全 文 ：第 v|卷 第 u期
u s s v年 v 月
林 业 科 学
≥≤Œ∞‘׌„ ≥Œ∂ „∞ ≥Œ‘Œ≤„∞
∂²¯1v| o‘²1u
¤µqou s s v
泡桐丛枝病发生相关蛋白质的电泳分析
范国强 李 有 郑建伟 翟晓巧
k河南农业大学泡桐研究所 郑州 wxsssul
摘 要 } 对毛泡桐和白花泡桐同龄 !同方位的病株健叶 !病株病叶和健株健叶蛋白质进行了单向和双向 ≥⁄≥
聚丙烯酰胺凝胶电泳分析研究 ∀单向电泳结果表明 o毛泡桐和白花泡桐病株健叶 !病株病叶和健株健叶的蛋
白质在种类和数量上存在一定的差异 o其明显的蛋白质凝胶扫描谱带分别有 uu !us和 tz以及 uz !ut和 uu条 ~
双向电泳结果表明 o毛泡桐与白花泡桐在健株健叶 !病株健叶和病株病叶蛋白质变化方面具有一定相似性 o即
在两种泡桐健株健叶和病株健叶中存在的一种 ³Œy q{ ! • uwŽ⁄蛋白多肽在病株病叶中观察不到 ∀我们认为
这种情形可能与发生泡桐丛枝病有一定的关系 ∀
关键词 } 泡桐 o丛枝病 o蛋白质 o电泳
收稿日期 }ussu p sw p tx ∀
基金项目 }国家自然科学基金资助课题k批准号 }v|{zsyvt ovsuzts{ul的部分内容 ∀
Σ∆Σ2ΠΑΓΕ ΟΦ ΠΡ ΟΤΕΙΝΣ ΡΕΛΑΤΕ∆ ΤΟ ΠΑΥΛΟΩΝΙΑ ΩΙΤΧΗΕ. Σ ΒΡ ΟΟΜ
ƒ¤± Š∏²´¬¤±ª ¬≠²∏ «¨ ±ª¬¤±º¨ ¬ «¤¬÷¬¤²´¬¤²
kΙνστιτυτε οφ ΠαυλοωνιαoΗε ναν Αγριχυλτυραλ Υνιϖερσιτψ Ζηενγζηου wxsssul
Αβστραχτ} °µ²·¨¬±¶¬± «¨ ¤¯·«¼ ¤±§¬±©¨¦·¨§¯¨ ¤√¨ ¶²©§¬¶¨¤¶¨§·µ¨ ¶¨¤±§«¨ ¤¯·«¼ ¯¨ ¤√¨ ¶²©«¨ ¤¯·«¼·µ¨ ¶¨²© Παυλοωνια το2
µεντοσα ≥·¨∏§¤±§ ΠqΦορτυνειk≥¨ °¨l‹ °¨¶¯ oº«¬¦« º¨ µ¨ ²±·«¨ ¶¤°¨ §¬µ¨¦·¬²± ¤±§¤··«¨ ¶¤°¨ ¤ª¨ oµ¨ ¤¯·¨§·² Παυλοωνια
º¬·¦«¨ . ¶¥µ²²° º¨ µ¨ ¶·∏§¬¨§ ¥¼ ≥⁄≥2°„Š∞ ¤±§u2⁄2°„Š∞q׫¨ µ¨¶∏¯·¶¬±§¬¦¤·¨§·«¤··«¨µ¨ ¬¨¬¶·¨§§¬©©¨µ¨±¦¨ ¤°²±ª
«¨ ¤¯·«¼ ¤±§¬±©¨¦·¨§¯¨ ¤√¨ ¶²©§¬¶¨¤¶¨§·µ¨ ¶¨¤±§«¨ ¤¯·«¼·µ¨¨¯¨ ¤√¨ ¶²© Πqτοµεντοσᤱ§ ΠqΦορτυνει·µ¨ ¶¨¬±³µ²·¨¬± ∏´¤±2
·¬·¼ ¤±§ ∏´¤¯¬·¼o¬± º«¬¦«²¥√¬²∏¶³µ²·¨¬± ±∏°¥¨µ¶º¨ µ¨ uu ous otz ¤±§uz out ouu º¬·«≥⁄≥2°„Š∞ µ¨¶³¨¦·¬√¨ ¼¯ q²µ¨²√¨ µo
·«¨ ¦«¤±ª¨¶²©³µ²·¨¬±¶¬± «¨ ¤¯·«¼¤±§¬±©¨¦·¨§¯¨ ¤√¨ ¶²©§¬¶¨¤¶¨§·µ¨ ¶¨¤±§«¨ ¤¯·«¼·µ¨¨¯¨ ¤√¨ ¶²© Πqτοµεντοσ᫤§¶¬°¬¯¤µ¬2
·¼·²·«¤·²© ΠqΦορτυνει ²±¥¤¶¬¶²©u2⁄2°„Š∞q׫¤·¬¶o·«¨ ³µ²·¨¬±k³Œy q{ o • uwŽ⁄l ¬¨¬¶·¨§¬± «¨ ¤¯·«¼·µ¨¨¯¨ ¤√¨ ¶¤±§¬±2
©¨¦·¨§2«¨ ¤¯·«¼ ¯¨ ¤√¨ ¶²©§¬¶¨¤¶¨§·µ¨ ¶¨§¬¶¤³³¨¤µ¨§¬±§¬¶¨¤¶¨§¯¨ ¤√¨ ¶q׫¬¶³µ²·¨¬±¦«¤±ª¨ °¬ª«·¥¨ ¦²±¶¬§¨µ¨§·²«¤√¨ µ¨ ¤¯2
·¬²±¶«¬³º¬·« Παυλοωνια º¬·¦«¨ . ¶¥µ²²°q
Κεψ ωορδσ} °¤∏¯²º±¬¤o •¬·¦«¨ . ¶¥µ²²°o°µ²·¨¬±o∞¯ ¦¨·µ²³«²µ¨¶¬¶
丛枝病是泡桐k Παυλοωνιαl生产中长期没有根本解决的问题之一 ∀自土居养二等发现泡桐丛枝病
的病原菌 ) ) ) 植物菌原体以来 o国内外科技工作者作了大量的研究工作 o初步明确了病原的传播方式 !
发生规律和发病过程中的生理生化变化k范国强等 ot||z¤~金开璇 ot|{| ~巨关升等 ot||y ~宋晓斌等 o
t||z ~田国忠等 ot||| ~王蕤等 ot|{t ~袁巧平等 ot||w ~张春立等 ot||y ~朱澄等 ot||tl o但泡桐丛枝病的发
生机理研究没有出现人们初期预料那样大的进展 ∀近年来 o虽然有人研究了菌原的一些分子生物学特
征k林木兰等 ot||v ~张春立等 ot||wl o但对寄主泡桐的研究较少 ∀众所周知 o蛋白质是基因表达的最终
产物 o其在植物生长发育过程中起着重要的作用 ∀然而 o至目前与泡桐丛枝病发生相关特异蛋白质的电
泳结果在国内外未见报道 ∀本文以毛泡桐和白花泡桐为材料 o研究了其病株和健株叶片蛋白质的变化
情况 o为进一步揭示泡桐丛枝病的发生机理提供参考 ∀
t 材料与方法
111 实验材料 实验材料为 t|||年取自河南农业大学郑州林业试验站的毛泡桐k Παυλοωνια τοµεντοσαl
和白花泡桐k ΠqΦορτυνειl ∀分别采集其同龄 !同品种 !树冠中部且朝南方向的病株病叶 !病株健叶和健
株健叶 o并依次用自来水 !蒸馏水洗净 o用纱布包好置于液态氮中保存备用 ∀
112 实验方法
t1u1t 叶片蛋白质干粉的制备 参见范国强等kt||z¥l方法 ∀
t1u1u 蛋白质样品制备 分别称取上述制备的干粉 vs °ªo置于 t1x °离心管内 o加 wss ˏ样品处理
液k单向电泳lku h ≥⁄≥ os1st °²¯#pt×µ¬¶ox h Β2巯基乙醇 o³‹ y q{l或样品裂解液k双向电泳lk|1s °²¯#pt
尿素 ou h ‘°2ws ot1y h两性载体电解质 ³‹ x ∗ z os1w h两性载体电解质 ³‹ v1x ∗ tsl震荡混匀 o于 vx ε 水
浴锅中温浴 vs °¬±o然后 o室温下 ts sss ≅ ª离心 vs °¬±o上清液即分别为单向电泳和双向电泳的上样蛋
白质样品 ∀
t1u1v 蛋白质单向电泳k≥⁄≥2°„Š∞l 参见 ¤¨ °°¯¬kt|zsl的方法 蛋白质上样量为 uss Λª#泳道 p t o电
流强度为 us °„#版 p t o当溴酚蓝指示带接近胶板下沿 t ¦°时停止电泳k时间约为 { «l ∀凝胶用染色液
≈s1ux ª#pt考玛斯亮蓝 • uxs owx h甲醇 ots h乙酸 染色过夜 o第 u天用脱色液kts h甲醇 oz h乙酸l脱色 o
脱色好的凝胶用于照相 ∀
t1u1w 凝胶扫描 用 ≤≥2|sss日本岛津双波沸点扫描仪扫描 ∀扫描波长为 xzx ±° o以 yss ±°作参考波
长 ∀
t1u1x 蛋白质双向电泳ku2⁄2°„Š∞l 参照 ’. ƒ¤µµ¨¯¯ 方法kt|zxl ∀第一向等电聚焦电泳用柱状凝胶法 ∀
凝胶柱长 tx¦° o内径 t1x °° o凝胶浓度为 w h ∀上 !下极电泳液分别为 s1su °²¯#pt‘¤’‹ !s qst °²¯#pt
‹v°’w 溶液 ∀上样量为 t1x °ª总蛋白质 ∀先用 wss ∂ 电压电泳 t «o再调压至 tuss ∂ 电泳 tx «∀电泳结
束后 o用 ts h ×≤„k用丙酮配制 o内含 s1sz h的巯基乙醇l固定凝胶 vs °¬±o然后用蒸馏水冲洗两遍 o再在
平衡液kts h甘油 ox h Β2巯基乙醇 ou1v h ≥⁄≥ os1yux °²¯#pt ×µ¬¶o³‹ y q{l中平衡 vs °¬±o用溶解在平衡液
中 t h的琼脂固定于第二向电泳的上样端 o当溴酚蓝指示带接近凝胶下沿 t ¦°时结束电泳 ∀用 t1u1v
中方法将凝胶染色脱色后进行拍照和分析 ∀
u 结果与分析
211 不同种泡桐叶片的蛋白质单向电泳(Σ∆Σ2ΠΑΓΕ)
图 t 毛泡桐和白花泡桐叶片
蛋白质 ≥⁄≥2°„Š∞图
ƒ¬ªqt ≥⁄≥2°„Š∞ ²©³µ²·¨¬±¶¬± §¬©©¨µ¨±·
Παυλοωνια·µ¨¨¯¨ ¤√¨ ¶
„ }毛泡桐健株健叶 ‹ ¤¨¯·«¼ ¯¨ ¤√ ¶¨²© Πqτοµεντοσα
…}毛泡桐病株健叶 Œ±©¨¦·¨§2«¨ ¤¯·«¼ ¯¨ ¤√¨ ¶²© Πq
τοµεντοσα~≤ }毛泡桐病株病叶 ⁄¬¶¨¤¶¨§¯¨ ¤√ ¶¨²©
Πqτοµεντοσα ~⁄}白花泡桐健株健叶 ‹ ¤¨¯·«¼ ¯¨ ¤√2
¶¨²© Πqφορτυνει ~∞}白花泡桐病株健叶 Œ±©¨¦·¨§2
«¨ ¤¯·«¼¯¨ ¤√ ¶¨²© Πqφορτυνει ~ƒ }白花泡桐病株病
叶 ⁄¬¶¨¤¶¨§¯¨ ¤√¨ ¶²© Πqφορτυνει q下同 ׫¨ ¶¤°¨ ¥¨2
²¯º q
由毛泡桐和白花泡桐病株病叶 !病株健叶和健株健叶蛋白质
的单向聚丙烯酰胺凝胶电泳图k图 tl及扫描图k图 ul可以看出 o
这两种泡桐叶片蛋白质的种类和含量都存在着差异 ∀毛泡桐和
白花泡桐的病株健叶 !病株病叶和健株健叶的蛋白质明显谱带分
别为 uu !us及 tz以及 uz !ut和 uu条 ∀毛泡桐健株健叶 !病株健
叶内分子量为 yy !wz !ut1u !tuŽ⁄的蛋白质含量比病株病叶内的
含量高 ~健株健叶 !病株健叶内分子量为 wsŽ⁄的蛋白质含量比病
株病叶内的低 o而健株健叶内分子量为 vy1x !ux1x !t{Ž⁄的蛋白
质比病株健叶和病株病叶内的低 ∀对白花泡桐 o分子量为 xs1x !
vy1x !ux1x !ut1u !tuŽ⁄的蛋白质在其健株健叶和病株健叶内的含
量比其病株病叶内的含量高 o分子量为 v| !vv !uz !twŽ⁄的蛋白质
在健株健叶内的含量比其病株健叶和病株病叶内的含量低 ∀此
外 o白花泡桐的健株健叶和病株健叶内比其病株病叶多一种分子
量为 wv1xŽ⁄的蛋白多肽 ∀以上结果表明 o毛泡桐和白花泡桐病
株病叶 !病株健叶和健株健叶内蛋白质在种类上各有其特异的蛋
白质谱带出现 !含量上也存在一定的差异 o但其 v种叶片蛋白质
变化没有相同的规律 ∀
212 不同种泡桐叶片蛋白质双向凝胶电泳(22∆2ΠΑΓΕ)
比较毛泡桐健株健叶和病株健叶的蛋白质图谱k图 v2„和图
sut 林 业 科 学 v|卷
v2…l可以发现 o等电点和分子量分别为 y1| !vsŽ⁄~y1s !usŽ⁄和 y1z !u|Ž⁄的蛋白质含量在病株健叶都比
健株健叶中的含量低 ~³Œy1{ !ΜΩvsŽ⁄的蛋白质在病株健叶中的含量比其健株健叶中的高 ∀图 v2…和
图 v2≤的比较结果表明 o毛泡桐病株病叶中的蛋白质含量与其病株健叶中的相比发生了较大变化 o即 ³Œ
z qs ∗ ³Œz qt !ΜΩwyŽ⁄的一组蛋白质在其病株病叶中的含量明显高于其病株健叶中的含量 ∀此外 o存在
于图 v2…中的 ³Œ为 y1{ !ΜΩ为 uwŽ⁄的蛋白质多肽在图 v2≤ 中观察不到 ∀将图 v2≤ 和图 v2„比较后也
发现存在于毛泡桐健株健叶内的一种 ³Œy1{ !ΜΩuwŽ⁄的蛋白多肽在病株病叶内消失了 ∀
图 u 毛泡桐和白花泡桐叶片蛋白质 ≥⁄≥2°„Š∞扫描图
ƒ¬ªqu ≥¦¤±±¬±ª²©≥⁄≥2°„Š∞ ²©³µ²·¨¬±¶¬± ¯¨ ¤√¨ ¶²©§¬©©¨µ¨±·Παυλοωνια·µ¨ ¶¨
图 v 毛泡桐和白花泡桐叶片蛋白质聚丙烯酰胺凝胶双向电泳
ƒ¬ªqv ׺²§¬° ±¨¶¬²±¤¯ ≥⁄≥2°„Š∞ ²©³µ²·¨¬±¶¬± §¬©©¨µ¨±·Παυλοωνια·µ¨¨¯¨ ¤√ ¶¨
白花泡桐健株健叶的蛋白质凝胶图谱k图 v2⁄l与其病株健叶图谱k图 v2∞l比较发现 o蛋白质的种类
和含量有较大的差异 ∀³Œy qw !ΜΩwyŽ⁄的蛋白质在健株健叶中的含量高于其在病株健叶中的含量 ∀在
图 v2∞和图 v2ƒ中 o³Œy qx ∗ z1s !ΜΩuwŽ⁄∗ vsŽ⁄的蛋白多肽的种类和数量变化很大 o在病株健叶中存在
的一种 ³Œy1{ !ΜΩuwŽ⁄的蛋白多肽在其病株病叶中观察不到 o而其它四种蛋白质的含量在病株病叶中
明显降低了 ∀此外 o一种 ³Œy1x !ΜΩwxŽ⁄的蛋白多肽在白花泡桐病株病叶中的含量明显高于其病株健
叶 ∀比较白花泡桐病株病叶k图 v2ƒl和健株健叶k图 v2⁄l中的蛋白质可以发现 o虽说叶片内蛋白质的种
类和含量有一定的差别 o但是最大的变化是在健株健叶和病株健叶中出现的 ³Œy1{ !ΜΩuwŽ⁄蛋白多肽
在病株病叶中消失了 ∀
v 讨论
植物的任何性状皆为基因所控制 ∀基因首先转录为 °• ‘„ o°• ‘„再翻译为其对应的蛋白质 o反过
来 o蛋白质又参与基因的表达和植物性状的调控k贺福初 ot||| ~王志珍等 ot||{l ∀即蛋白质与植物的性
状表现密切相关 ∀但是 o°• ‘„由于自身存在贮存 !转运 !降解 !翻译调控及产物的翻译后加工 o难以准
确反映基因的最终产物 !基因功能的真正执行体 ) ) ) 蛋白质的质与量 ∀基因与其编码产物蛋白的线性
tut 第 u期 范国强等 }泡桐丛枝病发生相关蛋白质的电泳分析
对应关系只存在于其新生肽链而不是其最终的功能蛋白中 ∀近年的研究发现 o蛋白质间也存在类似于
°• ‘„分子内的剪切 !拼接 o并证明其基本元件/¬±·¨¬±0广泛存在于多种蛋白质中k张文伟等 ousssl ∀此
类过程的存在无疑进一步扩大了基因编码的蛋白质与其最终的功能蛋白间所存在的序列差距 ∀而大量
蛋白尤其是重要调控蛋白的化学修饰k如糖基化 !磷酸化l !剪切加工k如酶原降解 !结构域拼接l不但可
以改变其空间结构 o而且是实施其功能与调节的重要结构基础 ∀这些均不能从其基因编码序列中预测 o
而只能通过对其最终的功能蛋白进行分析k万晶宏等 ot|||l ∀也就是说 o基因虽然是遗传信息的源头 o
但功能性蛋白才是基因功能的执行体 ∀研究基因的功能固然为解释生命现象发生机理奠定坚实的基
础 o但是它并不能提供认识各种生命活动直接的分子基础 ∀因此 o要了解生物体的某一性状发生规律 !
生理生化过程的发生机理就必须研究生命活动的执行体 ) 蛋白质 ∀即研究与生物某一性状或过程特异
相关蛋白质的位置 !结构和功能对于揭示其发生机理及其人工调控具有重要的理论意义和经济意义 ∀
在本实验中 o毛泡桐和白花泡桐病株健叶和健株健叶中存在的分子量为 uwŽ⁄!³Œy1{的蛋白质k多肽l在
其病叶中消失了 o这可能是导致丛枝病症状发生的原因之一 ∀至于该种蛋白质结构 !功能的阐明及其亚
细胞位置的确定 o有待于进一步研究 ∀
参 考 文 献
贺福初 q蛋白质组k³µ²·¨²°¨ l研究 ) ) ) 后基因组时代的生力军 q科学通报 ot||| owwkul }ttv ∗ tuv
范国强 o蒋建平 q泡桐丛枝病的发生与叶片蛋白质氨基酸变化关系的研究 q林业科学研究 ot||z¤otskyl }xzs ∗ xzv
范国强 o蒋建平 q泡桐叶片蛋白质提取方法的研究 q植物学通报 ot||z¥otwkvl }yt ∗ yw
金开璇 o田国忠 q组织化学技术快速检测泡桐丛枝病研究 q植物学报 ot|{| ot|kvsl }t{x ∗ t{|
巨关升 o王 蕤 q泡桐丛枝病的抗性与维生素 ≤关系的研究 q林业科学研究 ot||z o| }wvt ∗ wvw
林木兰 o杨继红 q泡桐丛枝病菌原体单克隆抗体的研制及初步应用 q植物学报 ot||v ovxk|l }zts ∗ ztx
宋晓斌 o郑文锋 q类菌原体的侵入对泡桐组织和细胞的影响 q林业科学研究 ot||z otskwl }wu| ∗ wvw
田国忠 o张锡津 q抗病和感病泡桐无性系组培苗对嫁接传染植原体的不同反应 q林业科学 ot||| otzktl }wz ∗ xw
万晶宏 o贺福初 q蛋白质组技术的研究进展 q科学通报 ot||| owwk|l }|sw ∗ |tu
王 蕤 o孙秀琴 o王守宗等 q激素对泡桐丛枝病发生的影响 q林业科学 ot|{t okvl }u{t ∗ u{y
王志珍 o邹承鲁 q后基因组 ) 蛋白质组研究 q生物化学与生物物理学报 ot||{ ovskyl }xvv ∗ xv|
袁巧平 o田国忠 q泡桐丛枝病 ’在寄主离体组织中的保存与增殖 q植物学报 ot||w ovykwl }ttx ∗ tus
张春立 o林木兰 q利用 °≤• 方法检测泡桐丛枝病发生的 ’ q生物多样性 ot||y ouk增l }xx ∗ ys
张春立 o林木兰 o胡学勤 q泡桐丛枝病类菌原体 ⁄‘„的分子克隆与序列分析 q植物学报 ot||w ovykwl }uz{ ∗ u{u
张文伟 o曹少先 o张文彪 q蛋白质的自剪接 q生命的化学 ousss ousktl }uy ∗ u|
朱 澄 o金开璇 q用 ⁄„°Œ荧光显微术测泡桐丛枝病 q植物学报 ot||t ovvkzl }w|x ∗ w|{
¤¨ °°¯¬˜ Žq≤¯ ¤¨√¤ª¨ ²©¶·µ∏¦·∏µ¤¯ ³µ²·¨¬±¶§∏µ¬±ª·«¨ ¤¶¶¨ °¥¯¼ ²©·«¨ «¨ ¤§²©¥¤¦·¨µ¬²³«¤ª¨ ×w q‘¤·∏µ¨ ot|zs ouuz }y{s ∗ y{x
’. ƒ¤µ¨¯¯ ‹ q‹¬ª«¨µ¶²¯∏·¬²± ²©·º²§¬° ±¨¶¬²±¤¯ ¨¯ ¦¨·µ²³«²µ¨¶¬¶²©³µ²·¨¬±¶q…¬²¦«¨ ° ot|zx ouxs }w ssz ∗ w sut
uut 林 业 科 学 v|卷