全 文 ：第 wv卷 第 v期
u s s z年 v 月
林 业 科 学
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¤µqou s s z
不同因素对农杆菌介导的杉木转化效率的影响 3
席梦利 施季森
k南京林业大学 国家林业局林木遗传和基因工程重点实验室 南京 utssvzl
摘 要 } 以杉木试管苗靠近茎尖的茎段为受体材料 o研究 y个影响杉木遗传转化效果的因素 o初步确定杉木茎段
较为合适的转化体系为 }预培养 t ∗ v §o’⁄yss ±°为 s1t ∗ s1w的菌液浸染 ts ∗ tx °¬±o共培养 v ∗ x §o共培养基附加乙
酰丁香酮k„≥l {s Λ°²¯#pt o共培养后延迟 v §筛选 ∀在初次筛选培养基上共得到 t{y个卡那霉素kŽ°l抗性芽 o在
二次筛选培养基上获得 v|个 Ž°抗性芽 ∀ °≤• 检测有 u个 Ž°抗性芽呈稳定阳性 o初步证明外源天麻抗真菌蛋白
kŠ„ƒ°l基因已整合到这 u个 Ž°抗性芽的基因组 ⁄‘„中 ∀
关键词 } 杉木 ~农杆菌介导 ~天麻抗真菌蛋白基因
中图分类号 }≥zt{1wy ~ ±|wv1u 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kusszlsv p sswy p sx
收稿日期 }ussy p st p ts ∀
基金项目 }国家自然科学基金项目kvstzszwxl和江苏省高校省级重点实验室开放课题kŽ≥svsvxl资助 ∀
3 施季森为通讯作者 ∀
Αν Ασσεσσµεντ οφ ΦαχτορσΙνφλυενχινγ τηε Εφφιχιενχψ οφ Τρανσφορµατιον οφ
Χυννινγηαµιαλανχεολατα Μεδιατεδ βψ Αγροβαχτεριυµ τυµεφαχιενσ
÷¬ ±¨ª¯¬ ≥«¬¬¶¨±
k ΚεψΛαβορατορψοφ Φορεστ Τρεε Γενετιχσ ανδ Γενε Ενγινεερινγ oΣτατε Φορεστρψ Αδµινιστρατιον Νανϕινγ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Νανϕινγ utssvzl
Αβστραχτ } ˜¶¬±ª³¯¤±·¯¨·¶«²²·¶¨¦·¬²±¶±¨ ¤µ·«¨ ¶«²²··¬³¤¶ ¬¨³¯¤±·¶o¤©·¨µ¶·∏§¼¬±ª·«¨ ¶¬¬©¤¦·²µ¶·²¤©©¨¦··µ¤±¶©²µ°¤·¬²±oº¨
«¤√¨ ³µ¨ ¬¯°¬±¤µ¬¯¼ §¨·¨µ°¬±¨ §¤± ©¨©¨¦·¬√¨ ¶¼¶·¨° ©²µª¨ ±¨·¬¦·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±q ׫¨ ³µ²·²¦²¯ º¤¶}t ∗ v §¤¼¶©²µ³µ¨2¦∏¯·∏µ¨ o
’⁄yss ±° € s1t ∗ s1w ots ∗ tx °¬±∏·¨¶©²µ¬±©¨¦·¬²±ov ∗ x §¤¼¶©²µ¦²2¦∏¯·∏µ¨ o¤±§¤¦¨·²¶¼µ¬±ª²±¨ k„≥l {s Λ°²¯#pt ¤¶¦²2
¦∏¯·∏µ¨ °¨ §¬∏°o¤±§·«¨ ± ¤¯¶·¬±ªv §¤¼¶¥¨©²µ¨ ¶¨¯¨ ¦·¬±ªq „±§·«¨ ± t{y µ¨ª¨ ±¨ µ¤·¨§®¤±¤°¼¦¬±kŽ°l 2µ¨¶¬¶·¤±·¥∏§¶ º¨ µ¨
²¥·¤¬±¨ §©µ²°·«¨ ©¬µ¶·¶¨¯¨ ¦·¬²± °¨ §¬∏°qv| Ž° 2µ¨¶¬¶·¤±·¥∏§¶º¨ µ¨ ²¥·¤¬±¨ §©µ²°·«¨ ¶¨¦²±§¶¨¯¨ ¦·¬²± °¨ §¬∏°q°≤• ¤±¤¯¼¶¬¶
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kŠ„ƒ°l ª¨ ±¨ º¤¶¬±·¨ªµ¤·¨§¬±·²·«¨ ª¨±²°¨ ²©·«¨ ·º² Ž°2µ¨¶¬¶·¤±·¥∏§¶q
Κεψ ωορδσ} Χυννινγηαµιαλανχεολατα~ Αγροβαχτεριυµ τυµεφαχιενσ °¨ §¬¤·¨§·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±~ª¤¶·µ²§¬¤¤±·¬©∏±ª¤¯ ³µ²·¨¬± ª¨ ±¨
针叶树种生长周期长 !树体高大 o而且由于长期异交 o具有高度的杂合性和大量的遗传负荷k王明庥 o
usstl o因此传统育种周期长 o难以适应速生树木遗传改良的需要 ∀植物遗传转化技术在多种植物品种改良
中的成功应用 o为有效地将具有特殊性状的基因引入有价值的针叶树种提供了机会 o为培育针叶树新品种开
辟了一条经济而有效的途径 ∀针叶树种由于组织培养困难 o因而缺乏好的再生系统 o加之对抗生素比较敏
感 o在加选择压的培养基上难以分化等问题 o都增加了遗传转化的难度 ∀针叶树种遗传转化研究尚处于起步
阶段 ∀转化方法主要是农杆菌介导法和基因枪法 ∀目前 o农杆菌介导法已在欧洲落叶松k Λαριξ δεχιδυαl
k‹∏¤±ª ετ αλqot||t ~≥«¬± ετ αλqot||wl !日本落叶松与欧洲落叶松杂种kΛαριξ καεµπφερι ≅ Λq δεχιδυαlk¨√¨ ¨
ετ αλqot||zl !挪威云杉k Πιχεα αβιεσl k • ±¨¦® ετ αλqot|||l !火炬松k Πινυσ ταεδαl kפ±ª ετ αλqousst ~ Š²∏¯§ ετ
αλqoussu ~פ±ªoussvl等针叶树种转化中取得成功 o用基因枪法已获得白云杉k Πιχεα γλαυχαlk∞¯ ¬¯¶ ετ αλqo
t||vl !辐射松k Πινυσραδιαταlk • ¤¯·¨µ ετ αλqot||{ ~ …¬¶«²³2‹∏µ¯¨ ¼ ετ αλqousstl !挪威云杉k • ¤¯·¨µ ετ αλqot||| ~
…¬¶«²³2‹∏µ¯¨ ¼ ετ αλqousstl等针叶树种的转基因植株 ∀
杉木k Χυννινγηαµιαλανχεολαταl在我国分布广 o栽培历史悠久 ∀us世纪 zs年代起 o由于杉木林过于集中
连片 o生态环境恶化 o病害问题突出 ∀迄今为止 o被研究的杉木病害有 ts余种 o其中真菌性病害最为严重 o种
类较多 o占 zx h以上k俞新妥 ot||zl ∀因此 o开展杉木转天麻抗真菌蛋白基因研究 o为培育杉木抗病品种提供
材料 o有着非常重要的现实意义 ∀本文报道了以杉木试管苗靠近茎尖的茎段为受体材料进行的转基因研究 o
试验以根癌农杆菌kΑγροβαχτεριυµ τυµεφαχιενσl∞‹„tsx为载体 o系统研究了预培养时间 !浸染时间 !共培养时
间 o共培养基中添加乙酰丁香酮k„≥l的浓度等因素对杉木转基因的影响 o旨在建立杉木的遗传转化体系 ∀
t 材料与方法
111 试验材料
t1t1t 植物材料 以福建种源的杉木试管苗为试验材料 ∀
t1t1u 质粒和菌株 天麻抗真菌蛋白kŠ„ƒ°l基因的表达载体 ³…¬±vx≥Š„ƒ°由中国科学院遗传与发育生物
学研究所孙勇如研究员提供 ∀
t1t1v °≤• 扩增引物 tlxχ2„≤Š ×≤× „Š„ „ŠŠ Š„× ≤ŠŠ ×׊ „„×2vχ ~ulxχ2Š„× ≤×≤ Š„Š Š≤≤ „Š„ „Š≤
≤Š≤ ≤Š≤ ׊×2vχ ∀
t1t1w 培养基 农杆菌培养基 }≠∞…培养基 ~茎段诱导培养基 }⁄≤• n y2…„ t1s °ª#pt n ×⁄ s1sst °ª#pt
n ‘„„ s1t °ª#pt ~初次筛选培养基 }⁄≤• n y2…„ t1s °ª#pt n ×⁄ s1sst °ª#pt n ‘„„ s1t °ª#pt n ≤ ©¨
uss °ª#pt n Ž° x °ª#pt ~二次筛选培养基 }⁄≤• n ≤ ©¨uss °ª#pt n Ž° ws °ª#pt ~生根培养基 }tΠw≥ n
Œ…„ s1u °ª#pt n ‘„„ s1t °ª#pt ∀以上培养基含有蔗糖 u h o琼脂粉 s1y h o³‹x1{ ∀
112 试验方法
t1u1t 杉木茎段遗传转化方法 以根癌农杆菌 ∞‹„ tsx介导进行杉木茎段转化 ∀tl预培养 }继代培养 t个
月的杉木试管苗 o选取生理状态良好的茎尖 o轻轻剥去针叶 o切取靠近茎尖的长约 s1x ¦°的茎段 o在用农杆
菌浸染之前先置于诱导培养基上预培养 ∀ul正 !负对照的设置 }杉木茎段在不经过农杆菌浸染 !也无卡那霉
素kŽ°l等选择压力时 o在诱导培养基上是完全能分化出芽的 o称之为正对照 ~而相应的负对照则是指未浸
染的茎段在一定的选择压力下完全不能分化出正常芽 ∀每次遗传转化时都必须设置相应的正 !负对照 ∀vl
农杆菌的活化及浸染菌液的制备 }挑农杆菌单菌落 o接种于 x °≠∞… n Ž° ux °ª#pt的液体培养基中 o
uz ε ouus µ#°¬±pt振荡培养过夜 ∀取 s1x °菌液转接入 ux °≠∞…n Ž° ux °ª#pt的液体培养基中扩大培
养 o培养至一定浓度k进入对数生长期l o测定菌液 yss ±°波长 ’⁄值 ∀x sss µ#°¬±pt离心 ts °¬±收集菌体 o
取适当液体诱导培养基悬浮菌体并稀释到浸染所需的浓度 ∀wl浸染和共培养 }将预培养后的茎段 o浸入制备
的浸染菌液 o轻微振荡 o浸泡一定时间 o取出茎段后在无菌滤纸上吸去多余菌液 o然后再放回诱导培养基上进
行共培养 ∀黑暗条件下共培养一定时间后 o转接到初次筛选培养基上培养 ∀xl筛选培养 }茎段转接到初次筛
选培养基上培养约 us §o待少数茎段开始长芽时转入二次筛选培养基 ∀在二次筛选培养基上 ux §继代 t次 ∀
t1u1u 影响杉木遗传转化效率的因素 杉木转化的基本条件 }预培养 u §o浸染菌液浓度为 ’⁄yss ±° € s1u o浸
染 ts °¬±o共培养 w §o共培养基添加 „≥ {s Λ°²¯#pt o³‹x1{ o共培养后延迟 v §转入初次筛选培养基 ∀
预培养时间 }茎段浸染前 o分别预培养 s !t !u !v !w !x !y §o其他条件同转化的基本条件 ∀
浸染菌液浓度 }菌液 yss ±°波长 ’⁄值分别为 s1t !s1u !s1v !s1w !s1x !s1y o其他条件同转化的基本条件 ∀
浸染时间 }浸染时间分为 x !ts !tx !us !ux °¬±o其他条件同转化的基本条件 ∀
共培养时间 }浸染茎段分别共培养 t !u !v !w !x !y !z §o其他条件同转化的基本条件 ∀
共培养基中 „≥浓度 }在共培养基中分别添加 „≥ s !ws !{s !tys !vus Λ°²¯#pt o共培养基 ³‹x1w o其他条件
同转化的基本条件 ∀
Ž°添加的时机 }Ž°分 u个时间加入 o共培养后直接转入初次筛选培养基 o共培养后延迟 v §再转入初
次筛选培养基 o其他条件同转化的基本条件 ∀
衡量转化效率的指标 }以茎段转接入初次筛选培养基 us §后的 Ž°抗性芽分化频率为指标 ∀分化频率
k h l €分化 Ž°抗性芽的茎段数Π转化的茎段数 ≅ tss h ∀
t1u1v 分步筛选培养和 Ž°抗性芽的获得 采用分步筛选 o逐步提高选择压力 ∀因为杉木对 Ž°非常敏感 o
如果开始选择时就加入较高浓度的 Ž°o很难得到芽 o在开始筛选时加入较低的选择压 o以确保有少量芽的发
生 o随后加大选择压 o淘汰假阳性芽 ∀在二次筛选培养基上继代 u次的芽 o被初步认定为 Ž°抗性芽 ∀
t1u1w Ž°抗性芽的 °≤• 检测 Ž°抗性芽的总 ⁄‘„提取 }采用少量 ⁄‘„提取方法k李丹等 ousssl ∀°≤• 反
应体系 }⁄‘„模板量 tss ±ªots ≅ ¥∏©©¨µu ˏoª≤¯ ukux °²¯#ptlu ˏo§‘×°ku °²¯#ptlu ˏo引物 t s1ux Λ°²¯
#pt o引物 u s1ux Λ°²¯#pt oפª⁄‘„聚合酶kx ˜#ˏptls1u ˏo无菌水 tt1{ ˏ∀°≤• 反应程序为 }|w ε 预
变性 x °¬±o|w ε 变性 vs¶oxx ε 复性 vs¶ozu ε 延伸 vs¶o进行 vs个循环后 zu ε 再延伸 z °¬±∀反应结束后 o
zw 第 v期 席梦利等 }不同因素对农杆菌介导的杉木转化效率的影响
进行 t h的琼脂糖凝胶电泳 o检测扩增结果 ∀
u 结果与分析
211 预培养时间对产生 Κµ 抗性芽的影响
比较了不同预培养时间对杉木转化中 Ž°抗性芽产生的影响 ∀试验结果k表 tl表明 }不进行预培养就浸
染茎段 o没有 Ž°抗性芽产生 ~预培养 t ∗ v §o正对照的分化频率为 tss h o负对照的分化频率为 s o随着预培
养时间的延长 oŽ°抗性芽产生的频率从 y1z h增加到 tu1x h ~预培养 w ∗ y §o正对照的分化频率从 |y1z h降
到 {y1z h o这是因为 o预培养使茎段愈伤组织大量生长 o影响了腋芽和不定芽的发生 o而负对照的分化频率
从 v1v h增加到 ty1z h oŽ°抗性芽产生的频率从 tw1u h增加到 ux h ∀石蜡切片观察表明 o预培养时间延长
到 w §时 o少数腋芽已开始脱分化成一团分生组织 o随着预培养时间的增加 o分生组织快速分裂 o到第 y天
时 o少数腋芽分生组织已发育成叶原基 ∀由于 Ž°的传递速度较慢 o较难扩散到分生组织团内部 o因此预培
养时间越长 o腋芽对 Ž°的抗性越强 o负对照的分化频率就越高 o假阳性的比例也越高 ∀综合考虑 Ž°抗性芽
产生的频率和可能出现假阳性的比例 o确定杉木预培养 t ∗ v §较为合适 ∀
表 1 不同因子对产生 Κµ 抗性芽的影响
Ταβ .1 Ινφλυενχε οφ διφφερεντ φαχτορσ ον ινδυχτιον Κµ2ρεσισταντ σηοοτ
供试因子
ƒ¤¦·²µ¶·¨¶·¨§
供试茎段数
‘∏°¥¨µ²©
¬¨³¯¤±·¶·¨¶·¨§
≤Žn的分化频率
ƒµ¨ ∏´¨ ±¦¼ ²©³µ²§∏¦¬±ª
¥∏§¶²© ≤ŽnΠh
≤Žp的分化频率
ƒµ¨ ∏´¨ ±¦¼ ²©³µ²§∏¦¬±ª
¥∏§¶²© ≤ŽpΠh
产生 Ž°抗性芽的频率
ƒµ¨ ∏´¨ ±¦¼ ²©³µ²§∏¦¬±ªŽ°2µ¨¶¬¶·¤±·
¥∏§¶²©¬±²¦∏¯¤·¨§ ¬¨³¯¤±·¶Πh
s t{s tss s s
t t{s tss s y1z
u t{s tss s {1v预培养时间
°µ¨2¦∏¯·∏µ¨
·¬°¨ Π§
v t{s tss s tu1x
w t{s |y1z v1v tw1u
x t{s |v1v y1z ty1z
y t{s {y1z ty1z ux
s1t t{s tss s z1x
s1u t{s tss s {1v菌液浓度
…¤¦·¨µ¬¤¯
¦²±¦¨±·µ¤·¬²±
k’⁄yss ±°l
s1v t{s tss s |1u
s1w t{s tss s z1x
s1x t{s tss s s
s1y t{s tss s s
x t{s tss s z1x
ts t{s tss s {1v浸染时间
Œ±©¨¦·¬²±
·¬° Π¨°¬±
tx t{s tss s z1x
us t{s tss s y1z
ux t{s tss s z1x
t t{s tss s s
u t{s tss s t1z
v t{s tss s w1u共培养时间
≤²2¦∏¯·∏µ¨
·¬°¨ Π§
w t{s tss s {1v
x t{s tss s ts1{
y t{s tss s tx1s
z t{s |v1v v1v us1s
s t{s tss s x1{
ws t{s tss s y1z„≥浓度
„≥ ¦²±¦¨±·µ¤·¬²±Π
kΛ°²¯#ptl
{s t{s tss s ts1{
tys t{s tss s {1v
vus t{s tss s z1x
延迟时间 s t{s tss s t1z
⁄¨ ¤¯¼¬±ª·¬° Π¨§ v t{s tss s {1v
212 浸染菌液的浓度对产生 Κµ 抗性芽的影响
∞‹„tsx菌液浓度 ’⁄yss ±°为 s1t ∗ s1w时 o茎段产生 Ž°抗性芽的频率变化不大 o这说明菌液浓度较低
时 o浓度的变化对转化效率影响不大 ∀当菌液浓度 ’⁄yss ±°为 s1x和 s1y时 o茎段没有产生 Ž°抗性芽 o这可
能是因为菌液浓度较高时 o容易对茎段产生毒害作用 o导致茎段在培养过程中褐化死亡 ∀这与 ‹∏°¤µ¤等
{w 林 业 科 学 wv卷
kt|||l的研究结果类似 ∀观察发现 o菌液浓度 ’⁄yss ±°高于 s1w时 o在筛选培养过程中很难将农杆菌完全脱
除 o农杆菌的迅速生长 o也会影响茎段产生 Ž°抗性芽 ∀
213 浸染时间对产生 Κµ 抗性芽的影响
试验结果k表 tl表明 o在杉木转化过程中 o浸染时间对转化效率影响不大 ∀观察发现 o浸染时间超过
tx °¬±o随着浸染时间的增加 o软腐的茎段明显增多 ∀在浸染过程中 o一般不发生 ×2⁄‘„的转移 o只是外植体
表面带菌 o加之农杆菌对植物细胞有毒害作用 o因此延长浸染时间并无益处 ∀
214 共培养时间对产生 Κµ 抗性芽的影响
农杆菌和植物共培养是整个转化过程中非常重要的环节 o因为农杆菌附着 o×2⁄‘„的转移及整合都在共
培养阶段完成k王关林等 oussul ∀从表 t可以看出 o随着共培养时间的延长 oŽ°抗性芽的获得频率明显增
加 o共培养时间为 t ∗ y §时 o≤Žp的分化频率并未提高 o仍为 s ∀这说明茎段产生 Ž°抗性芽频率的提高是转
化细胞增多的结果 o不是由于 Ž°筛选时间的推后而使假阳性比例增加 ∀共培养时间并不是越长越好 o试验
过程中观察发现 o共培养时间超过 u §o部分茎段周围就会出现微菌落 o共培养时间越长 o农杆菌长势越盛 ∀
共培养时间超过 x §o部分茎段的农杆菌在选择培养基中很难抑制 ∀综合分析后认为 o杉木茎段转化时的共
培养时间以 v ∗ x §为宜 ∀
215 共培养基中 ΑΣ浓度对产生 Κµ 抗性芽的影响
已有大量试验表明酚类化合物对 ∂¬µ区基因的活化具有重要作用 o其中最常用的 ∂¬µ区基因诱导物是
„≥ ∀在转化过程中添加 „≥常采用 v种方法 }第 t种是在浸染菌液中加 „≥ ~第 u种是在共培养基中加 „≥ ~
第 v种是在浸染菌液和共培养基中都加 „≥ ∀诸葛强等kussvl研究新疆杨k Ποπυλυσ αλβα √¤µq πψραµιδαλισl转基
因时发现 o共培养基中添加 „≥ oŽ°抗性芽的产生频率比对照高近 w倍 ~浸染菌液中加 „≥ oŽ°抗性芽的产生
频率稍高于对照 ~浸染菌液和共培养基中都加 „≥ oŽ°抗性芽的产生频率反而低于对照 ∀本研究只在共培
养基中添加 „≥ o共培养基 ³‹值为 x1w ∀结果k表 tl表明 o„≥浓度为 {s Λ°²¯#pt时 oŽ°抗性芽的产生频率比
对照有明显提高 ∀ „≥浓度为 tys !vus Λ°²¯#pt时 o茎段褐化速度加快 o这可能是 „≥对茎段产生了毒害作用 ∀
216 Κµ 添加的时机对产生 Κµ 抗性芽的影响
设计了 u个处理 }一种为共培养后直接转接入初次筛选培养基中开始筛选 ~另一种为共培养后先转接
到没有添加抗生素的诱导培养基上培养 v §o然后再接到初次筛选培养基上开始筛选 ∀结果k表 tl表明 }不
延迟筛选 o尽管筛选压力很低 oŽ°浓度仅为 x °ª#pt o但只有个别茎段分化芽 ~延迟 v §筛选 o产生 Ž°抗性
芽的频率明显提高 ∀
217 大量 Κµ 抗性芽的获得
通过以上试验 o可以初步确定杉木茎段较为合适的转化体系为 }预培养 t ∗ v §o’⁄yss ±° € s1t ∗ s1w菌液
浸染 ts ∗ tx °¬±o共培养 v ∗ x §o共培养基 ³‹值 x1w o附加 „≥ {s Λ°²¯#pt o共培养后延迟 v §筛选 ∀随后以
预培养 u §o’⁄yss ±° € s1u菌液浸染 ts °¬±o共培养 w §o共培养基 ³‹值 x1w o附加 „≥ {s Λ°²¯#pt o共培养后延
迟 v §筛选为转化条件 o对 t s{s个茎段进行转化试验 o包括在试转化条件时所转化的茎段 o先后对 w |us个
茎段进行浸染 o在初次筛选培养基上共获得 t{y个 Ž°抗性芽 ∀初次获得的 Ž°抗性芽在二次筛选培养基上
继代 u次 o在继代过程中大量芽白化 o最终仍保持绿色的芽被认定为 Ž°抗性芽 ∀共获得 v|个 Ž°抗性芽 ∀
218 Κµ 抗性芽的 ΠΧΡ 检测
提取 Ž°抗性芽的 ⁄‘„ o以转化植株 ⁄‘„为模板 o以未转化植株 ⁄‘„为阴性对照 o以质粒 ³…¬±vx≥Š„ƒ°
为阳性对照 o用人工合成的 Š„ƒ°基因的特异引物 o在 us ˏ反应体系中进行 °≤• 扩增 ∀结果k图 tl表明 o在
v|个抗性芽中 o扩增出与阳性对照一致的 ⁄‘„片段的只有 u个 Ž°抗性芽 o而未转基因的对照植株未扩增
出同样大小的片段 ∀初步证明外源 Š„ƒ°基因已整合到这 u个 Ž°抗性芽的基因组 ⁄‘„中 ∀
v 讨论
311 不同因素对转化效果的贡献
影响转化效果的因素很多 o本试验共研究了 y个影响转化效率的因素 }预培养时间 !共培养时间 !浸染菌
液的浓度 !浸染时间 !共培养基中 „≥浓度及 Ž°添加时机 ∀研究结果表明 }不同因素对转化效率的影响不
同 o其中预培养时间 !共培养时间对转化效率有明显的影响 ~共培养基中 „≥浓度及 Ž°添加时机对转化效
|w 第 v期 席梦利等 }不同因素对农杆菌介导的杉木转化效率的影响
图 t 转 Š„ƒ°基因 Ž°抗性芽的 °≤• 检测
ƒ¬ªqt °≤• ¤°³¯¬©¬¦¤·¬²± ²©Ž°2µ¨¶¬¶·¤±·
¥∏§¶²© Š„ƒ° ª¨ ±¨
 }tss ¥³ ¤¯§§¨µ~t ou }Ž°抗性芽 Ž°2µ¨¶¬¶·¤±·¥∏§¶~
≤Žn }质粒 °¯ ¤¶°¬§⁄‘„ ~≤Žp }未转化植株
‘²±2·µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·~ ‹u ’ }水 • ¤·¨µq
率有一定影响 ~而浸染菌液的浓度和浸染时间对转化效率几乎
没有影响 ∀这可能是因为 o预培养时间直接影响着外植体的生
理状态 o只有预培养一定时间的外植体才有更多细胞处于感受
态时期 o而共培养时间关系到有多少感受态细胞接受了外源 ×2
⁄‘„ o在农杆菌不会旺盛生长的前提条件下 o延长共培养时间 o
可明显提高转化效率 ∀
312 分步筛选策略的确定
选择转化体的方法有多种 o根据选择压加入的时间不同 o选
择的方法可分成 v种 }前期选择 !延迟选择和后期选择k王关林
等 oussul ∀前期选择是共培养后立即加选择压 o这种方法适于
不定芽再生很快的植物 o例如林木中的部分杨树品种 ∀延迟选
择是共培养一定时间后再加选择压 o后期选择是先再生出不定芽 o然后再选择 o这 u种方法多用于再生较慢
的植物 ∀
杉木属于再生较慢的树种 o确定筛选方法的原则是在能够得到芽的前提下尽可能加大选择压 ∀杉木对
Ž°非常敏感 o茎段在芽诱导培养基上预培养 y §后k暗培养l o转接入添加 Ž°的芽诱导培养基上培养 oŽ°
浓度为 y °ª#pt时 o芽的诱导频率仅为 |1z h ∀考虑到转化过程中农杆菌可能会对茎段产生影响 o在转化后
的初次筛选培养基中 Ž°浓度降为 x °ª#pt ∀杉木茎段转化时不延迟添加 Ž°o初次筛选后 Ž°抗性芽的再
生频率仅为 t1z h o延迟 v §后 o初次筛选后 Ž°抗性芽的再生频率升高到 {1v h o因此本试验采用了延迟 v §
的方法 o允许有一定的逃逸比例 o在 u次筛选时加大选择压 ∀
参 考 文 献
李 丹 o凌定厚 qusss1 五种提取马尾松基因组 ⁄‘„方法的比较 q植物学通报 otzkul }ty{ p tzv
王明庥 qusst1 林木遗传育种学 q北京 }中国林业出版社
王关林 o方宏筠 qussu1 植物基因工程 qu版 q北京 }科学出版社
俞新妥 qt||z q杉木栽培学 q福州 }福建科学技术出版社
诸葛强 o王婕琛 o陈 英 o等 qussv1 新疆杨高效遗传转化系统的建立 q植物资源与环境学报 otukwl }y p ts
…¬¶«²³2‹∏µ¯¨ ¼ ≥ o¤¥®¬¨º¬¦½ • oŠµ¤¦¨ o ετ αλqusst1 ≤²±¬©¨µª¨ ±¨ ·¬¦ ±¨ª¬±¨ µ¨¬±ª}·µ¤±¶ª¨ ±¬¦ Πινυσραδιατα k⁄q⁄²±l ¤±§ Πιχεα αβιεσ kŽ¤µ¶·l ³¯¤±·¶¤µ¨
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k责任编辑 徐 红l
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