全 文 ：第 v{卷 第 y期
u s s u年 tt 月
林 业 科 学
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‘²√ qou s s u
°·¯⁄Πª∏·⁄双价基因转化美洲黑杨 ≅青杨的研究 3
樊军锋
k西北农林科技大学林学院 杨凌 ztutssl
韩一凡 李 玲
k中国林业科学研究院林业研究所 北京 tsss|tl
彭学贤
k中国科学院微生物研究所 北京 tsss{sl
李嘉瑞
k西北农林科技大学园艺学院 杨凌 ztutssl
摘 要 } 利用叶盘法开展了 °·¯⁄Πª∏·⁄双价基因转化美洲黑杨 ≅青杨的研究 o经诱导不定芽及诱导生根阶段
卡那霉素k选择性抗生素l连续筛选 o获得了 v{株卡那霉素抗性植株 ∀抗性植株经 °≤• 检测 ou{株呈阳性 ∀
对其中 x株 °≤• 阳性植株进行 ≥²∏·«¨µ±及 • ¶¨·¨µ±杂交 o有 w株二者均呈阳性 o证明双价基因成功整合到美洲
黑杨 ≅青杨基因组中并得到表达 ∀耐盐实验表明这 w株转基因植株抗 ‘¤≤¯ 能力比对照均有不同程度提高 ∀
关键词 } 美洲黑杨 ≅青杨 o °·¯⁄Πª∏·⁄双价基因 o基因转化 o分子检测 o耐盐性测定
收稿日期 }ussu2sz2s| ∀
3 本实验在中国林科院林业研究所分子遗传室完成 ∀国家林业局黄土高原林木培育实验室提供了部分资助 ∀在此表示衷心感谢 ∀
ΣΤΥ∆ΙΕΣ ΟΝ ΤΡΑΝΣΦΟΡ ΜΑΤΙΟΝ ΟΦ ΜΤΛ∆ΠΓΥΤ∆ ∆Ις ΑΛΕΝΤ
ΓΕΝΕΣ ΤΟ ΠΟΠΥΛΥΣ ∆ΕΛΤΟΙ∆Σ ≅ Πq ΧΑΤΗΑΨΑΝΑ
ƒ¤±∏±©¨ ±ª
kΧολλεγε οφ Φορεστρψo Νορτηωεστ Σχι2Τεχη Υνιϖερσιτψοφ Αγριχυλτυρε ανδ Φορεστρψ Ψανγλινγztutssl
‹¤± ≠¬©¤± ¬¬±ª
k Φορεστρψ Ρεσεαρχη Ινστιτυτε o Χηινεσε Αχαδεµψοφ Φορεστρψ Βειϕινγtsss|tl
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kΙνστιτυτε οφ Μιχροβιολογψo Αχαδεµια Σινιχα Βειϕινγtsss{sl
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Αβστραχτ } ×µ¤±¶©²µ°¤·¬²± ²© °·¯⁄Πª∏·⁄§¬√¤¯ ±¨·ª¨ ±¨ ¶·² Ποπυλυσ δελτοιδσ ≅ Πq χατηαψανα ¥¼ °¨ ¤±¶²©¯¨ ¤©§¬¶¦º¤¶
∏±§¨µ·¤®¨ ±q׫µ²∏ª«¶∏¦¦¨¶¶¬√¨ ¶¨¯¨ ¦·¬²±¬±¶«²²·¤±§µ²²·¬±§∏¦·¬²±¶·¤ª¨ ∏±§¨µ«¬ª«¯¨ √¨ ¯®¤±¤°¼¦¬± ³µ¨¶¶∏µ¨ ov{ ®¤±¤2
°¼¦¬±2µ¨¶¬¶·¤±·µ²²·¨§³¯¤±·¶º¨ µ¨ ²¥·¤¬±¨ §q°≤• ¤±¤¯¼¶¬¶¶«²º¨ §·«¤·u{ ²©·«¨¶¨ ®¤±¤°¼¦¬±2µ¨¶¬¶·¤±·µ²²·¨§³¯¤±·¶º¨ µ¨
³²¶¬·¬√¨ qx ²©·«¨¶¨ u{ °≤• ³²¶¬·¬√¨ ³¯¤±·¶º¨ µ¨ ·¤®¨ ± ²∏·©²µ≥²∏·«¨µ± ¥¯²·¤±§ • ¶¨·¨µ± ¥¯²·o¤±§·«¨ µ¨¶∏¯·¬±§¬¦¤·¨§·«¤·
w ²©·«¨ x ³¯¤±·¶º¨ µ¨ ³²¶¬·¬√¨ ©²µ¥²·«q׫¬¶°¨ ¤±··«¤·°·¯⁄Πª∏·⁄§¬√¤¯ ±¨·ª¨ ±¨ ¶º¨ µ¨ ¶∏¦¦¨¶¶©∏¯¯ ¼¬±·¨ªµ¤·¨§¬±·²·«¨ ª¨2
±²°¨ ²©·«¨¶¨ w ³¯¤±·¶o¤±§·«¨ ³µ²·¨¬±¶ ¬¨³µ¨¶¶¨§¥¼ °·¯⁄Πª∏·⁄ §¬√¤¯ ±¨·ª¨ ±¨ ¶º¨ µ¨ ¶¼±·«¨¶¬½¨ §q׫¨ ¶¤¯·µ¨¶¬¶·¤±··¨¶·
§¨ °²±¶·µ¤·¨§·«¤·¶¤¯··²¯ µ¨¤±¦¨ ¤¥¬¯¬·¼ ²©·«¨¶¨ w ³¯¤±·¶º¤¶ ±¨«¤±¦¨§·²¶²°¨ ¬¨·¨±·q
Κεψ ωορδσ} Ποπυλυσ δελτοιδσ ≅ Πq χατηαψαναo ·¯⁄Πª∏·⁄§¬√¤¯ ±¨·ª¨ ±¨ ¶o Š¨ ±¨ ·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±o ²¯ ¦¨∏¯¤µ¥¬²¯²ª¬¦¤¯
¤±¤¯¼¶¬¶o≥¤¯·µ¨¶¬¶·¤±··¨¶·
我国/三北0生态环境建设区有大量盐碱地 o提高树木耐盐性 o培育耐盐品种是开发利用这些盐碱地
的一条有效途径 ∀盐生植物耐盐机理研究证明 o在高盐条件下 o盐生植物体内脯氨酸 !甜菜碱 !海藻糖 !
甘露醇 !甘油等小分子相溶性溶质含量会大大增加 o这些相溶性溶质含量的增加可降低细胞渗透性 o阻
止细胞水分外渗 o避免盐害产生k荆家海等 ot||wl ∀通过基因工程手段 o给非盐生植物导入外来基因 o影
响或改变植物生理代谢途径 o使植物体内产生和积累相溶性小分子物质 o可有效提高植物耐盐性kŽ¤√¬o
t||x ~‘¤®¤°¤µ¤ ετ αλqot||w ~ƒ¬¯¯¤·¬ot||wl ∀醇类脱氢酶是一种双向酶 o存在于某些微生物及植物体内 o
具有促进细胞中糖类物质向糖醇方向转化的功能 ∀ פµ¦½¼±¶®¬等kt||ul !¬·¦«¨¯¯kt||vl !刘俊君等kt||w ~
t||x¤~t||x¥~t||yl发现将大肠杆菌中 °·¯⁄kt2磷酸甘露醇脱氢酶基因l和 ª∏·⁄ky2磷酸山梨醇脱氢酶基
因l导入烟草后可使烟草中山梨醇含量提高 o并新产生合成和积累甘露醇的能力 o从而大大提高了烟草
耐盐性 ~同时发现 °·¯⁄Πª∏·⁄双价基因作用效果好于单价基因 ∀受此启发 ousst年 o选择/三北0地区广泛
栽植的美洲黑杨 ≅青杨作为改良对象 o系统开展了 °·¯⁄Πª∏·⁄双价基因转化研究 o得到了 v{株卡那霉素
抗性植株 ∀抗性植株经 °≤• 检测 ou{株呈阳性 ∀对其中 x株 °≤• 阳性植株进行 ≥²∏·«¨µ±及 • ¶¨·¨µ±杂
交 o有 w株二者均呈阳性 o证明 °·¯⁄Πª∏·⁄双价基因成功整合到这 w株杨树基因组中 o并翻译表达产生了
相应的酶 ∀耐盐实验证明这 w株转基因植株耐盐性较对照均有不同程度提高 ∀
t 材料与方法
1 .1 基因 !植物表达载体及农杆菌菌株
图 t 双元表达载体质粒 ³…ŒŠ 的结构图
ƒ¬ªqt ≥¦«¨ °¤·¬¦µ¨³µ¨¶¨±·¤·¬²± ²©³¯¤±·¨ ¬³µ¨¶¶¬²± √¨ ¦·²µ³…ŒŠ
‹ o ‹¬±§¶ ~…o…¤°‹ ´ ~≥ o≥¤¯ ´ ~∞o∞¦²• ´
基因为 °·¯⁄Πª∏·⁄双价基因 ∀ °·¯⁄!ª∏·⁄单价
基因分别克隆自大肠杆菌 Žtu菌株 ∀植物双价双
元表达载体为 ³…ŒŠ o由植物双元表达载体
³…¬±wv{ 构建而成 ∀农杆菌菌株选用 …„wwsw o
³…ŒŠ 双价双元表达载体构建好后采用直接转化
法转入 …„wwsw ∀³…ŒŠ 上含有双价基因 °·¯⁄Π
ª∏·⁄!双重增强的 vx≥启动子和 א ∂ / 80片段的翻
译增强子及 ‘°× p µ卡那霉素抗性标记基因k刘
俊君 ot||yl o其结构见图 t ∀
1 .2 植物材料
选用美洲黑杨 ≅青杨试管实生苗作为转基因植物材料 ∀
1 .3 转化及筛选
t qv qt 菌的活化 转化前一天晚上 o用接种环取保存在 ≠∞°固体培养基上的含有 °·¯⁄Πª∏·⁄双价基因
的 …„wwsw菌落少许 o接种到 ≠∞°液体培养基中 ou{ ε otxsµ#°¬±pt o过夜振荡培养 tu «o使农杆菌处于
旺盛对数生长期 ∀接种前 o取活化菌液 t °o以 vs倍 ≥液体培养基稀释备用 ∀
t qv qu 叶片不定芽诱导培养基及卡那霉素耐受浓度 通过实验 o选出美洲黑杨 ≅青杨叶片最佳不定芽
诱导培养基为 ≥ n y2…„ t °ª#pt n ‘„„s qsx °ª#pt o叶片不定芽诱导卡那霉素耐受浓度为 xs °ª#
pt ∀
t qv qv 不定芽生根培养基及卡那霉素耐受浓度 通过预实验 o选出美洲黑杨 ≅青杨不定芽生根培养基
为 tΠu≥ n ‘„„s qst °ª#pt o不定芽生根卡那霉素耐受浓度为 xs °ª#pt ∀
t qv qw 转化 !筛选 采取 ‹²µ¶¦«kt|{xl发明的叶盘法 ∀操作步骤如下所述 ∀取美洲黑杨 ≅青杨杂种叶
片若干片 o用手术刀在叶脉处横切划痕后放入 …„wwsw的 vs倍 ≥稀释液中 o浸泡 u ∗ v °¬±后取出 o放
入不含任何抗生素的芽诱导培养基 ≥ n y2…„ t °ª#pt n ‘„„s qsx °ª#pt中 ∀kux ? ul ε 暗室中共培养
v ∗ x §o待叶片与培养基接触处出现肉眼可见菌落时 o一部分叶片马上转入含有 xss °ª#pt羧苄青霉素
k用于杀死过量农杆菌l及 xs °ª#pt卡那霉素的芽诱导培养基中培养 ~另一部分叶片待 ut §左右 o叶片
切口出现芽点后 o转入以上培养基中培养 ∀每 ts §换一次培养基 ∀u个月后 o待转化芽长度达 t ¦°左
右 o转入加有卡那霉素 xs °ª#pt的生根培养基 ≥ n ‘„„s qst °ª#pt中继续培养 ∀t个月后 o选择生长
健壮的生根卡那霉素抗性植株作为初选转化植株 o将其扩繁后用于分子生物学检测及耐盐性测定 ∀
1 .4 卡那霉素抗性植株的分子生物学检测
t qw qt °≤• 检测 ktl美洲黑杨 ≅青杨杂种 ⁄‘„的提取 用 ∞§º¤µ§¶等kt||tl所述方法提取美洲黑杨
≅青杨 ⁄‘„ ∀kul阳性对照质粒 ⁄‘„提取 含有 °×⁄k其中含 °·¯⁄基因l及 °Š˜⁄k其中含有 ª∏·⁄基因l
阳性对照质粒的大肠杆菌 ⁄‹xΑ由中科院微生物所提供 o其质粒 ⁄‘„的提取采用 •¬½¤µ§ °¯∏¶≥∂ ¬±¬2
³µ¨³¶⁄‘„ °∏µ¬©¬¦¤·¬²± ≥¼¶·¨°试剂盒提取 ∀kvl°≤• 扩增及检测 引物由北京鼎国生物技术发展中心合
成 o其序列见刘俊君等kt||x¥l ∀°≤• 反应体系中 §‘×°¶!פ´ 酶 !反应缓冲液均购自北京鼎国生物技术
tv 第 y期 樊军锋等 }°·¯⁄Πª∏·⁄双价基因转化美洲黑杨 ≅ 青杨的研究
发展中心 o操作程序如下 ∀取样品及美洲黑杨 ≅青杨杂种阳性对照 ⁄‘„各 w ˏo加入放有 u qx ˏ反应
缓冲液 !s qx ˏ§‘×°¶!s qux ˏvχ引物和 s qux ˏxχ引物的微量离心管中 o再加入 tz ˏ双蒸水及 s qx ˏ
פª酶ku˜#ˏptl o使反应液总体积达 ux ˏ∀反应条件为每循环 |w ε 变性 vs¶oxx ε 退火 vs¶ozu ε 延伸
wx¶o共 vx个循环 ∀反应前可预变性 u °¬±o反应结束后延伸加时 x °¬±∀反应结束后取反应混合液 x ˏo
放在 s1{ h的琼脂糖凝胶上电泳 o电泳电压为 v ∗ x ∂#¦°pt ∀凝胶经 ∞…染色后 o用自动成像系统检查
°≤• 电泳结果 o并拍照 ∀
t qw qu ≥²∏·«¨µ±杂交k∞≤法l ktl膜板质粒 ⁄‘„制备 采用 •¬½¤µ§°¯∏¶≥∂ ¬±¬³µ¨³¶⁄‘„ °∏µ¬©¬¦¤·¬²±
¶¼¶·¨°从大肠杆菌 ⁄‹xΑ中提取含有 °·¯⁄或ª∏·⁄基因的 Ž≥质粒 ∀质粒的 ⁄‘„的酶切用 ‹¬±§¶和 ∞¦²•
´ ∀酶解 ⁄‘„片段用 s q{ h的琼脂糖凝胶电泳分离 o长波紫外光下切割含有目的片段的凝胶 ∀目的片
段的纯化采用北京鼎国生物技术发展中心生产的 ⁄‘„快速纯化Π回收试剂盒 ∀kul探针标记k∞≤法l
用 „°¨ µ¶«¤° Œƒ∞ ≥≤Œ∞‘≤∞公司生产的§¬µ¨¦·±∏¦¯¨ ¬¦¤¦¬§ ¤¯¥¨ ¬¯±ª¤±§§¨·¨¦·¬²±¶¼¶·¨°¶标记探针 ∀kvl样品
⁄‘„酶切及电泳 美洲黑杨 ≅青杨样品 ⁄‘„的酶切同质粒的 ⁄‘„的酶切 o所用酶为 ‹¬±§¶和 ∞¦²• ´ ∀
电泳用 s q{ h 琼脂糖凝胶电泳 ∀kwl转膜 !杂交及洗膜 !信号产生及检测 使用 „°¨ µ¶«¤° Œƒ∞ ≥≤Œ∞‘≤∞
公司生产的 §¬µ¨¦·±∏¦¯ ¬¨¦¤¦¬§ ¤¯¥¨ ¬¯±ª¤±§§¨·¨¦·¬²±¶¼¶·¨°¶开展转膜 !杂交及检测 ∀
t qw qv • ¶¨·¨µ±杂交 ktl阳性对照蛋白的提取 将含 °·¯⁄ !ª∏·⁄基因的重组阳性菌种 ⁄‹xΑ接种于…
液体培养基中 ovz ε 过夜培养 ts ∗ tu «∀次日取 t °菌液溶于 tss °…中 ovz ε 继续培养 u ∗ v «至
’⁄yss € s qx ∀升温至 wu ε 培养 v ∗ w «o将菌体分装于 t qx ° ³¨³¨ ±§²µ©管中 o离心收获菌体 ∀菌体蛋白的
提取采用常规大肠杆菌蛋白提取方法 ∀kul样品可溶性蛋白提取 采用常规植物可溶性蛋白方法提取
美洲黑杨 ≅青杨可溶性蛋白 ∀kvl蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白质采用 ×µ¬¶2甘氨酸体系的聚丙烯
酰胺凝胶电泳进行分离 ∀分离胶浓度为 ts h o层积胶浓度为 x h ∀kwl蛋白质的转膜 使用 …¬²2•¤§半
干电泳转移体系 o转膜电流 uxs °„ ∀kxl免疫反应 °·¯⁄!ª∏·⁄的第一抗体k兔抗l由中国科学院微生物
所提供 o磷酸脂酶标记的第二抗体购自 °µ²°¨ ¤ª¤公司 ∀其余操作同一般 • ¶¨·¨µ±杂交 ∀
115 转基因植株抗盐性测定
取 °≤• 检测呈阳性的美洲黑杨 ≅青杨杂种卡那霉素抗性植株及未转基因植株各 ts株 o放在加有 x
种不同 ‘¤≤¯ 浓度的生根培养基中培养 ∀u个月后根据不同浓度下植株存活率 o判别其是否具有抗盐能
力和抗盐能力大小 ∀
u 结果与分析
2 .1 转化及筛选
共设计了 v个处理 o转化叶片 uyt片 o结果见表 t ∀从表 t知 o对照叶片美洲黑杨 ≅青杨杂种放在不
含卡那霉素的不定芽诱导及生根培养基上 o叶片分化率及不定芽生根率分别达 tss h 和 |u h o平均每片
叶产生生根不定芽 |个 o说明美洲黑杨 ≅青杨杂种叶片再生系统再生效率较高 ∀接菌叶片在含卡那霉
素的培养基上培养筛选 o叶片分化率及不定芽生根率分别为 y{ qt h 和 t| qy h o平均每片叶仅产生生根
抗性植株 s qu个 o说明抗生素卡那霉素对转化美洲黑杨 ≅青杨杂种选择作用效果非常显著 o抑制或杀死
了大量非转化不定芽 o避免了大量非转化植株的产生 o减少了后继 °≤• 检测工作量 ∀从表 t还知 o卡那
霉素加入时间对转化作用影响很大 ∀共培养后 o若马上加入卡那霉素k转化 tl o因转化细胞内 ‘°×2ŒŒ基
因表达量有限 o细胞很难在含有高浓度的卡那霉素培养基上存活并诱导成芽 o导致转化失败 ∀共培养
ut §k转化 ul叶切口出现愈伤及芽点后 o加入卡那霉素 o虽增加了部分假转化植株出现频率 o但却获得了
一定数量的卡那霉素抗性不定芽 o为后继进一步筛选提供了可能 ∀
2 .2 ΠΧΡ 产物的琼脂糖凝胶电泳检测
用 °·¯§基因 k大小 ot txs¥l引物 o对所得 v{株卡那霉素抗性植株均作了 °≤• 检测 o其中 u{株呈阳
性 ∀y株卡那霉素抗性植株 °≤• 结果见图 u o其余 vu株卡那霉素抗性植株 °≤• 检测图略 ∀
uv 林 业 科 学 v{卷
表 1 美洲黑杨 ≅青杨杂种转化实验结果
Ταβ .1 Τηε ρεσυλτ οφτρανσφορµατιον οφ µτλ∆Πγυτ∆ διϖαλεντ γενεστο Ποπυλυσ δελτοιδσ ≅ Π. χατηαψανα
处理
×µ¨¤·°¨ ±·
叶片数
‘∏°¥¨µ
²©¯¨ ¤©
共培养后卡那
霉素加入时间
⁄¤¼¶©²µ¤§§¬±ª
®¤±¤°¼¦¬±r§
分化叶片数
‘∏°¥¨µ²©
§¬©©¨µ¨±·¬¤·¨§
¯¨ ¤©§¬¶¦
叶片分化率
°¨ µ¦¨±·¤ª¨ ²©
§¬©©¨µ¨±·¬¤·¨§
¯¨ ¤©§¬¶¦Πh
不定芽数
‘∏°¥¨µ²©
¬±§∏¦¨§
¶«²²·¶
每个叶片
平均产生
不定芽数
„√¨ µ¤ª¨ ¶«²²·¶
³¨µ§¬¶¦
生根不
定芽数
‘∏°¥¨µ
²©µ²²·¨§
¶«²²·¶
不定芽
生根率
°¨ µ¦¨±·¤ª¨
²©¬±§∏¦¨§
µ²²·Πh
每个叶片平均
产生生根
不定芽数
„√¨ µ¤ª¨ µ²²·¨§
¶«²²·¶³¨µ§¬¶¦
对照 ≤²±·µ²¯ ts p ts tss |{ | q{ |s |u |
转化 t ×µ¤±¶ª¨ ±¬¦t x| t s s s s s s s
转化 u ×µ¤±¶ª¨ ±¬¦u usu ut txs y{ qt t|w s q|y v{ t| qy s qu
图 u y株卡那霉素抗性植株 °≤• 扩增产物电泳结果
ƒ¬ªqu °≤• ¤±¤¯¼¶¬¶²©y ®¤±¤°¼¶¬±2µ¨¶¬¶·¤±·µ²²·¨§¶«²²·¶
}t ®¥标准物 t ®¥¤§§¨µ~≤Žp }阴性对照 ‘¨ª¤·¬√¨ ¦²±·µ²¯ ~≤Žn }阳性对照k°·¯⁄ ot txs ¥l
°²¶¬·¬√¨¦²±·µ²¯k°·¯⁄ ot txs ¥l ~• t ∗ • y }卡那霉素抗性植株 Ž¤±¤°¼¶¬±2µ¨¶¬¶·¤±·µ²²·¨§¶«²²·¶q
从图 u知 o• t !• u !• v
• w !• y均出现一条与阳性
对照 ≤Žn k°·¯⁄基因 o大
小约 t txs¥l大小一致的
条带 o初步说明 °·¯⁄基因
转入 • t !• u !• v !• w !• y
植株中 ∀在双价基因构建
中 oª∏·⁄与 °·¯⁄基因连在
一起 o°·¯⁄的转化成功 o
说明 ª∏·⁄Π°·¯⁄双价基因
转化成功 ∀ x 条阳性带
中 o• v !• w ! • y条带很亮 o
• t !• u条带较暗 ∀其条带
明暗不同可能是由于样品 ⁄‘„提取浓度不同或 °≤• 扩增时反应体系中各组分加样不匀造成 ∀
由于植物基因组很复杂 o其上可能含有拟转化目的基因的同源序列或相近序列 ∀同源序列或相近
序列的存在可导致 °≤• 扩增出现假阳性 o故 °≤• 结果呈阳性并不能完全证明耐盐基因转化已获成功 ∀
为进一步证明耐盐基因已转化成功 o需继续作 ≥²∏·«¨µ±或 • ¶¨·¨µ±杂交测定 ∀
2 .3 Σουτηερν杂交
图 v x株 °≤• 阳性植株 ≥²∏·«¨µ± ¥¯²·结果
ƒ¬ªqv ׫¨ µ¨¶∏¯·²©≥²∏·«¨µ± ¥¯²·©²µ°≤• ³²¶¬·¬√¨ ¶«²²·¶
≤Žn }阳性对照kª∏·⁄o{{s¥l °²¶¬·¬√¨ ¦²±·µ²¯ kª∏·⁄o{{s¥l ~
≤Žp }阴性对照k未转基因植株l ‘¨ª¤·¬√¨ ¦²±·µ²¯ k±²±2·µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·¶l ~
• t ∗ • w !• y }°≤• 阳性植株 °≤• ³²¶¬·¬√¨³¯¤±·¶q
选取 °≤• 阳性植株 • t !• u !• v !
• w ! • y 及阴性对照植株 o提取其
⁄‘„ o∞¦²• ´与 ‹¬±§¶ 双酶切后 o用
ª∏·⁄基因k大小 o{{s¥l标记探针开展
≥²∏·«¨µ± 杂交 o结果见图 v ∀从图 v
知 o阴性对照未出现任何条带 o阳性
对照出现了一条很明显的杂交条带 ∀
• t !• u !• v !• w除在阳性对照同一位
置出现很明显杂交带外 o还在带的前
方出现了 t条以上的杂交条带 o说明
ª∏·⁄基因成功整合到杨树 • t !• u !
• v !• w 基因组中 o且拷贝数大于 t ∀
在双价基因构建中 oª∏·⁄与 °·¯⁄基因
连在一起 oª∏·⁄基因的转化成功 o说
明 ª∏·⁄Π°·¯⁄双价基因转化成功 ∀ • y未出现任何条带 o说明 ª∏·⁄基因未转化到该植株中 o其 °≤• 阳性
为假阳性 ∀
vv 第 y期 樊军锋等 }°·¯⁄Πª∏·⁄双价基因转化美洲黑杨 ≅ 青杨的研究
2 .4 Ωεστερν杂交
图 w w株 ≥²∏·«¨µ±杂交阳性植株 • ¶¨·¨µ±杂交图
ƒ¬ªqw ׫¨ µ¨¶∏¯·²© • ¶¨·¨µ± ¥¯²·©²µ≥²∏·«¨µ± ¥¯²·³²¶¬·¬√¨ ³¯¤±·¶
≤Žn }阳性对照k°·¯⁄蛋白l °²¶¬·¬√¨¦²±·µ²¯ k°·¯⁄ ³µ²·¨¬±l ~
≤Žp }阴性对照k未转基因植株l ‘¨ª¤·¬√¨ ¦²±·µ²¯ k±²±2·µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·¶l ~
• t ∗ • w }°≤• 阳性植株 ≥²∏·«¨µ± ¥¯²·³²¶¬·¬√¨³¯¤±·¶q
提取 ≥²∏·«¨µ±杂交阳性的 • t !• u !• v !• w
植株蛋白质和阳性菌种 ⁄‹xΑ菌体k含 ª∏·⁄或
°·¯⁄重组阳性质粒l蛋白 o开展 • ¶¨·¨µ± …¯²·∀
本实验选择含有重组 °·¯⁄阳性质粒的 ⁄‹xΑ
菌体蛋白作为阳性对照 o实验结果见图 w ∀从
图 w知 o≥²∏·«¨µ±杂交阳性植株 • t !• u !• v !• w
及阴性对照均在与阳性对照k°·¯⁄蛋白l相同
位置出现一条条带 ∀阴性对照杂交条带的出
现 o说明美洲黑杨 ≅青杨体内可能天然存在有
°·¯⁄kt p磷酸甘露醇脱氢酶l基因编码翻译的
内源 t p磷酸甘露醇脱氢酶 ∀内源 t p磷酸甘
露醇脱氢酶的存在 o增加了 • ¶¨·¨µ±分析的难
度 ∀在此情况下 o判别转化基因是否表达最精
确的方法是通过测定转基因植株和未转基因植株体内所转基因表达产物多少来确定 ∀当然 o• ¶¨·¨µ±杂
交实验中 o其杂交条带大小也能说明一定问题 ∀杂交条带大 o颜色深 o基因表达产物多 ∀本实验中 o• w !
• v !• u !• t植株k特别是 • w !• v植株l杂交条带较阴性对照大 o颜色深 o说明这 w株转基因植株所转 °·¯⁄
基因进行了成功表达 o产生了比正常未转基因植株内源含量更多的 t p磷酸甘露醇脱氢酶 ∀
2 .5 Σουτηερν杂交阳性植株耐盐性测定
表 2 阳性卡那霉素抗性植株抗盐性测定结果 ≠
Ταβ .2 Τηε ρεσυλτ οφσαλτ2ρεσισταντ τεστ φορ σουτηερν βλοττινγ ποσιτιϖεσηοοτσ
实验材料
°¯ ¤±·°¤·¨µ¬¤¯¶
‘¤≤¯ 浓度 ‘¤≤¯ ¦²±¦¨±·µ¤·¬²±r h
s k对照 ≤²±·µ²¯l s qu s qw s qy s q{
存活率 ≥∏µ√¬√¤¯ µ¤·¨r h
• s k阴性l ≤²±·µ²¯ k±²±2·µ¤±¶ª¨ ±¬¦l tss zs s s s
• tk阳性l k≥²∏·«¨µ± ¥¯²·³²¶¬·¬√¨ l tss |s xs s s
• uk阳性l k≥²∏·«¨µ± ¥¯²·³²¶¬·¬√¨ l tss tss zs ws s
• vk阳性l k≥²∏·«¨µ± ¥¯²·³²¶¬·¬√¨ l tss tss {s zs s
• wk阳性l k≥²∏·«¨µ± ¥¯²·³²¶¬·¬√¨ l tss tss zs ys s
≠ 表中数据为 u个月时统计结果 ∀ ׫¨ §¤·¤¬±·«¨ ·¤¥¯¨²¥·¤¬±¨ §¤©·¨µu °²±·«¶ ¬¨³¨µ¬° ±¨·q
取 ≥²∏·«¨µ± 杂交阳性植株 • t !
• u !• v !• w 和未转化的阴性对照植
株 • s各 ts株 o开展转基因植株抗盐
性实验 o结果见表 u ∀从表 u知 o对
照 • s抗 ‘¤≤¯ 最高浓度为 s qu h ∀在
s1u h ‘¤≤¯ 浓度下 ou个月时存活率
为 zs h o‘¤≤¯ 浓度高于 s qu h o存活
率为 s ∀w株 °≤• 阳性植株中 o• v !
• w抗 ‘¤≤¯ 能力最强 o在 s1y h ‘¤≤¯
浓度下 ou个月时存活率分别为 zs h
和 ys h ∀ • u 抗 ‘¤≤¯ 能力中等 o在
s1y h ‘¤≤¯ 浓度下 ou个月时存活率
为 ws h ∀ • t抗 ‘¤≤¯ 能力较差 o在 s qy h ‘¤≤¯ 浓度下 ou个月时存活率为 s ~在 s qw h ‘¤≤¯ 浓度下 ou个月
时存活率为 xs h ∀经分子生物学检测呈阳性的 • t !• u ! • v !• w w株植株抗 ‘¤≤¯ 能力均高于对照的事实
说明 o°·¯⁄Πª∏·⁄双价耐盐基因不仅整合到杨树基因组中 !翻译表达产生了相应的酶 o而且通过酶的作
用 o将部分糖类物质转化成了糖醇类物质 o糖醇类物质含量的增加 o促进了杨树耐盐性的提高 ∀转基因
植株抗盐效果 o见图 x ∀
v 结论与讨论
通过叶盘法 o开展 °·¯⁄Πª∏·⁄双价基因转化美洲黑杨 ≅青杨的研究 o获得卡那霉素生根抗性植株 v{
株 ∀抗性植株经 °≤• 检测 o有 u{株呈阳性 ∀对其中 x株 °≤• 阳性植株进行 ≥²∏·«¨µ±及 • ¶¨·¨µ±杂交 ow
株二者均呈阳性 o证明 °·¯⁄Πª∏·⁄双价基因成功整合到杨树染色体组中并得到表达 ∀耐盐实验表明这 w
株转基因植株抗 ‘¤≤¯ 能力比对照均有不同程度提高 ∀
≥²∏·«¨µ±杂交中 ow株转基因植株除在与阳性对照相同位置出现一条条带外 o还在该带的前方出现
wv 林 业 科 学 v{卷
了几条短的条带 ∀说明 °·¯⁄Πª∏·⁄双价基因以多拷贝形式整合到美洲黑杨 ≅ 青杨基因组中 ∀尽管从理
论上讲 o外源基因插入转基因植物基因组的拷贝数是随机的 o即可多可少 o但众多的转化实验表明 o基因
转化多以单拷贝数插入 o且遗传稳定性好k王关林等 ot||{l ∀本实验外源基因以多拷贝插入 o其遗传稳
定性及遗传效应如何 o有待观察 ∀
图 x 转基因植株与未转基因植株抗盐性比较
ƒ¬ªqx ≤²°³¤µ¬¶²± ²©¶¤¯··²¯ µ¨¤±¦¨ ¤¥¬¯¬·¼©²µ·µ¤±¶ª¨±¬¦
¤±§±²±2·µ¤±¶ª¨±¬¦³¯¤±·¶
左培养杯中植株为转基因植株 o在培养基中 s qw h 盐浓度
下 ou 个月时 o基本生长正常 ∀ ×µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·¬± ¯¨©·¦∏³o
ªµ²º¬±ª¤¶±²µ°¤¯ º«¨ ± u °²±·«¶²¯§¬±·«¨ ° §¨¬∏° º¬·«s qw h
‘¤≤¯ ¦²±¦¨±·µ¤·¬²±q右培养杯中植株为未转基因植株 o在培
养基中 s qw h 盐浓度下 ou个月时 o已完全死亡 ∀ ‘²±2·µ¤±¶2
ª¨ ±¬¦³¯¤±·¬±µ¬ª«·¦∏³o¦²°³¯ ·¨¯¨¼ §¨¤§º«¨ ± u °²±·«¶²¯§¬±
·«¨ °¨ §¬∏° º¬·«s qw h ‘¤≤¯¦²±¦¨±·µ¤·¬²±q
外源基因随机整合到植物基因组后 o由于插入位点
不同 o会产生位置效应 !共抑制效应 !重排效应等遗传效
应 ∀本实验 w株杨树转基因植株抗盐性均高于对照的事
实说明 o所转基因进行了表达 o并未发生共抑制效应 ∀w
株转基因植株之间抗 ‘¤≤¯ 能力的差异可能由于位置效
应k插入染色体位点不同l及插入拷贝数多少不一造成 ∀
°·¯⁄Πª∏·⁄双价基因转入美洲黑杨 ≅ 青杨后 o若体内
存在与转基因烟草相同的甘露醇 !山梨醇代谢途径k刘俊
君等 ot||x¤l o则在 °·¯⁄Πª∏·⁄作用下 o转基因杨树体内应
该有甘露醇和山梨醇的产生 ∀今后应完成转基因植株体
内糖醇含量测定 o并研究糖醇含量与转基因植株抗盐性
大小之间的数量关系 ∀
本实验将 °·¯⁄Πª∏·⁄双价基因转入美洲黑杨 ≅ 青杨 o
转化植株耐盐性比对照有一定程度提高 o但提高幅度有
限 ∀说明植物耐盐机理很复杂 o控制耐盐性状的基因很
多 ∀今后应加强植物耐盐机理研究 o克隆 !构建更好的耐
盐主效基因及微效复合基因 o提高转基因植株耐盐效果 ∀
参 考 文 献
荆家海 o高俊凤 o王姝清等 q植物生理学 q西安 }陕西科学技术出版社 ot||w ovtz ∗ vt{
刘俊君 o黄绍兴 o彭学贤等 q高度耐盐双价转基因烟草的研究 q生物工程学报 ot||x¤ottkwl }v{t ∗ v{w
刘俊君 o彭学贤 o王海云等 q大肠杆菌 °·¯⁄基因和 ª∏·⁄基因的克隆 !全系列测定和高效表达 q生物工程学报 ot||x¥ottkul }txz ∗ tyt
刘俊君 o彭学贤 o王海云等 q转基因烟草的甘露醇合成和耐盐性 q生物工程学报 ot||y otukul }usy ∗ uts
王关林 o方宏筠 q植物基因工程原理与技术 q北京 }科学出版社 ot||{ owys ∗ wzw
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xv 第 y期 樊军锋等 }°·¯⁄Πª∏·⁄双价基因转化美洲黑杨 ≅ 青杨的研究