全 文 ：第 v{卷 第 y期
u s s u年 tt 月
林 业 科 学
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板栗种子超低温保存研究
郑郁善 陈礼光 李庆荣 林镇斌
k福建农林大学林学院 南平 vxvsstl
吴擢溪
k福建省尤溪县林科所 尤溪 vyxtssl
关键词 } 板栗 o含水量 o超低温保存 o种子活力
收稿日期 }ussu2sz2u| ∀
基金项目 }国家自然科学基金资助项目kv|yzsys{l ∀
ΣΤΥ∆Ψ ΟΦ ΧΡΨΟΠΡΕΣΕΡ ς ΑΤΙΟΝ ΟΝ ΧΑΣΤΑΝΕΑ ΜΟΛΛΙΣΣΙΜΑ ΣΕΕ∆Σ
«¨ ±ª ≠∏¶«¤± ≤«¨ ± ¬ª∏¤±ª ¬±¬±ªµ²±ª ¬± «¨ ±¥¬±
k Φυϕιαν Φορεστρψ Χολλεγε o Φυϕιαν Αγριχυλτυραλανδ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Νανπινγ vxvsstl
• ∏«∏²¬¬
kΨουξι Φορεστρψ Σχιενχε Ρεσεαρχη Ινστιτυτε Ψουξιvyxtssl
Αβστραχτ} ׫¨ ∏´¤¯¬·¼ ¦«¤µ¤¦·¨µo·«¨ §¨«¼§µ²ª¨±¤¶¨ ¤¦·¬√¬·¬¨¶¤±§·«¨ Α2¤°¼¯¤¶¨ ¤¦·¬√¬·¼ ²© Χαστανεα µολλισσιµα ¦²±2
¶¨µ√¨ §°¤·¨µ¬¤¯¶o¬±¦¯∏§¬±ª·«¨ ¶¨ §¨¶¤±§·«¨ ¬¨¦¬¶¨§ °¨¥µ¼²¶o º¨ µ¨ ¤±¤¯¼½¨ §©²µ³∏µ³²¶¨ ²©·«¨ ©¨¤¶¬¥¬¯¬·¼ ²© ²¯±ª2·¨µ°
¶·²µ¤ª¨ ¤¶¶²¦¬¤·¨§º¬·«¦µ¼²³µ¨¶¨µ√¤·¬²±q׫¨ µ¨¶∏¯·¶¶«²º¨ §·«¤·°²¬¶·∏µ¨ ¦²±·¨±·º¤¶·«¨ ¦µ¬·¬¦¤¯ ©¤¦·²µ§¨¦¬§¬±ª·«¨ ¦µ¼²2
³µ¨¶¨µ√¤·¬²± ©¨©¨¦·¶²©¶¨ §¨¶oº«¬¦«º¨ µ¨ §¨¶¬¦¦¤·¨§§²º±·²us h ±¨ ¦¨¶¶¤µ¬¯¼q˜±§¨µ·«¨ ¦²±§¬·¬²±¶²©·«¨ ¦µ¼²³µ²·¨¦·¤±·¶o
·«¨ ©µ¨ ½¨¬±ª¬±­∏µ¼ µ¨§∏¦¨§ ¤¯µª¨ ¼¯ o¤±§§¨«¼§µ²ª¨±¤¶¨ ¤¦·¬√¬·¬¨¶µ¨°¤¬±¨ §º¨ ¯¯ q ²µ¨²√¨ µ·«¨ ¦µ¼²¦²±¶¨µ√¨ §¶¦¤¯¨²©°²¬¶2
·∏µ¨ ¦²±·¨±·º¤¶ ±¨¯¤µª¨§q„ ³µ²³¨µ¦²°¥¬±¤·¬²± ²©¦µ¼²³µ¨¶¨µ√¨ §©¤¦·²µ¶¦²±·µ¬¥∏·¨§·² °¤¬±·¤¬±·«¨ ¶¨ §¨√¬ª²µo·«¨ §¨2
«¼§µ²ª¨±¤¶¨ ¤¦·¬√¬·¼ ¤±§Α2¤°¼¯¤¶¨ ¤¦·¬√¬·¼ ²© ¬¨¦¬¶¨§ °¨¥µ¼²¶§∏µ¬±ª¦µ¼²³µ¨¶¨µ√¤·¬²±q
Κεψ ωορδσ} Χαστανεα µολλισσιµαo ²¬¶·∏µ¨ ¦²±·¨±·o≤µ¼²³µ¨¶¨µ√¤·¬²±o≥¨ §¨√¬ª²µ
板栗k Χαστανεα µολλισσιµαl种子属于典型的顽拗性种子kµ¨¦¤¯¦¬·µ¤±·¶¨ §¨¶l ∀目前 o人们通常用保湿贮
藏法延长其寿命 o以达到短期k几个月到几年l贮藏的目的k傅家瑞 ot||t ~陈建勋等 ot|||l ∀但尚无有关
板栗种子种质长期贮存的成功报道 ∀而超低温保存则被认为是保存顽拗性种质最有希望的途径k郑郁
善等 ousst ~殷晓辉等 ot||y ~陈礼光等 ousstl ∀然而超低温保存技术用于种子保存的试验为时尚短k陆
旺金等 ot||{l o目前研究对象多数是蔬菜 !粮食种子 o在林木种子保存方面研究极少 o这给成功地应用于
林木种子种质长期保存造成很大的困难 ∀许多报道都认为在 p t|y ε 温度下 o保存种子时间的长短对种
子的活力无显著影响k徐刚标等 ot||{ ~吴永杰等 ot|||l ∀本文以板栗种子及其离体胚为对象 o研究超低
温保存后其种子活力 !脱氢酶活性和 Αp淀粉酶活性 o为板栗种子的超低温保存提供理论依据 ∀
1 研究材料和方法
t qt 材料 研究材料是来自福建松溪的板栗种子 o在不伤及胚的前提下 o切取约 x °° ≅ v °° ≅ v °°的
胚方 o制备离体胚 ∀将种子和离体胚统称为保存材料 ∀于种子成熟脱落后马上进行发芽率 !发芽指数和
活力指数测定 o并进行液态氮k‘ul超低温保存试验 ∀液态氮由南平化工厂提供 ∀
t qu 方法 保存材料的水分调节 保存材料相对含水量是根据5国际种子检验规程6kŒ≥ׄ编 ot|||l测
定 ∀采用高温烘干法 o温度 tsx ε o烘干 tu «∀计算公式如下 }Ξs € k鲜重 p绝干重lΠ鲜重 ≅ tss ∀保存材
料各含水量梯度制备采用减重法来计算 o即在 vs ε 烘干箱 n硅胶条件下 o使种子失水至 ux h !us h !
tx h !ts h !x h等各含水量梯度 o不失水的为原始含水量 o以不经液态氮处理的为对照k≤Žl ∀失水过程
中经常更换硅胶 o然后将不同水分的种子置于密封铝盒中备用 ∀计算公式如下 }Ξ € tss p ≈最初重量 ≅
ktss p Ξsl Π最后重量 ∀
冷解冻程序 按 Λt{kyt ≅ vyl正交设计k洪伟 ot||tl o采用有 !无预处理方法对保存材料进行各种冷
解冻程序处理 ∀冷冻方式 }快冻 } s « 停留液态氮kx §l ~缓冻 }x ε 停留 s1x « p t{ ε 停留 t « 液态氮kx
§l ~慢冻 }x ε 停留 s1x « p t{ ε 停留 w « 液态氮kx §l ∀解冻方式 }快解 }液态氮 s « ws ε 温度解冻 ~缓解 }
液态氮 s « 室温 ~慢解 }液态氮 s « p t{ ε 停留 t « x ε 停留 t « 室温 ∀按上述不同冷冻处理和解冻处
理流程处理后 o然后进行种子发芽试验和脱氢酶活性测定 ∀
表 1 因素水平安排
Ταβ . 1 Τηε αρρανγεµεντ οφ τηε φαχτορσ ανδ τηελεϖελσ
水平
¨√¨¯¶
因素 ƒ¤¦·²µ¶
含水量
²¬¶·∏µ¨ ¦²±·¨±·Πh
冷冻方式
ƒµ¨ ½¨¬±ª ° ·¨«²§¶
解冻方式
׫¤º¬±ª ° ·¨«²§¶
t x 快冻 •¤³¬§ 快解 ƒ¯ ¤¶«
u ts 缓冻  §¨¬∏° 缓解  §¨¬∏°
v tx 慢冻 ≥¯ ²º 慢解 ≥¯ ²º
w us
x ux
y ww qyyk原始 ’µ¬ª¬±¤¯l
种子发芽 参照5国际种子检验规程6
的规定 ∀各试验 w个重复 o每重复 xs粒 ∀
计算出种子的发芽率 !发芽指数和活力指
数 ∀发芽指数 }ΓΙ € Ε ΓτΠ∆τ o式中 oΓτ 为在
时间 τ日的发芽数 o∆τ 为相应的发芽日数 ∀
活力指数 }ςΙ € ΓΙ ≅ Λo式中 oΛ为幼根平均
长度 ∀
脱氢酶活性测定 ××≤ 染色法 k黄学
林等 ot||sl ∀取待测离体胚 w个重复 o每重
复 ux粒种子 o在 wx ε 温水浸种 uw«k以增强
离体胚的呼吸强度 o使显色迅速l ∀取处理
的种子或离体胚 o剥取种胚 o加 ts °s1t h ³‹z1s ××≤ p磷酸缓冲液 o加盖 o在 vz ε 黑暗条件下保温染色
y «o染色后 o倒出 ××≤ 溶液 o并用蒸馏水冲洗 u ∗ v次 o用滤纸吸去浮水 ∀观察并记录样品的染色部位 !
程度和面积 ∀按/ ××≤定位图形法0作种子生活力鉴定 ∀再加丙酮及少许分析纯石英砂充分研磨 o用丙
酮冲洗研钵 u ∗ v次 o合并洗涤液 o定容至 ts °o摇匀 ow sss ≅ ª下离心 ts °¬±∀取上清液测 ’⁄w|s值 o从
标准曲线中查出相应的还原态的 ××≤ 含量 ∀脱氢酶活性以每 ts个种胚中含有还原生成三苯基甲
k××≤‹l含量 Λª#°pt表示 ∀
Αp淀粉酶活性测定 Œu p ŽŒ显色法k黄学林等 ot||sl ∀反应体系包括 t °t °ª#°pt淀粉溶液和
t°s1st °²¯#°pt ³‹w1{醋酸反应缓冲液 ∀剥取种胚 o用 x °的醋酸研磨缓冲液匀浆 o然后将提取液
放在 zs ε 恒温水浴 us °¬±o在 w sss ≅ ª下离心 x °¬±o研磨缓冲液定容至 ts °o作为酶制剂 ∀然后吸取
酶制剂 t °加入到反应体系中 o在 vz ε 恒温水浴 s ox和 ts °¬±后 o再分别吸取反应混合液 s1v °o迅速
加入 t °显色剂和 v °蒸馏水 o摇匀 o测 ’⁄yusksl o’⁄yuskxl和 ’⁄yusktsl值 ∀淀粉酶活性的大小用每 ts
个种胚每 °¬±水解淀粉的 °ª数表示 ∀
2 结果与分析
u qt 自然状态下和脱水过程中板栗种子的发芽率分析 对原始板栗种子和脱水过程中各含水梯度的
图 t 不同含水量的板栗种子发芽率
ƒ¬ªqt ≥¨ §¨ª¨µ°¬±¤·¬²± º¬·«√¤µ¬²∏¶°²¬¶·∏µ¨ ¦²±·¨±·¶

种子进行发芽试验k图 tl ∀新采收的板栗种子的原始发
芽率较高kzy h l o发芽指数为 t1y o活力指数为 z1u o原始
含水量为 ww1yy h ∀板栗种子颗粒大 o水分含量高 o采收
时若无适时处理 o经 u ∗ v §后其种子发芽率很快大幅下
降 o而且大部分种子表面出现发霉腐烂 o果肉变黑 o耐贮
性很差 ∀在板栗种子水分调节过程中 o随着种子失水程
度的加大 o种子发芽率不断降低 ∀这主要归因于板栗种
子耐脱水性差 o在脱水过程中极易使活力弱的部分种子
受到脱水伤害 o最终导致不能萌发或萌发困难 ∀当种子
含水量降到 ts h以下时 o种子发芽率很低 ∀x h含水量
的种子受到严重脱水伤害 o基本上已丧失了活力 ∀
u qu 超低温保存对板栗种子发芽率的影响 按照 Λt{kyt ≅ vul正交设计 o将不同含水量板栗种子进行
超低温保存试验 ∀保存过程中 o对种子发芽率造成显著差异的影响因子是种子含水量 o其 y个含水量平
均值之间的最大差异为 uv h o经方差分析 oΦ€ ts1y|w  Φs1stkx o{l € y1y{u o表明各含水量之间差异达到
zwt 第 y期 郑郁善等 }板栗种子超低温保存研究
极显著水平 ~冷冻和解冻方式处理间差异未达到显著水平 ∀可见 o种子含水量是板栗超低温保存的关键
因素 ~板栗种子较高的发芽率是在 us h ∗ ux h含水量之间 ~当种子含水量为 us h时 o发芽率最高 o为
ux h ∀在冷冻方式中 o缓冻和慢冻之间发芽率接近 ∀在解冻方式中 o快解与缓解发芽率较高 ∀因此 o缓
冻缓解组合方式有较高的平均发芽率k表 ul ∀
表 2 超低温保存后板栗种子发芽率测定
Ταβ . 2 Γερµινατιον οφ Χ . µολλισσιµα σεεδσ αφτερ χρψοπρεσερϖατιον k h l
处理水平 ¨√¨ ¶¯²©·µ¨¤·°¨ ±·¶ t u v w x y 极差¤¬¬°∏° √¤µ¬¤·¬²±
含水量 ²¬¶·∏µ¨ ¦²±·¨±· u y tt ux uv { uv
冷冻方式 ƒµ¨ ½¨¬±ª °¨ ·«²§¶ t| u| uz ts
解冻方式 ׫¤º¬±ª ° ·¨«²§¶ uy uz uv w
u qv 含水量对板栗离体胚脱氢酶活性的影响 板栗离体胚在 vs ε n硅胶条件下失水至各含水量过程
中 o随含水量下降 o其 ××≤‹含量不断降低 o即脱氢酶活性下降 o降幅不断增大 ∀新采收的板栗种子胚 o
××≤‹含量极高 o达 y{1y| Λª#°pt o脱氢酶活性强 o种子呼吸作用强烈 o同时也说明其内部的生理生化过
程和代谢活动旺盛 ∀取不同含水量的种子 o在室温裸露条件下放置 { §后 o各处理种子 ××≤‹含量都大
幅下降 o而且 o在种子含水量与外界空气含水量相平衡的作用下 o种子含水量由原始含水量 yt h降至 {§
后的 vx h ∀不同处理的种子含水量越高 o劣变越快 o表现为 ××≤‹含量降低越迅速k表 vl ∀
超低温保存后离体胚脱氢酶活性随含水量的变化而改变 ∀原始含水量处理脱氢酶活性明显地降
低 o可能是高含水量在降温过程中受到比较大的降温伤害 ∀tx h含水量以上的离体胚 ××≤‹ 含量变化
趋势与超低温贮藏前极其相似 o这说明超低温保存能够较好地保存与维持离体胚活力 ∀tx h含水量的
离体胚 ××≤‹含量最高 o达 tx1ty Λª#°pt o但与贮藏前的相比 o××≤‹含量稍微有些下降 ∀ts h ∗ tx h含
水量的离体胚 ××≤‹含量降幅最小 o最接近于贮藏前的水平 o在此含水量范围内离体胚经超低温保存对
种子活力没有影响 ∀ts h以下的含水量离体胚的 ××≤‹含量下降幅度较大 ∀因此 o可以肯定的是 otx h
∗ us h的含水量对板栗离体胚超低温保存较为适合 o比 ts h的 ××≤‹含量有显著提高k表 vl ∀
将超低温保存后板栗离体胚 o结合防冻剂进行 ××≤‹ 定量测定 o当其离体胚含水量 ∴ts h时 o××≤‹
含量变化极其平缓 o含量高且变幅很小 o都处于 tw ∗ uv Λª#°pt之间 o当含水量  ts h时 o××≤‹ 含量急
剧下降 o这说明 o防冻剂预处理对脱水伤害的修复影响较小 o但能使离体胚在冷冻过程和解冻过程中所
造成的低温伤害降低到最小限度 ∀防冻剂预处理后最佳的保存含水量为 us h o××≤‹含量最高 ∀此外 o
直接用原始含水量进行添加防冻剂超低温保存板栗离体胚 o其保存效果并非最佳k表 vl ∀
表 3 各含水量板栗离体胚脱氢酶活性
Ταβ . 3 ∆εηψδρογενασε αχτιϖιτψ οφ Χ . µολλισσιµα εξχισεδ εµβρψοσ(10 εµβρψοσ) ωιτη διφφερεντ µοιστυρε χοντεντσ
kΛª#°ptl
处理 ×µ¨¤·° ±¨· 含水量 ²¬¶·∏µ¨ ¦²±·¨±·Πhx ts tx us ux 原始 ’µ¬ª¬±¤¯
对照 ≤Ž ts qz| ty qxy tz qw| uw quz vz qyu y{ qy|
自然放置 { §后 °¯ ¤¦¨§¬± ±²µ°¤¯ ¦²±§¬·¬²± { § ¤¯·¨µ t qzy v qwx v qvv v quw u qvv t q|t
降幅 ⁄²º± ¶¦²³¨ Πh {w z| {t {z |w |z
超低温保存 ≤µ¼²³µ¨¶¨µ√¤·¬²± x qxv ts qut tx qty tv qtz tu qsx z quv
降幅 ⁄²º± ¶¦²³¨ Πh w| v{ tv wy y{ {|
防冻剂超低温保存 ≤µ¼²³µ¨¶¨µ√¤·¬²± º¬·«¦µ¼²³µ²·¨¦·¤±·¶ x q{u tw qxy ty qyv uu qvt ut qvy ts qwv
降幅 ⁄²º± ¶¦²³¨ Πh wy tu x { wv {x
u qw 含水量对板栗离体胚和 Α2淀粉酶活性的影响 Α2淀粉酶能在种子萌发初期 o将种子所贮藏的大分
子营养物质分解成能直接吸收利用的小分子营养物质 o来满足种子萌发过程对营养物质和能量需求 o其
{wt 林 业 科 学 v{卷
活性的高低严重地影响种子萌发能力 o能够反映种子活力 ∀在板栗离体胚保存过程中 o含水量对离体胚
的 Α2淀粉酶活性保持也起着关键作用 o其极差最大 o为 s1tvu °ª#°¬±pt ~原始含水量的板栗离体胚不能
直接用于超低温保存 o否则会由于超低温保存时降温和升温的低温伤害造成 Α2淀粉酶活性极大下降 o其
活性水平极低 o接近已遭遇严重脱水伤害的 x h含水量时 Α2淀粉酶活性水平 ∀有利于 Α2淀粉酶活性保
持的含水量范围为 ts h ∗ us h o其 Α2淀粉酶活性均大于 s1tx °ª#°¬±pt o其中 us h含水量 Α2淀粉酶活性
最大 o达到 s1t{t °ª#°¬±pt ∀不同冷冻方式和解冻方式的 Α2淀粉酶活性差异接近 o其中在冷冻方式中 o
保持板栗离体胚的 Α2淀粉酶活性能力大小排序为 }缓冻 慢冻 快冻 o而解冻方式中则为 }缓解 快解
慢解 ∀最佳的各水平组合为 }us h含水量 n缓冻 n缓解k表 wl ∀
表 4 各含水量板栗离体胚 Α2淀粉酶活性
Ταβ . 4 Α2αµψλασε αχτιϖιτψ οφ Χ . µολλισσιµα εξχισεδ εµβρψοσ(10 εµβρψοσ) ωιτη διφφερεντ µοιστυρε χοντεντσk°ª#°¬±ptl
处理水平 ¨√¨ ¶¯²©·µ¨¤·°¨ ±·¶ t u v w x y 极差 ¤¬¬°∏° √¤µ¬¤·¬²±
含水量 ²¬¶·∏µ¨ ¦²±·¨±· s qsxx s qtxw s qtx| s qt{t s qtus s qsw| s qtvu
冷冻方式 ƒµ¨ ½¨¬±ª °¨ ·«²§¶ s qs{| s qtyu s qts| s qszv
解冻方式 ׫¤º¬±ª ° ·¨«²§¶ s qtuz s qtw| s qs{w s qsyx
3 结论与讨论
种子的超低温保存 o含水量高低以及脱水方法是关键因素 ∀含水量过高会造成保存材料在冷冻和
解冻过程中受到冻害甚至死亡 o过低又会造成脱水伤害影响其活力 ∀若能最大限度地减少脱水伤害和
降低含水量 o保存材料的活力就能得到最大限度的保持 ∀正常种子超低温保存的最适含水量一般在
| h以下 o有的含水量下限值达到 u h k≥·¤±º²²§ot|{xl o仍能保持很高的发芽率 ∀然而 o大多数顽拗性种
子的保存其最低含水量下限通常较高 o在 ts h以上k郑郁善等 ousst ~陈礼光等 ousst ~usssl ∀
本研究表明 o板栗种子在脱水过程中 o由于其脱水耐性差 o导致种子发芽率不断下降 o直至生命力丧
失 ∀超低温保存后种子发芽率除了受种子含水量影响较大外 o其次是冷冻方式 o各种解冻方式之间差异
较小 ous h含水量 n缓冻组合能够得到较高的存活率 ∀脱氢酶活性和 Α2淀粉酶活性研究结果也表明 o脱
氢酶活性和 Α2淀粉酶活性越高 o种子的活力也越高 o超低温保存能够很好地维持种子活力 ∀因此 o要想
成功地进行板栗种子超低温保存 o对保存材料进行预降温到 s ∗ x ε 处理是必需的 o特别是在离体胚添
加防冻剂的超低温保存过程中 o因为这样处理能够对保存材料进行低温锻炼 o提高存活率 ∀好的防冻剂
组合能够降低保存材料的冰点温度 o缓和超低温保存冷冻伤害 o使其最佳保存含水量范围得到扩大 ∀
参 考 文 献
陈建勋 o谢治芳 q板栗贮藏过程中的生理生化变化初探 q华南农业大学学报 ot||| ouskwl }zs ∗ zw
陈礼光 o郑郁善 o邱尔发等 q米槠和苦槠 ‘u 保存材料细胞膜代谢特征研究 q林业科学 ousst ovzk¶³qtl }tvz ∗ twu
陈礼光 o郑郁善 q闽粤栲种子和离体胚超低温保存效果研究 q江西农业大学学报 ousss ouukwl }xzt ∗ xzx
傅家瑞 q顽拗性种子 q植物生理学通讯 ot||t ouzkyl }wsu ∗ wsy
国际种子检验协会kŒ≥ׄl编 q农业部全国农作物种子质量监督检测中心 o浙江大学种子科学中心译 qt||y国际种子检验规程 q北京 }中国
农业出版社 ot||| otx ∗ t{
洪 伟 q林业试验设计技术与方法 q北京 }北京科学技术出版社 ot||t
黄学林 o陈润政 q种子生理试验手册 q北京 }农业出版社 ot||s
陆旺金 o金剑平 o向 旭等 q黄皮种子的保温贮藏及胚轴的超低温保存 q华南农业大学学报 ot||{ ot|ktl }z ∗ tt
吴永杰 o赵艳华 o周明德 q苹果休眠茎尖的超低温保存研究 q华北农学报 ot||| otwktl }tu| ∗ tvv
徐刚标 o陈良昌 q植物种质超低温保存 q经济林研究 ot||{ otykul }xt ∗ xv
殷晓辉 o舒理慧 q植物种质资源的保存研究进展 q热带亚热带植物学报 ot||y owkvl }zx ∗ {u
郑郁善 o陈礼光 o邱尔发 q‘u 保存锥栗种子的生理生化特性研究 q林业科学 ousst ovzkyl }v| ∗ ww
≥·¤±º²²§° ≤ q≤µ¼²³µ¨¶¨µ√¤·¬²± ²©¶¨ §¨ª¨µ°³¯¤¶°©²µª¨ ±¨ ·¬¦¦²±¶¨µ√¤·¬²±qŒ±}Ž¤µ·«¤ ŽŽk §¨¶l q ≤µ¼²³µ¨¶¨µ√¤·¬²± ²© ³¯¤±·¦¨¯¯¶¤±§²µª¤±¶q ƒ¯ ²µ¬§¶}
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|wt 第 y期 郑郁善等 }板栗种子超低温保存研究