全 文 ：第 wu卷 第 z期
u s s y年 z 月
林 业 科 学
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∏¯ qou s s y
转 βετΑ基因小黑杨的耐盐性分析及
优良转基因株系的选择 3
刘桂丰t 杨传平t 蔡智军u 程贵兰u 詹立平t
kt1 东北林业大学林学院 哈尔滨 txssws ~ u1 辽宁农业职业技术学院 熊岳 ttxutwl
摘 要 } 在前期获得 tv个小黑杨转胆碱脱氢酶基因k βετΑl株系的基础上 o选择 |个生长正常的转基因株系与非
转基因对照 o用 s !tss !tws !tzs !uss °°²¯#pt x种浓度的 ‘¤≤¯ 处理盆栽苗木 o分 u !z !tu !tz !uu §取处理材料叶片 o测
定转基因株系叶片中外源基因的最终合成产物 ) ) ) 甜菜碱含量 ∀盐处理 ys §后 o测定苗木高度及转基因株系的盐
害指数 ∀结果表明 o转基因株系与对照间的甜菜碱含量差异达到极显著水平 o|个转基因株系的甜菜碱平均含量超
过对照的 uz1t h ~转基因株系的平均盐害指数较对照低 tx1{ h ~转基因株系的平均高度超过对照 ww1t h ∀综合转
基因株系的生长速度 o兼顾其耐盐性 o初步选择转基因株系 ×w !×y !×x !×t作为生长速度快耐盐性高的优良株系 ∀
关键词 } 小黑杨 ~转基因株系 ~胆碱脱氢酶基因k βετΑl ~甜菜碱 ~耐盐性
中图分类号 }≥zt{1wy ~±|wv1u 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussylsz p ssvv p sw
收稿日期 }ussx p st p sz ∀
基金项目 }国家转基因植物研究与产业化专项基金kussu p …p sswl和黑龙江省攻关课题kŠ…st…ysv p swl ∀
3 东北林业大学硕士研究生刘甜甜 !李艳霞 !姜莹 !常万霞也参加了部分工作 ∀
Σαλτ Τολερανχε οφ βετΑ Τρανσγενιχ Ποπυλυσσιµονιι ≅ Πq νιγρα
ανδ Σελεχτιον φορ Συπεριορ Τρανσγενιχ Πλαντσ
¬∏Š∏¬©¨ ±ªt ≠¤±ª≤«∏¤±³¬±ªt ≤¤¬«¬­∏±u ≤«¨ ±ªŠ∏¬¯¤±u «¤± ¬³¬±ªt
kt q Χολλεγε οφ Φορεστρψo Νορτηεαστ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Ηαρβιν txssws ~ u q Λιαονινγ Αγριχυλτυραλ Προφεσσιοναλανδ Τεχηνιχαλ Χολλεγε Ξιονγψυε ttxutwl
Αβστραχτ} βετΑ¬¶¤ª¨ ±¨ ±¨¦²§¬±ª¦«²¯¬±¨ §¨«¼§µ²ª¨±¤¶¨ qŒ±·«¨ ³µ¨√¬²∏¶º²µ®otv βετΑ·µ¤±¶ª¨±¬¦ Ποπυλυσ σιµονιι ≅ Πq
νιγρα ³¯¤±·¶ º¨ µ¨ ²¥·¤¬±¨ §q Œ± ·«¬¶ ¬¨³¨µ¬°¨ ±·o | ·µ¤±¶ª¨±¬¦ ³¯¤±·¶ º¨ µ¨ ¦«²¶¨± ©²µ¶¤¯··²¯ µ¨¤±¦¨ ·¨¶·q ×µ¤±¶ª¨±¬¦¤±§
∏±·µ¤±¶©²µ°¨ §¦²±·µ²¯ ³¯¤±·¶º¨ µ¨ ·µ¨¤·¨§º¬·«s otss otws otzs o¤±§uss °°²¯#pt ‘¤≤¯ ©²µ§¬©©¨µ¨±·³¨µ¬²§²©·¬°¨ q „©·¨µ
·«¨¶¨ ³¯¤±·¶º¨ µ¨ ·µ¨¤·¨§©²µu oz otu otz ¤±§uu §¤¼¶o·«¨ ¥¨·¤¬±¨ ¦²±·¨±·²©·µ¤±¶ª¨±¬¦³¯¤±·¶¤±§∏±·µ¤±¶©²µ°¨ §¦²±·µ²¯ ³¯¤±·¶
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¦²±·µ²¯ ³¯¤±·¶q…¤¶¨§²±·«¨ ªµ²º·«µ¤·¨¤±§·«¨ ¶¤¯··²¯ µ¨¤±¦¨ o×t o×w o×x ¤±§×y·µ¤±¶ª¨±¬¦¯¬±¨ ¶º¨ µ¨ ¬§¨±·¬©¬¨§¤¶³¯¤±·¶º¬·«
«¬ª«¶¤¯··²¯ µ¨¤±¦¨ ¤±§©¤¶·ªµ²º·«q
Κεψ ωορδσ} Ποπυλυσσιµονιι ≅ Πq νιγρα~·µ¤±¶ª¨±¬¦³¯¤±·~ βετΑ~¥¨·¤¬±¨ ~¶¤¯··²¯ µ¨¤±¦¨
盐逆境引起植物伤害的原因之一是渗透胁迫造成的次生盐害 ∀甜菜碱作为次生代谢产物在植物中起到
渗透调节作用 o进而提高植物的耐盐性 ∀许多高等植物 o特别是藜科k≤«¨ ±²³²§¬¤¦¨¤¨ l和禾本科kŠµ¤°¬±¨ ¤¨ l植
物 o干旱或盐胁迫下常积累大量的甜菜碱k江香梅等 oussul ∀在植物中甜菜碱以胆碱为底物 u 步合成
k‹¤±¶²± ετ αλqot|{u ~¦≤∏¨ ετ αλqot||sl }胆碱 胆碱加单氧酶 k≤  ’l 甜菜碱醛 甜菜碱醛脱氢酶k…„⁄‹l 甜菜碱 ∀由
于胆碱代谢途径的中间产物甜菜碱醛是抑制植物生长的有毒物质 o而 …„⁄‹则可直接利用此底物 o从而解除
它对植物生长的抑制 o因而关于 …„⁄‹ 的研究较多k梁峥等 ot||z ~刘凤华等 ot||z ~何锶洁等 ot||| ~郭北海
等 ousss ~李银心等 ousssl ∀另外 o存在于微生物和哺乳动物中的胆碱脱氢酶k¦«²¯¬±¨ §¨«¼§µ²ª¨±¤¶¨ o≤⁄‹l具
有胆碱加单氧酶k≤ ’l与甜菜碱醛脱氢酶k…„⁄‹lu个酶的功能 o能够催化甜菜碱合成的 u个连续反应 o既
能以胆碱为底物 o也能以甜菜碱醛为底物进行甜菜碱的合成 o因此编码胆碱脱氢酶基因k βετΑl逐渐受到重
视 o已经用于植物的耐盐转基因研究k¬¯¬∏¶ετ αλqot||y ~‹²¯ °¶·µ²° ετ αλqousss ~王淑芳等 ousstl ∀本文在前期
获得转基因株系并确认 βετΑ已经导入小黑杨k Ποπυλυσ σιµονιι ≅ Πq νιγραl基因组中的基础上k杨传平等 o
usstl o进一步研究不同转基因株系在盐胁迫下甜菜碱的表达和耐盐能力 ∀
t 材料与方法
在前期获得 tv个小黑杨转 βετΑ基因株系的基础上 o选取生长正常的 ×t !×u !×v !×w !×x !×y !×z !×{ !×|共
|个株系 ot个对照株系 ×s ∀每个株系剪取长 tx ¦° !直径 t ¦°的插条 zx个 o分别扦插于 zx个塑料桶内 ots
个株系一共扦插 zxs桶 o放入温室中培养 ∀扦插用的基质为草炭土和沙子按 vΒt体积比均匀混合而成 ∀待
扦插苗的高度长至 s1y °左右时 o进行 s !tss !tws !tzs和 uss °°²¯#pt x个浓度的 ‘¤≤¯ 盐胁迫处理 o每个浓
度重复 v次 o每小区 x桶 ∀在盐处理的第 u !z !tu !tz !uu天取叶片测定甜菜碱含量 o并对测定结果进行方差和
动态变化分析 ∀同时在盐胁迫处理 ys §后 o观察各株系的盐害程度 o并测量株高 o综合分析其耐盐性 ∀
盐害分级标准 s级 }无盐害症状 ~t级 }轻度盐害 o有少部分叶尖 !叶缘或叶脉变黄 ~u级 }中度盐害 o有
大约 tΠu的叶尖 !叶缘焦枯 ~v级 }重度盐害 o大部分叶尖 !叶缘焦枯或部分叶片脱落 ~w级 }极重度盐害 o枝枯 o
叶片全部脱落 ∀盐害指数计算公式为 }盐害指数k ∆l € Ε k盐害级值 ≅相应盐害级值株数lΠk总株数 ≅ 盐害
最高级值l ≅ tss h ∀
甘氨酸甜菜碱的提取 !含量测定及标准曲线的绘制按李优琴等kt|||l的方法 ∀
u 结果与分析
211 转基因株系及非转基因对照在盐胁迫下甜菜碱含量的多重比较分析
对 |个转基因株系和 t个对照株系 o经 w种盐浓度处理 o测定 x个不同时间叶片的甜菜碱含量 o并进行
方差分析 ∀结果 ts种试验材料的甜菜碱含量差异达到极显著水平k Φs1st € {1x{l ∀多重比较k表 tl表明 }在
x h的显著水平下 o除了转基因株系 ×v与 ×w !×y !×x !×t !×s之间差异显著外 o其他的转基因株系之间无显著
性差异 o但各转基因株系与非转基因对照间差异均显著 ~在 t h的显著水平下 o各转基因株系之间无显著性
差异 o而各转基因株系均与非转基因对照间存在显著性差异 o说明转入的外源基因在各转基因株系中均已表
达 ∀|个转基因株系的甜菜碱含量平均值超过非转基因株系的 uz1t h ∀甜菜碱含量最高的 ×v超过非转基因
株系的 v|1t h o最低的 ×t甜菜碱含量也超过非转基因株系的 t|1y h ∀
表 1 各转基因株系与对照甜菜碱含量的多重比较 ≠
Ταβ . 1 Μυλτιπλε χοµ παρισον οφ βεταινε χοντεντ βετωεεν
τρανσγενιχ ανδ χοντρολ πλαντσ
转基因株系和对照
×µ¤±¶ª¨ ±¬¦¤±§¦²±·µ²¯
甜菜碱含量
…¨ ·¤¬±¨ ¦²±·¨±·Πk°ª#ªpt ƒ • l
×v s1tu{ {u{ s „ ¤
×| s1tut wuw w „ ¤¥
×u s1tus ysw s „ ¤¥
×z s1ttz sxu s „ ¤¥
×{ s1ttv zu{ s „ ¤¥
×w s1ttv wss s „ ¥
×y s1ttu |ws s „ ¥
×x s1ttt {ww s „ ¥
×t s1ttt tux s „ ¥
×sk≤Žl s1s|t vvu s … ¦
≠ 不同大 !小写字母分别表示 s1st 和 s1sx 水平上差异显著 ∀
⁄¬©©¨µ¨±·¦¤³¬·¤¯ ²µ¶°¤¯¯ ¯¨ ·¨µ¶¬±§¬¦¤·¨ ¶¬ª±¬©¬¦¤±·¯¼ §¬©©¨µ¨±¦¨ ¤·s1st ²µs1sx
¯¨ √¨¯ oµ¨¶³¨¦·¬√¨ ¼¯ q
212 非盐胁迫下转基因株系与对照甜菜碱含量的
动态变化
在正常浇水的非盐胁迫条件下 o在 uu §内 x次
测定了 |个转基因株系及对照的甜菜碱含量 o将转
基因株系甜菜碱含量的平均值与对照株系比较 o结
果转基因株系与对照株系的甜菜碱含量随着盐胁迫
时间的增加均呈现增高 ) 降低 ) 再增高 ) 再降低的
动态变化趋势 o但转基因株系的甜菜碱含量始终高
于对照株系 o说明转基因株系除了本底的甜菜碱合
成外 o转入的外源胆碱脱氢酶基因已经表达 o从而增
加了转基因株系甜菜碱的含量k图 tl ∀从图 t可以
看出 o转基因小黑杨在 us §的生长发育期内 o甜菜
碱含量有逐渐增加的趋势 ~而非转基因对照株系的
甜菜碱含量增加不明显 ∀
213 盐胁迫下转基因株系与对照甜菜碱含量的动态变化
在不同盐胁迫条件下 o|个转基因株系的平均甜菜碱含量 o随着盐处理时间的延长 o甜菜碱基本呈现逐
渐增加的趋势k图 ul ∀在 tws !tzs和 uss °°²¯#pt的 ‘¤≤¯ 浓度条件下 o在盐处理初期kz §之前l o非转基因
对照的甜菜碱含量增加明显并且逐渐高于转基因株系 o但到 tu §之后 o非转基因株系的甜菜碱含量一直低
于转基因株系 o这一表现是非转基因株系对高盐逆境的一种初期应急性反应 ~转基因株系对于这种高盐逆境
wv 林 业 科 学 wu卷
图 t 非盐胁迫条件下转基因株系与对照
的甜菜碱含量动态变化
ƒ¬ªqt ׫¨ ¦«¤±ª¨ ²©¥¨·¤¬±¨ ¦²±·¨±·¬±·µ¤±¶ª¨ ±¬¦¤±§
¦²±·µ²¯ ³¯¤±·¶∏±§¨µ·«¨ ±²µ°¤¯ ªµ²º·«¦²±§¬·¬²±
反应迟钝 o主要是由于外源基因的转入增加了甜菜碱含量 o
对高盐逆境较适应的结果 ∀
214 各转基因株系及对照的盐害指数
在连续给予盐胁迫 ws §后 o统计每个株系在 w种不同盐
浓度下的平均盐害指数k图 vl ∀由图 v可以看出 o各转基因
株系的盐害指数均较非转基因对照株系低 ∀盐害指数最高
的非转基因对照 ×s达到 s1|u ~转基因各株系中 o×x的盐害
指数最低为 s1yz o×t !×v !×y盐害指数均为 s1zx o其余转基因
各株系盐害指数均为 s1{t o转基因株系的平均盐害指数较对
照低 tx1{ h ∀因此各转基因株系均较非转基因对照的耐盐
性高 ∀
215 盐胁迫下转基因株系及对照的高生长表现
测定了各转基因株系经不同盐胁迫处理 u个月后的株
高k表 ul ∀方差分析表明 o转基因株系及对照间差异达到极
图 u 各转基因株系与对照在不同盐胁迫条件下甜菜碱含量的变化
ƒ¬ªqu …¨ ·¤¬±¨ ¦²±·¨±·¬±·µ¤±¶ª¨ ±¬¦¤±§¦²±·µ²¯ ³¯¤±·¶∏±§¨µ§¬©©¨µ¨±·¶¤¯·¶·µ¨¶¶¦²±§¬·¬²±¶
显著水平k Φ€ tw1uul ∀转基
因株系在 ‘¤≤¯ 各浓度下的平
均高度超过对照 ww1t h o其
中 ×w !×y !×x !×t生长速度快 !
耐盐性高 o可选作优良株系 ∀
另外 o在非盐处理下对照
的株高也显著低于转基因株
系 ∀其原因是用于耐盐试验
的 |个转基因株系是从 tv个
转基因株系中选择出来的表
现正常 !生长健壮的株系 ∀未
中选的 w个转基因株系呈畸
形状态 o生长缓慢 o这可能是
外源基因随机插入造成某些
基因破坏的结果 ~而被选择的
|个株系 o外源基因的插入未
破坏原来基因的结构 o反而增
加了甜菜碱的含量 o提高了细
胞的渗透性 o同时甜菜碱具有
图 v 各转基因株系及对照的盐害指数
ƒ¬ªqv ׫¨ ¬±§¨¬²©¶¤¯·§¤°¤ª¨¶·²·µ¤±¶ª¨±¬¦³¯¤±·¶¤±§¦²±·µ²¯ ³¯¤±·¶
保护生物大分子稳定性的能力 o这些均改善了转基因株系的
代谢水平 o使转基因株系株高在未进行盐处理的条件下较对
照高 ∀
v 讨论
本研究所采用的 βετΑ基因来自大肠杆菌k Εσχηερχηια
χολιl基因组 o它编码的胆碱脱氢酶能够由底物一步合成甜菜
碱 o因此广泛用于植物的耐盐转基因研究 ∀¬¯¬∏¶等kt||yl将
βετΑ基因导入烟草k Νιχοτιανα ταβαχυµl o获得了耐盐性kvss
°°²¯ # pt ‘¤≤¯ l提高 {s h k以质量计l的转基因植株 ∀
‹²¯ °¶·µ²°等kusssl将 βετΑ基因转入烟草 o同样也获得了较
强的耐盐性 ∀王淑芳等 kusstl将 βετΑ 基因导入番茄
xv 第 z期 刘桂丰等 }转 βετΑ基因小黑杨的耐盐性分析及优良转基因株系的选择
表 2 在不同盐胁迫条件下转基因株系与对照的高生长
Ταβ . 2 Τηε ηειγητ γροωτη οφ τρανσγενιχ ανδ χοντρολ πλαντσ υνδερ διφφερεντ σαλτ στρεσσ χονδιτιονσ
‘¤≤¯ 浓度
‘¤≤¯ ¦²±¦¨±·µ¤·¬²±Π
k°°²¯#ptl
株高 °¯ ¤±·«¨¬ª«·Π¦°
×s ×t ×u ×v ×w ×x ×y ×z ×{ ×|
s twy1v uu|1z tyt1v tyv1z t|v1v uv{1s uwy1s t|t1z uuv1s tzu1v
tss tvt1z uut1s t|x1v tyt1z t{z1z t|w1v uuz1z tvy1v txy1s txs1v
tws tu{1v utu1v t|t1z tu|1v t|z1v us|1v utt1v tuv1s tzt1z tvw1s
tzs tux1y uts1y tww1s tzx1s ut|1s usx1s uty1z tyy1v t{z1z tyt1z
uss tuu1z uss1v t|{1v usu1z uu{1v us|1z uut1s twu1z txs1z tv|1s
平均  ¤¨± tuz1s utt1s t{u1v tyz1t us{1s usw1x ut|1t twu1s tyy1x twy1u
kΛψχοπερσιχον εσχυλεντυµl中 o在 txs !uss °°²¯#pt ‘¤≤¯ 处理下 o转基因番茄与对照番茄相比叶片质膜透性分别
低约 tw h !uv h o统计分析表明 o差异达显著水平 ∀由于甜菜碱合成途径比较简单 o遗传操作方便 o所以甜菜
碱合成酶基因被认为是重要 !有希望的盐胁迫抗性基因之一 ∀本研究通过农杆菌介导法将 βετΑ基因转入小
黑杨基因组中 o对 |个转基因株系的耐盐性试验结果表明 o转基因株系较非转基因株系的耐盐性显著提高 o
在 tws °°²¯#pt ‘¤≤¯ 处理 ws §的条件下 o转基因株系叶片受害较轻甚至看不出盐害 o而非转基因对照叶片
全部脱落 ∀
转基因株系间生长量大小也存在明显差异 ∀由于这些转基因株系来自于同一个无性系 o原来基因型完
全相同 o遗传转化后它们的差异主要是由于外源基因插入位点不同造成的 o这些材料为今后进一步研究外源
基因的插入位点及其周围基因的结构功能提供了物质基础 ∀
虽然由 vx≥组成型启动子转录的外源胆碱脱氢酶基因kβετΑl不受外界环境所诱导 o由该基因最终合成
的甜菜碱也不受盐的影响 o但转基因株系本底的与甜菜碱合成相关基因将被诱导 o因此随着盐胁迫时间的增
加 o转基因株系的甜菜碱含量增加 ∀由于本底基因与外源基因的双重作用 o转基因株系的甜菜碱含量较对照
高k图 ul o耐盐性也较对照高k图 vl ∀
参 考 文 献
郭北海 o张艳敏 o李洪杰 o等 qusss1 甜菜碱醛脱氢酶k…„⁄‹l基因转化小麦及其表达 q植物学报 owukvl }uz| p u{v
何锶洁 o董 伟 o李慧芬 o等 qt|||1 转甜菜碱醛脱氢酶基因玉米及其耐盐性研究 q高技术通讯 okul }xs p xu
江香梅 o黄敏仁 o王明庥 qussu1 植物甜菜碱合成途径及基因工程研究进展 q中国生物工程杂志 ouukwl }w| p xy
李银心 o常凤启 o杜立群 o等 qusss1 转甜菜碱醛脱氢酶基因豆瓣菜的耐盐性 q植物学报 owukxl }w{s p w{w
李优琴 o高家骅 o周维仁 o等 qt|||1 比色法测定合成甜菜碱的含量 q江苏农业学报 otxkul }tuz p tu{
梁 峥 o马德钦 o汤 岚 o等 qt||z1 菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因在烟草中的表达 q生物工程学报 otvkvl }uvy p uws
刘凤华 o郭 岩 o谷冬梅 o等 qt||z1 转甜菜碱醛脱氢酶基因植物的耐盐性研究 q遗传学报 ouwktl }xw p x{
王淑芳 o王峻岭 o赵彦修 o等 qusst1 胆碱脱氢酶基因的转化及转基因番茄耐盐性的鉴定 q植物生理学报 ouzkvl }uw{ p uxu
杨传平 o刘桂丰 o梁宏伟 o等 qusst1 耐盐基因 βετΑ转化小黑杨的研究 q林业科学 ovzkyl }vw p v{
‹¤±¶²± „ ⁄o ‹¬·½ • ⁄qt|{u1  ·¨¤¥²¯¬¦µ¨¶³²±¶¨¶²© ° ¶¨²³«¼·¨¶·² ³¯¤±·º¤·¨µ§¨©¬¦¬·¶q„±±∏ • √¨ °¯ ¤±·°«¼¶¬²¯ ovv }tyv p usv
‹²¯ °¶·µ²° Ž’ o≥²° µ¨¶¤¯² ≥ o ¤±§¤¯ „ o ετ αλqusss1 Œ°³µ²√¨ §·²¯ µ¨¤±¦¨ ·²¶¤¯¬±¬·¼¤±§ ²¯º ·¨°³¨µ¤·∏µ¨ ¬±·µ¤±¶ª¨ ±¬¦·²¥¤¦¦²³µ²§∏¦¬±ªª¯¼¦¬±¨ ¥¨·¤¬±¨ q∞¬³
…²·oxtkvwvl }tzz p t{x
¬¯¬∏¶Š o ‹²¯ °¥¨µª‘o…∏¯²º qt||y1 ∞±«¤±¦¨§‘¤≤¯ ¶·µ¨¶¶·²¯ µ¨¤±¦¨ ¬±·µ¤±¶ª¨ ±¬¦·²¥¤¦¦² ¬¨³µ¨¶¶¬±ª¥¤¦·¨µ¬¤¯ ¦«²¯¬±¨ §¨«¼§µ²ª¨ ±¤¶¨ q…¬² × ¦¨«±²¯ otw }tzz
p t{s
¦≤∏¨ Žƒ o ‹¤±¶²± „ ⁄qt||s1 ⁄µ²∏ª«·¤±§¶¤¯··²¯ µ¨¤±¦¨ }·²º¤µ§¶∏±§¨µ¶·¤±§¬±ª¤±§¤³³¯¬¦¤·¬²±q׬¥·¨¦«o{ }vx{ p vyu
k责任编辑 徐 红l
yv 林 业 科 学 wu卷