全 文 ： 第 vz卷 第 t期u s s t年 t 月
林 业 科 学
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∂ ²¯1vz o ‘²1t
¤± qou s s t
水双相法分离泡桐幼苗根细胞质膜的研究
洪剑明
k首都师范大学生物系 北京 tsssvzl
贾慧君
k中国林业科学研究院 北京 tsss|tl
郑槐明
k中国林学会 北京 tsss|tl
摘 要 } 通过对草本植物水双相法分离细胞质膜技术的改进 o建立起木本植物泡桐根细胞质膜的分离纯化
方法 ∀其改进主要有 }在匀浆介质中添加了抗坏血酸 o加大了聚乙烯聚吡咯烷酮的用量 o由草本植物一般用
量 s1sx h ∗ s1t h增至 s1y h ~对第 t次双相分离后下相液中剩余的质膜进行了再回收 ∀通过对质膜和细胞
器各项标记酶指标的测定 o确定了 y1v h的葡聚糖k⁄¨ ¬·µ¤±l×2xss和 y1v h的聚乙二醇k°∞Šlwsss为主组成
的两相系统分离的根细胞质膜具有较高的收率和纯度 ∀该方法的建立为在细胞和分子水平上研究林木根系
对离子吸收机理与生长发育的关系打下了基础 ∀
关键词 } 泡桐 o水双相分离法 o细胞质膜 o标记酶 o氧化还原活性
收稿日期 }usss2sv2ty ∀
基金项目 }国家自然科学基金资助项目 o稳态营养苗木根细胞质膜的动态研究kv|zzsytwl ∀
ΣΤΥ∆ΙΕΣ ΟΝ ΣΕΠΑΡΑΤΙΝΓ ΠΛΑΣΜΑ ΜΕΜΒΡΑΝΕ ΦΡ ΟΜ Ρ ΟΟΤΣ
ΟΦ ΠΑΥΛΟΩΝΙΑ ΣΕΕ∆ΛΙΝΓ ΒΨ ΑΘΥΕΟΥΣ Τ ΩΟ2ΠΗΑΣΕ ΠΑΡΤΙΤΙΟΝΙΝΓ
‹²±ª¬¤±°¬±ª
( ∆επαρτµεντ οφ Βιολογψ, Χαπιταλ Νορµ αλ Υνιϖερσιτψ Βειϕινγtsssvz)
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( Τηε Ρεσεαρχη Ινστιτυτε οφ Φορεστρψ, ΧΑΦ Βειϕινγtsss|t)
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( Τηε Χηινεσε Σοχιετψοφ Φορεστρψ Βειϕινγtsss|t)
Αβστραχτ: ׫¬¶³¤³¨µµ¨³²µ·¶·«¨ ° ·¨«²§²© ³¤µ·¬·¬²±¬±ª¤±§³∏µ¬©¼¬±ª ³¯¤¶°¤ ° °¨¥µ¤±¨ ©µ²° µ²²·¶²© º²²§¼
³¯¤±·¶²© Παυλοωνια ¥¼¬°³µ²√¬±ª·«¨ ° ·¨«²§²©³µ¨³¤µ¬±ª³¯¤¶°¤ ° °¨¥µ¤±¨ ¥¼ ¤´ ∏¨²∏¶·º²2³«¤¶¨ ³¤µ·¬·¬²±¬±ª¬±
«¨µ¥¤¦¨²∏¶³¯¤±·¶q ׫¨ °¤¬± ¬°³µ²√ °¨ ±¨·¶¤µ¨ ¤§§¬±ª¤¶¦²µ¥¬¦¤¦¬§¤±§¬±¦µ¨¤¶¬±ª¤± ¤°²∏±·²©¬±¶²¯∏¥¯¨ ³√³³
k³²¯¼√¬±¼¯ ³²¯¼³¼µµ²¯¬§²±¨ l ©µ²° s1sx h ∗ s1t h ²© «¨µ¥¤¦¨²∏¶³¯¤±·¶·² s1y h ¬± ·«¬¶«²°²ª¨ ±¬½¤·¬²± ° §¨¬∏° o
¤±§·«¨ ± ¤ª¤¬±¦²¯¯¨ ¦·¬±ª·«¨ ³¯¤¶°¤ ° °¨¥µ¤±¨ ©µ²°·«¨ ²¯º µ¨³«¤¶¨ ¤©·¨µ·«¨ ©¬µ¶·¤´ ∏¨²∏¶·º²2³«¤¶¨ ³¤µ·¬·¬²±¬±ªq
׫µ²∏ª«§¨·¨µ°¬±¬±ª·«¨ §¬©©¨ µ¨±·®¬±§¶²© °¤µ®¨ µ¨ ±½¼° ¶¨²©³¯¤¶°¤ ° °¨¥µ¤±¨ ¶¤±§²µª¤±¨ ¯¯ ¶¨o·«¤·³¯¤¶°¤ ° °¨2
¥µ¤±¨ ³µ¨³¤µ¤·¬²±¶²©«¬ª«¼¬¨ §¯¤±§³∏µ¬·¼ º µ¨¨ ¤¨¶¬¯¼ ²¥·¤¬±¨ §¬± ¤´ ∏¨²∏¶³²¯¼° µ¨·º²2³«¤¶¨ ¶¼¶·¨°¶°¤¬±¯ ¼ ¦²±2
¶·¬·∏·¨§¥¼ y qv h ⁄¨ ¬·µ¤± ×2xss ¤±§y qv h ³²¯¼¨ ·«¼¯ ±¨¨ ª¯¼¦²¯ wsss q ׫¬¶° ·¨«²§ ¤¯¼¶·«¨ ©²∏±§¤·¬²±¶©²µ·«¨
¶·∏§¬¨¶²±·«¨ µ¨ ¤¯·¬²± ¥¨·º¨¨ ±·«¨ ³µ¬±¦¬³¯ ¶¨²©µ²²·¶¤¥¶²µ³·¬²±¬²±¶¤±§ªµ²º·«o§¨√¨¯²³° ±¨·²©¤ º²²§¼ ³¯¤±·¤·
¦¨¯¯∏¯¤µ¤±§ °²¯ ¦¨∏¯¤µ¯ √¨¨¯ q
Κεψ ωορδσ: Παυλοωνια , „ ∏´¨²∏¶·º²2³«¤¶¨ ³¤µ·¬·¬²±¬±ªo°¯ ¤¶°¤ ° °¨¥µ¤±¨ o ¤µ®¨ µ¨ ±½¼°¨o„¦·¬√¬·¼²©²¬¬§¤2
·¬²±2µ¨§∏¦·¬²±
水双相法分离植物细胞质膜是 {s年代后期以来逐渐成熟的一项研究技术 ∀与传统的蔗糖密度梯
度离心法根据膜囊泡的大小 !密度分离的方法不同 o它是按照膜表面所带电荷的不同进行分离的 o避免
了由于多种细胞器膜的大小 !密度与质膜接近 o使分离出的质膜纯度不高的缺陷 o并且加快了分离速
度 o更好地保持了膜囊泡的封闭性和膜蛋白的活性 o因而具有明显的优越性 o已在多种作物幼苗有关离
子吸收 !质膜氧化还原系统和质膜 ‹ n2„×°¤¶¨ 的研究 !跨膜信号传导等细胞生理和分子生物学研究上
得到广泛地应用 ∀k≥¤±§¶·µ²° ετ αλ. ot|{z ~ ∏¶·¨µ ετ αλ. ot|{| ~ °¤¯ °ªµ¨± ετ αλ. ,t||s ~陈 珈等 o
t||w ~洪剑明等 ot||x !t||| ~‹∏¤±ª ετ αλ. ousssl但是运用此方法研究木本植物根细胞质膜的生理生化
特性在国内外尚未见报道 ∀本文详细介绍了经改进后的木本植物根细胞质膜的水双相分离纯化方法 !
产率和纯度鉴定结果 ∀为今后研究苗木稳态营养优势的细胞和分子生物学机理奠定了基础 ∀
表 1 毛泡桐幼苗生长所需的最适营养物重量比例
Ταβ .1 Τηε οπτιµυµ νυτριεντ ωειγητ προπορτιονσφορ
Παυλουνεα τοµεντοσα σεεδλινγ
大量元素 ¤¦µ²±∏·µ¬¨±·¶ 微量元素 ¬¦µ²±∏·µ¬¨±·¶
‘ tss ƒ¨ s qzss  ² s qssz
Ž zx  ± s qwss ‘¤ s qssv
° us … s quss
≤¤ { ≤∏ s qsvs
 ª | ± s qsvs
≥ | ≤¯ s qsvs
t 材料和方法
111 泡桐幼苗的培养
毛泡桐( Παυλοωνια τοµεντοσα)种子采自河北省 ∀
经 ws ε 温水催芽 ts °¬±o室温浸种 uw «o种子均匀摆
放在培养皿内的湿滤纸上萌发k室温约vs ε o光照l ∀
约两周后 o挑选大小一致的实生苗在白瓷缸中开始预
生长培养 ∀白瓷缸内盛约 u培养液 o幼苗用泡沫置
于白瓷缸盖孔中 ∀培养液浓度为 z1tw °°²¯ ‘ro按
毛泡桐幼苗最适营养物重量比例配制培养液母液k¬¤
‹∏¬­∏± ετ αλ. ,t|{wl o列于表 t ∀大约一个月后 o再挑
选生长一致的幼苗开始正式培养 ∀生长过程中用调
整 !控制培养液 ³‹ 和电导率的方法 o添加生长所需营
养物质k贾慧君等 ot||vl ∀由于质膜提取需根量较大 o培养期约 u个月 ∀预生长和正式培养均在中国
林科院林研所普通温室进行 o为创造幼苗生长较适宜的条件 o用洒水保证室内湿度 o在玻璃顶上加盖竹
帘降温 o有时还把瓷缸搬到遮荫处降温 ∀
112 根细胞质膜的制备(4 ε 下进行)
t1u1t 粗膜制剂的获得 将幼根用蒸馏水漂洗后剪下通气悬浮于 s1t °°²¯r的 w ε 硫酸钙溶液中 t
«o去除根表面菌类和杂质 ∀按每 ª鲜重根加 u ∗ v °匀浆缓冲液 ∀匀浆缓冲液成分 }ux °°²¯r×µ¬¶2
 ¶¨k³‹z q{l os1x °²¯r蔗糖k促进细胞质壁分离和维持渗透压l ot °°²¯r∞⁄× „2‘¤uk螯合金属离
子l ot h聚乙烯聚吡咯烷酮k°∂ °°l ot °°²¯r苯甲基磺酰氟化物k°  ≥ƒ o配成 s1t °²¯r的异丙醇储
液 o用时每 tss °匀浆液加 t °o抑制蛋白酶活性l ov °°²¯r二硫苏糖醇k⁄× × o保护蛋白质的硫氢
基l ox °°²¯r抗坏血酸 ∀zys °°2‹ª真空渗透 vs¶o用高速匀浆器打磨 w ∗ x次 o每次 y ∗ {¶ouws目尼
龙网过滤两次k因根中纤维素较多 o第 t次可抽滤l o滤液 tssss ≅ ª离心 ts °¬±o收集上清液 ∀上清液
tussss ≅ ª离心 us °¬±o沉淀即含多种膜成分的粗膜制剂k  ƒ o°¬¦µ²¶²°¤¯ ©µ¤¦·¬²±l ∀
t1u1u 水双相系统的制备 ktl浓度约 us h k • r • l的葡聚糖 ×2xss储液的配制 取 uu ª葡聚糖 ×2
xss干粉k有少量吸湿l o加入 z{ °双蒸水 oys ε 以上水浴搅拌 o溶解后取 x ª定容于 ux °容量瓶 o再
加入到长度为 ψ的恒温套管中 oux ε 恒温水浴下测定旋光度 o并代入下列公式中计算出精确的浓度 ∀
公式为 }¾悬光仪读数 ≅ uxk°lr≈t|| ≅ ξkªl ≅ ψk§°l À ≅ tss h ∀其中 ξ 为所取待测液的精确克数 o
ψ为测定管长度k此实验中为 u1u §°l ∀kulx ≅混合储备液的配制 按下列浓度的 x倍配制 }x °°²¯r
磷酸钾缓冲液 ox °°²¯rŽ≤¯os1t °°²¯r∞⁄× „2‘¤u o用 Ž’‹ 或 ‹≤¯调整 ³‹ 至 z1{ ∀kvl水双相及
上 !下相储液的配制 按所需配制水双相的重量k此处视同体积l计算并称取蔗糖k浓度为 uxs °°²¯r
l o然后加入双蒸水和 x ≅混合储备液 o振荡混匀并溶解 ~最后加 us h葡聚糖 ×2xss储液和浓度为 ws h
k • r • l的聚乙二醇k°∞Šl2wsss储液 o温和混匀 ∀直接用来分离纯化质膜的水双相其 ×2xss和 °∞Š2
wsss在计算称取储液量时应包括分离时加入粗膜的重量 o用来制备上 !下相的水双相只需按所配制的
量计算需加入的 ×2xss和 °∞Š2wsss ~所加入的 x ≅混合储备液均按需配制水双相的 trx量计算 ~加入
双蒸水量为需配制水双相的重量减去以下各项之和 o即 }蔗糖 !×2xss和 °∞Š2wsss储液 !x ≅ 混合储备
液的用量 ∀用来制备上 !下相的水双相混匀后倒入分液漏斗中 o于 w ε 冰箱内静置分相过夜 o次日分别
收集上 !下相备用k如无污染可在冰箱内保存数月l ∀
t1u1v 细胞质膜的分离和纯化 粗膜沉淀用重悬浮缓冲液ks1ux °²¯r蔗糖 ox °°²¯r磷酸钾缓冲
液 ³‹z1{ ox °°²¯rŽ≤¯ot °°²¯r⁄× × ot °°²¯r°  ≥ƒ os1t °°²¯r∞⁄× „2‘¤ul悬浮后 o精确定
重至事先准备好的水双相液重量的 trv o待  ƒ完全均匀悬浮后加入到水双相系统中k水双相中除具有
与重悬浮缓冲液相同的成分外 o与粗膜制剂混合后体系内还应分别含有 y1s h ∗ y1x h左右的葡聚糖
wu 林 业 科 学 vz卷
×2xss和聚乙二醇 wsss o此时还应现用现加 t °°²¯r⁄× × ot °°²¯r°  ≥ƒl o上下颠倒充分摇匀 o
tss ≅ ª离心 x °¬±∀小心吸取 |s h的上相液k˜t ∏³³¨µ³«¤¶¨ tl o加入到事先准备好的下相液中 o重新
分离一次 ~同时 o将吸出 |s h ˜t后的下相液kt ²¯º µ¨³«¤¶¨ tl中加入事先准备好的上相液再回收k为
提高质膜收率l ∀此时上相液k˜ul为分离后的正面向外的质膜囊泡k指未将质膜朝向细胞质一侧翻转
向外的一类囊泡 ∀ ° 2• ’ ∂ o³¯¤¶°¤ °¨°¥µ¤±¨ µ¬ª«·2²∏·√ ¶¨¬¦¯ ¶¨o有时简称 °  l o小心吸出 |s h ˜u ~同
时 o将再回收后的上相液k˜t. l的 |s h吸出 o用事先准备好的下相液重新分离一次 o得到 ˜u. ~小心吸出
|s h ˜u. o与 ˜u混合后加入适量的重悬浮缓冲液k或特定的目的缓冲液l otussss ≅ ª离心 us °¬±o收集
沉淀悬浮后即得到纯化的质膜囊泡 o可用于各种标记酶和反应的测定 ∀
113 蛋白质含量的测定
参照 …µ¤±§©²µ§kt|zyl的方法 o测定时加入 s1st h的 ×µ¬·²±÷2tss ∀
114 各种标记酶的测定
t1w1t ∂ ’ p vw 敏感的 „×°¤¶¨ 活性k°  l 参照 ≥¤±§¶·µ²°kt|{zl ∀³‹y qx ∀ ‘¤v ∂ ’w浓度 t °°²¯r∀
t1w1u ‘’ p tv 敏感的 „×°¤¶¨ 活性k液胞膜l 参照 t1v1t ∀³‹z qx o‘¤‘’v浓度 xs °°²¯r∀
t1w1v 二磷酸次黄嘌呤酶kŒ⁄°¤¶¨ o高尔基体l 参照 Šµ¨ ±¨kt|{vl的方法 ∀
t1w1w 乙醇脱氢酶k„⁄‹l的测定k细胞质l 参照 • ¤¦®¨ µkt|xxl的方法 ∀
t1w1x 细胞色素¦还原酶的测定k内质网l 参照 ²µ§kt|{vl的方法 ∀
t1w1y 细胞色素¦氧化酶的测定k线粒体l 参照 ‹²§ª¨ kt|zwl的方法 ∀
用于各项测定的膜囊泡可在 ³‹yqx含 x °°²¯r×µ¬¶2  ¶¨os1ux °²¯r蔗糖的保存缓冲液中 pzs ε 保存 ∀
115 质膜氧化还原活性的测定
t1x1t 铁氰化物还原酶kƒ≤ • l的测定 在 t °反应体系中先加入 ts ∏ª膜蛋白 ou ∏x h ×µ¬·²±÷2
tss o处理 ts °¬±后加入反应缓冲液 }t °°²¯rŽvƒ k¨≤‘ly os1ux °²¯r蔗糖 ous °°²¯r ×µ¬¶2  ¶¨
k³‹z1sl o反应以加入 tss ∏°²¯r的 ‘„⁄‹ 启动 ovs ε 暗反应 us °¬±o转入冰浴终止反应 ∀wus ±°处
比色测定 Žvƒ k¨≤‘ly 量 o与对照相减即为被还原的 Žvƒ k¨≤‘ly 量 ∀空白不加膜 !Žvƒ k¨≤‘ly 及
‘„⁄‹ o对照不加 ‘„⁄‹ o其它条件相同 ∀
t1x1u ∞⁄× „2ƒ v¨ n还原酶的测定 在 t °反应体系中先加入 x ∗ ts ∏ª膜蛋白 ot ∗ u∏x h ×µ¬·²±÷2
tss o处理 ts °¬±后加入反应缓冲液 }s1ux °²¯r蔗糖 ous °°²¯r×µ¬¶2  ¶¨k³‹z1sl ox °°²¯r ª≤ u¯ o
xss ∏°²¯r∞⁄× „2ƒ v¨ n oxss ∏°²¯r…°⁄≥k¥¤·«²³«¨ ±¤·«µ²¯¬±¨ §¬¶∏¯©²±¬¦¤¦¬§l o反应以加入 uss ∏°²¯r
的 ‘„⁄‹ 启动 ovs ε 反应 us °¬±o转入冰浴终止反应 ∀xvx ±°处比色测定 ∞⁄× „2ƒ v¨ n与 …°⁄≥生成
的粉红色产物 ∀空白不加质膜 o其它条件相同 ∀
u 结果和分析
211 泡桐根细胞质膜的产率和纯度鉴定
由于木本植物根培养时间长 o比培养 t周左右即可取材的草本植物玉米新鲜根表面吸附的菌类和
杂质多 o我们在用预冷的蒸馏水漂洗后 o将其放入 s1t °°²¯r的 w ε 硫酸钙溶液中通气处理 o使根表
面的菌类和杂质与硫酸钙形成絮状沉淀 o取出根再用蒸馏水漂洗后匀浆破碎细胞 ∀根据木本植物根部
木质化程度高 o根内木质素和纤维素多的特点 o我们在取材时尽可能选较为幼嫩的根 o并将匀浆次数由
u ∗ v次增至 w ∗ x次 o使根细胞充分破碎 ∀参考有关文献草本植物水双相法分离采用的双相浓度选试
范围为 x1x h ∗ z1s h o一般在 y1s h ∗ y1x h k‹²§ª¨¶ ετ αλ. ,t|{yl ∀根据实验材料培养较为困难的实
际情况和双相浓度越高 o质膜收率越低的特点 o及前期初试结果 o采用了 y1s h和 y1v h两种双相浓度
分别进行质膜囊泡的分离和纯化 ∀此外 o针对初试中发现泡桐根酚含量较高 o氧化强烈 o在取材和操作
过程中根易褐变的情况 o我们在匀浆缓冲液中加入了抗氧化剂抗坏血酸和酚类的吸收和稳定剂 °∂ °° o
有效地减少了根的氧化作用 ∀鉴于木本植物根生长缓慢 o取材量少 o对以往第 t次水双相分离后弃之
不用的下相液用新的上相液进行了再回收 o使最终分离得到的质膜增加了约 trv o进一步提高了质膜的
xu 第 t期 洪剑明等 }水双相法分离泡桐幼苗根细胞质膜的研究
收率 ∀我们用 vs ª根分离出粗膜制剂后平均分成两份 o分别用 y1s h的葡聚糖 ×2xssk下相l !聚乙二醇
wsssk上相l和 y1v h的葡聚糖 ×2xssk下相l !聚乙二醇 wsssk上相l两种双相浓度分离纯化 o收集各自最
终的上相液进行蛋白含量和质膜纯度的测定 o结果见表 u !表 v ∀
表 2 两种水双相系统分离纯化质膜的产率和标记酶活性 ≠
Ταβ .2 Ψιελδ ανδ αχτιϖιτεσ οφ ϖαριουσ µαρκερ ενζψµεσ οφ ΠΜ βψτωο κινδσ µετηοδ οφ αθυεουστωο2πηασε
项目
Œ·¨°
特异部位
≥³¨ ¦¬©¬¦©µ¤¦·¬²±
y qs h的水双相
y qs h ¤´ ∏¨ ²∏¶·º²2³«¤¶¨
y qv h的水双相
y qv h ¤´ ∏¨ ²∏¶·º²2³«¤¶¨
细胞质膜的产率k°ª膜蛋白rtss ª鲜重根l
°  ¼¬¨ §¯k°ª³µ²·¨¬±rtss ª ƒ • µ²²·l x qxy| v1{xs
∂ ’ p vw 敏感的 „×°¤¶¨tl
∂¤±¤§¤·¨2¶¨±¶¬·¬√¨ „×°¤¶¨tl
质 膜
°  w{ qv xv1z
质膜的封闭性 ⁄¨ ªµ¨¨²©¶¨¤¯k h l  |s h  |s h
‘’ p tv 敏感的 „×°¤¶¨ul ‘’ pv ¶¨±¶¬·¬√¨ „× °¤¶¨ul 液泡膜 ײ±²³¯¤¶· s qssy s
二磷酸次黄嘌呤酶tl Œ⁄°¤¶¨tl 高尔基体 ª²¯ª¬¤³³¤µ¤·∏¶ { q|s v1vx
乙醇脱氢酶k„⁄‹lvl „ ¦¯²«²¯ §¨ «¼§µ²ª¨ ±¤¶¨vl 细胞质 ≤¼·²³¯¤¶¨ s s
细胞色素 ≤ 还原酶wl≤¼·≤ ’¬¬§¤¶¨wl 内质网 ∞• zu1|z xy qzy
细胞色素 ≤ 还原酶wl≤¼·≤ • §¨∏¦·¤¶¨wl 线粒体 ¬·²¦«²±§µ¬¤ s s
≠ ktl∏°²¯ °¬r°ª³µ²q«~kul ∏°²¯ °¬r°ª³µ²q°¬± ~kvl ∏°²¯ ‘„⁄‹r°ª³µ²q°¬± ~kwl∏°²¯ ≤¼·≤r°ª³µ²q°¬±q
表 3 经 613 h的水双相系统分离纯化后的质膜与粗膜制剂的纯度比较 ≠
Ταβ .3 Χοµ παρισον ον πυριτψ βψ 6 .3 % αθυεουστωο2πηασε. ΠΜ βετωεεν Μιχροσοµαλφραχτιον
标志酶
¤µ®¨ µ ±¨½¼°¨
特异部位
≥³¨ ¦¬©¬¦©µ¤¦·¬²±
粗膜制剂
¬¦µ²¶²°¤¯ ©µ¤¦·¬²±
y1v h的水双相
y qv h ¤´ ∏¨ ²∏¶·º²2³«¤¶¨
∂ ’ p vw 敏感的 „×°¤¶¨tl ∂¤±¤§¤·¨2¶¨±¶¬·¬√¨ „×°¤¶¨tl 质 膜 °  v{ qtv xv1z
质膜的封闭性 ⁄¨ ªµ¨¨²©¶¨¤¯k h l zz qsy h  |s h
t °°²¯r‘¤v ∂ ’w对 „×°¤¶¨tl的抑制k h l
Œ±«¬¥¬·¬²± ²± „×°¤¶¨tl ¥¼ t °°²¯r‘¤v ∂ ’w xu1sy h {x qv{ h
‘’ p tv 敏感的 „×°¤¶¨ul ‘’ pv ¶¨±¶¬·¬√¨ „×°¤¶¨ul 液泡膜 ײ±²³¯¤¶· s quv s
二磷酸次黄嘌呤酶tl Œ⁄°¤¶¨tl 高尔基体 Š²¯ª¬¤³³¤µ¤·∏¶ uv1|w v1vx
乙醇脱氢酶k„⁄‹lvl „ ¦¯²«²¯ §¨ «¼§µ²ª¨ ±¤¶¨vl 细胞质 ≤¼·²³¯¤¶¨ s s
细胞色素 ≤ 还原酶wl≤¼·≤ ’¬¬§¤¶¨wl 内质网 ∞• txy qzy xy qzy
细胞色素 ≤ 还原酶wl≤¼·≤ • §¨∏¦·¤¶¨wl 线粒体 ¬·²¦«²±§µ¬¤ x qwt s
≠ ktl∏°²¯ °¬r°ª³µ²q«~kul ∏°²¯ °¬r°ª³µ²q°¬± ~kvl ∏°²¯ ‘„⁄‹r°ª³µ²q°¬± ~kwl∏°²¯ ≤¼·≤r°ª³µ²q°¬±q
经分析比较表明 o使用 y1v h的水双相系统分离纯化的质膜蛋白收率略低于 y1s h的水双相系统分离
纯化的质膜蛋白 o但质膜的纯度和封闭性等指标均高于 y1s h的水双相系统分离纯化的质膜k质膜封闭性
的计算方法为 }加入 ×µ¬·²±÷2tss测得的 „×°¤¶¨ 活性减去未加 ×µ¬·²±÷2tss时的活性 o再除以加入 ×µ¬·²±÷2
tss测得的 „×°¤¶¨ 活性 o比值越大 o表明封闭性越高 o |s h说明比值大于 s1|l ~同时与未用水双相系统
分离之前的粗膜制剂比较 o质膜的纯度大幅度上升 o其它各种膜成分的含量大幅度下降 ∀质膜上具有较高
的细胞色素 ≤还原酶活性kxy1zy Λ°²¯ ≤¼·¦q°ªpt°µ²q°¬±ptl的原因是质膜上存在 ≤¼·°2wxs还原酶活性 o
能还原 ≤¼·¦o因而能测出较高的细胞色素 ≤还原酶活性k详见 ¤µ¶¶²± ετ αλ. ,t|{z ~°¤¯°ªµ¨± ετ αλ. ,t||s的
结果和讨论l ~相对于粗膜制剂 txy1zy Λ°²¯ ≤¼·¦q°ªpt°µ²q°¬±pt的值 xy1zy只占其大小的约 trv o说明粗
膜组分中的细胞色素 ≤还原酶成分已被除去大部分 ∀因此 oy1v h的水双相系统分离纯化的质膜已基本达
到了对草本植物质膜分离纯化的标准k≥¤±§¶·µ²° ετ αλ. ,t|{z ~ • ¤µ§ετ αλ. ,t|{| ~°¤¯°ªµ¨± ετ αλ. ,t||sl o适
于进一步在亚细胞水平上研究稳态营养苗木根细胞质膜的物质运输和氧化还原等特性 ∀在此基础上我们
测定了用水双相法分离的根细胞质膜氧化还原活性 o结果见表 w∀
表 4 泡桐根细胞质膜氧化还原活性 ≠
Ταβ .4 Αχτιϖιτψ οφ οξιδατιον2ρεδυχτιον ιν πλασµα µεµ βρανε οφ Παυλοωνια ροοτσ
项目
Œ·¨°
y1s h的水双相
y qs h ¤´ ∏¨ ²∏¶·º²2³«¤¶¨
y1v h的水双相
y qv h ¤´ ∏¨ ²∏¶·º²2³«¤¶¨
铁氰化物还原酶活性 „¦·¬√¬·¼ ²©©¨µµ¬¦¼¤±¬§¨ µ¨§∏¦·¤¶¨ ≠ tt1w{ ty qu
∞⁄× „2ƒ v¨ n还原酶活性 „¦·¬√¬·¼ ²© ∞⁄× „2ƒ v¨ n µ¨§∏¦·¤¶¨ ≠ wv1zt {v1vs
≠ °°²¯ ƒ u¨ n r°ª³µ²q«q
yu 林 业 科 学 vz卷
212 泡桐根细胞质膜的氧化还原活性和最适反应条件
经测定表明 o用 y1v h的水双相系统分离纯化的根细胞质膜其氧化还原活性显著高于用 y1s h的
水双相系统分离纯化的质膜 ∀由于二硫苏糖醇k⁄× ×l对 ƒ v¨ n的还原有影响 o我们在保存缓冲液中未使
用该成分 ∀对于两种氧化还原反应测定所需的质膜用量经比较确定 o铁氰化物还原酶活性测定以 ts
∏ª为宜 o∞⁄× „2ƒ v¨ n还原酶活性测定以 x ∏ª为宜 o这样既能节省质膜的用量 o又能得到理想的结果 ∀
去污剂 ×µ¬·²±÷2tss的用量对实验结果也有较大影响 o以 ×µ¬·²±÷2tss }膜蛋白 € ts ∗ txΒtk • r • l较为
合适k我们使用的是 tsΒtl ∀用于各项反应测定的质膜在分离纯化后最好分装成小管于 p zs ε k p us
ε 可保存 t个月l保存 o避免反复冻融对膜蛋白活性的影响 ∀
v 结论
通过对所提取的泡桐幼苗根细胞质膜蛋白质含量 !细胞器各项标记酶指标 !以及质膜氧化还原活
性的测定和比较分析 }确定了 y1v h的葡聚糖k⁄¨ ¬·µ¤±l×2xss和 y1v h的聚乙二醇k°∞Šlwsss为主组
成的两相系统分离的泡桐根细胞质膜具有较高的收率 !纯度和氧化还原活性 o质膜的封闭性大于 |s h o
其各项指标基本符合对细胞质膜进行生物学和生理生化功能研究的要求 ∀在匀浆介质中添加抗坏血
酸 !加大聚乙烯聚吡咯烷酮的用量 o对第 t次双相分离后下相液中剩余的质膜进行了再回收等对草本
植物水双相法分离细胞质膜技术的改进 o适合于木本植物泡桐根细胞质膜的分离纯化 ∀该方法的建立
为在细胞和分子水平上研究林木根系对离子吸收机理与生长发育的关系打下了基础 ∀
参 考 文 献
洪剑明等 q玉米根细胞质膜硝酸还原酶的研究 q植物学报 ot||x ovzktul }|uz ∗ |vv
洪剑明等 q玉米根细胞质膜硝酸还原酶与 ∞⁄× „2ƒ v¨ n还原酶活性的关系 q首都师范大学学报 ot||| ousktl }yt ∗ yx
贾慧君 !郑槐明 q兰考泡桐幼苗稳态矿质营养比较研究 q北京林业大学学报 ot||v otxkvl }tu ∗ tz
陈 珈 o王建华 q玉米根细胞膜铁氰化钾还原酶 q植物生理学报 ot||w ousktl }y| ∗ zy
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zu 第 t期 洪剑明等 }水双相法分离泡桐幼苗根细胞质膜的研究