Chepyshko H，Lai C P，Huang L M，et al． 2012． Multifunctionality and
diversity of GDSL esterase / lipase gene family in rice (Oryza sativa
L． japonica ) genome: new insights from bioinformatics analysis．
BMC Genomics，13(1) : 309．
Cockcroft S． 2012． The diverse functions of phosphatidylinositol transfer
27
第 11 期 宋福强等: 基于抑制消减杂交技术筛选 AM 真菌与紫穗槐共生相关基因
proteins． Curr Top Microbiol Immunol，362:185 － 208．
Danielle C． 2008． Isolation of mycoparasitic-related transcripts by SSH
during interaction of the mycoparasite Stachybotrys elegans with its
host Ｒhizoctonia solani． Curr Genet，53:67 － 80．
Dennison C，Harrison M D，Lawler A T． 2003． Alkaline transition of
phytocyanins: a comparison of stellacyanin and umecyanin．
Biochemical Journal，371(Pt 2) : 377．
Diatchenko L，Lau Y F，Campbell A P， et al． 1996． Suppression
subtractive hybridization: a method for generating differentially
regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries． Proc Natl
Acad Sci USA ，93:6025 － 6030
Die J V， Dita M A， Krajinski F， et al． 2007． Identification by
suppression subtractive hybridization and expression analysis of
Medicago truncatula putative defence genes in response to Orobanche
crenata parasitization． Physiological and Molecular Plant Pathology，
70(1) : 49 － 59．
Du Z Y，Chen M X，Chen Q F，et al． 2013． Arabidopsis acyl-CoA-
binding protein ACBP1 participates in the regulation of seed
germination and seedling development． The Plant Journal，74 (2) :
294 － 309．
Du Y， Shi Y， Yang J， et al． 2012． A serine / threonine-protein
phosphatase PP2A catalytic subunit is essential for asexual
development and plant infection in Magnaporthe oryzae． Current
Genetics，59: 1 － 9．
Gaufichon L，Ｒeisdorf-Cren M，Ｒothstein S J，et al． 2010． Biological
functions of asparagine synthetase in plants． Plant Science，179
(3) : 141 － 153．
Gaur A，Adholeya A． 2004． Prospects of arbuscular mycorrhizal fungi in
phytoremediation of heavy metal contaminated soils． Current
Science，86(4) : 528 － 534．
Genre A， Bonfante P． 1998． Actin versus tubulin configuration in
arbuscule-containing cells from mycorrhizal tobacco roots． New
Phytologist，140(4) : 745 － 752．
Gianinazzi-Pearson V， Dumas-Gaudot E， Gollotte A， et al． 1996．
Cellular and molecular defence-related root responses to invasion by
arbuscular mycorrhizal fungi． New Phytologist，133(1) : 45 － 57．
Hildebrandt U，Ｒegvar M，Bothe H． 2007． Arbuscular mycorrhiza and
heavy metal tolerance． Phytochemistry，68(1) : 139 － 146．
Hu N，Han X，Lane E K，et al． 2013． Cardiac-specific overexpression
of metallothionein rescues against cigarette smoking exposure-
induced myocardial contractile and mitochondrial damage． PloS
One，8(2) : e57151．
Hwang J，Oh C S，Kang B C． 2013． Translation elongation factor 1B
( eEF1B ) is an essential host factor for tobacco mosaic virus
infection in plants． Virology，439(2) :105 － 114．
Kim Y J，Yeu S Y，Park B S，et al． 2012． Protein disulfide isomerase-
like protein 1-1 controls endosperm development through regulation
of the amount and composition of seed proteins in rice． PLoS One，
7(9) :e44493．
Kiruthika J，Ｒajesh S，Ponniah A G，et al． 2013． Molecular cloning and
characterization of Acyl-CoA binding protein ( ACBP ) gene from
shrimp Penaeus monodon exposed to salinity stress． Developmental
＆ Comparative Immunology，40(1) :78 － 82．
Klingner A，Hundeshagen B，Kernebeck H，et al． 1995． Localization of
the yellow pigment formed in roots of gramineous plants colonized by
arbuscular fungi． Protoplasma，185(1 － 2) : 50 － 57．
Klironomos J N． 2003． Variation in plant response to native and exotic
arbuscular mycorrhizal fungi． Ecology，84(9) : 2292 － 2301．
Klosterman S J，Anchieta A，Garcia-Pedrajas M D，et al． 2011． SSH
reveals a linkage between a senescence-associated protease and
verticillium wilt symptom development in lettuce ( Lactuca sativa) ．
Physiological and Molecular Plant Pathology，76(1) : 48 － 58．
Kong H Y， Jung H W， Lee S C， et al． 2002． A gene encoding
stellacyanin is induced in Capsicum annuum by pathogens，methyl
jasmonate， abscisic acid， wounding， drought and salt stress．
Physiologia Plantarum，115(4) : 550 － 562．
Kosmidou E， Lunness P， Doonan J H． 2001． A type 2A protein
phosphatase gene from Aspergillus nidulans is involved in hyphal
morphogenesis． Current Genetics，39(1) : 25 － 34．
Kuo J，Liang Z C，Lin C H． 2010． Suppression subtractive hybridization
identifies genes correlated to symbiotic and aposymbiotic sea
anemone associated with dinoflagellate． Journal of Experimental
Marine Biology and Ecology，388(1) : 11 － 19．
Kuttner Y Y，Nagar T，Engel S． 2013． Surface dynamics in allosteric
regulation of protein-protein interactions: modulation of calmodulin
functions by Ca2 + ． PLoS Comput Biol，9(4) :e1003028．
Lamport D T A，Kieliszewski M J，Chen Y，et al． 2011． Ｒole of the
extensin superfamily in primary cell wall architecture． Plant Physiol，
156(1) :11 － 19．
Lohse S，Schliemann W，Ammer C， et al． 2005． Organization and
metabolism of plastids and mitochondria in arbuscular mycorrhizal
roots of Medicago truncatula． Plant Physiology， 139 ( 1 ) :
329 － 340．
Margaret A． 2005． Identication of novel Trichoderma hamatum genes
expressed during mycoparasitism using subtractive hybridization，
FEMS Microbiology Letters，251:105 － 112
Munkvold L，Kjller Ｒ，Vestberg M， et al． 2004． High functional
diversity within species of arbuscular mycorrhizal fungi． New
Phytologist，164(2) : 357 － 364．
Phillips J M，Hayman D S． 1970． Improved procedures for clearing roots
and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for
rapid assessment of infection． Transactions of the British Mycological
Society，55(1) : 158 － 161．
Ｒebrikov D V，Desai S M，Siebert P D， et al． 2004． Suppression
subtractive hybridization． Methods Mol Biol，258:107 － 134．
Sasabe M，Boudolf V，De Veylder L，et al． 2011． Phosphorylation of a
mitotic kinesin-like protein and a MAPKKK by cyclin-dependent
kinases ( CDKs ) is involved in the transition to cytokinesis in
plants． Proceedings of the National Academy of Sciences USA，108
(43) : 17844 － 17849．
Schütt B S，Brummel M，Schuch Ｒ，et al． 1998． The role of acyl carrier
protein isoforms from Cuphea lanceolata seeds in the de-novo
biosynthesis of medium-chain fatty acids． Planta， 205 ( 2 ) :
263 － 268．
Singh Ｒ，Jwa N S． 2013． The rice MAPKK-MAPK interactome: the
biological significance of MAPK components in hormone signal
37
林 业 科 学 50 卷
transduction． Plant Cell Ｒeports，32(6) : 1 － 9．
Smith F A，Grace E J，Smith S E． 2009． More than a carbon economy:
nutrient trade and ecological sustainability in facultative arbuscular
mycorrhizal symbioses． New Phytologist，182(2) : 347 － 358．
Smith S E，Jakobsen I，Grnlund M，et al． 2011． Ｒoles of arbuscular
mycorrhizas in plant phosphorus nutrition: interactions between
pathways of phosphorus uptake in arbuscular mycorrhizal roots have
important implications for understanding and manipulating plant
phosphorus acquisition． Plant Physiology，156(3) : 1050 － 1057．
Sprent J I． 2007． Evolving ideas of legume evolution and diversity: a
taxonomic perspective on the occurrence of nodulation． New
Phytologist，174(1) : 11 － 25．
Sulieman S，Fischinger S A，Gresshoff P M，et al． 2010． Asparagine as
a major factor in the N-feedback regulation of N2 fixation in
Medicago truncatula． Physiologia Plantarum，140(1) : 21 － 31．
Takeuchi H， Higashiyama T． 2012． A species-specific cluster of
defensin-like genes encodes diffusible pollen tube attractants in
Arabidopsis． PLoS Biology，10(12) : e1001449．
Xia Y，Yu K，Gao Q，et al． 2012． Acyl CoA binding proteins are
required for cuticle formation and plant responses to microbes．
Frontiers in Plant Science，3:224．
Xu，L，Liu Z Y，Zhang K，et al． 2013． Characterization of the Pinus
massoniana transcriptional response to Bursaphelenchus xylophilus
infection using suppression subtractive hybridization． Int J Mol Sci，
14:11356 － 11375．
Yadav P K，Singh G，Gautam B，et al． 2013． Molecular modeling，
dynamics studies and virtual screening of Fructose 1，6 biphosphate
aldolase-Ⅱ in community acquired-methicillin resistant
Staphylococcus aureus ( CA-MＲSA ) ． Bioinformation， 9 ( 3 ) :
158 － 164．
Yatzkan E，Szo″ r B，Feher Z，et al． 1998． Protein phosphatase 2A is
involved in hyphal growth of Neurospora crassa． Molecular and
General Genetics MGG，259(5) : 523 － 531．
(责任编辑 朱乾坤)
47