全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（1）：9–16 http：// www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail：yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–08–26；修回日期：2013–11–08
基金项目：国家自然科学基金项目（31260468）；江西省自然科学基金项目（20114BAB214006）；江西农业大学科学研究基金项目
（CX201101）
* 共同第一作者
** 通信作者 Author for correspondence（E-mail：liuyongjxau@163.com；Tel：13879190369）
枳抗逆基因 PtrZPT2-2 的克隆与表达分析
刘德春*，吴 启*，王玥辰，刘山蓓，刘 勇**
（江西农业大学农学院园艺系，南昌 330045）
摘 要：通过电子克隆和 RT-PCR 法从枳[Poncirus trifoliata（L.）Raf.]中克隆到 1 个 C2H2 型锌指蛋
白家族基因，命名为 PtrZPT2-2。该基因编码 159 个氨基酸残基，预测蛋白分子量为 17.28 kD，等电点为
9.51。PtrZPT2-2 包含两个 C2H2 型锌指结构域，在其 C–末端含有一个转录抑制结构域 EAR/DLN-box
（DLNL）。PtrZPT2-2 与其他植物参与各种非生物胁迫反应的 C2H2 型锌指蛋白有较高的一致性。系统发
育树分析表明 PtrZPT2-2 与杨树 PtaZFP2，矮牵牛 ZPT2-12、ZPT2-13，拟南芥 ZAT12、ZAT7 亲缘关系较
近。半定量 PCR 分析表明，低温、高盐、干旱胁迫和 ABA 处理下枳叶、茎、根中 PtrZPT2-2 均被诱导上
调。PtrZPT2-2 可能在枳适应低温、高盐、干旱等非生物胁迫和 ABA 响应中起着重要作用。
关键词：枳；C2H2 型锌指蛋白；PtrZPT2-2
中图分类号：S 666 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）01-0009-08

Cloning and Expression Analysis of PtrZPT2-2 from Trifoliate Orange
（Poncirus trifoliata）
LIU De-chun*，WU Qi*，WANG Yue-chen，LIU Shan-bei，and LIU Yong**
（Department of Horticulture，College of Agronomy，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China）
Abstract：In the present study，a novel C2H2-type zinc finger protein gene，PtrZPT2-2，was cloned
from trifoliate orange by in silico and RT-PCR approaches. The PtrZPT2-2 encodes a protein of 159 amino
acid residues with a predicted molecular mass of 17.28 kD and an isoelectric point of 9.51. The PtrZPT2-2
protein contains two C2H2-type zinc finger domains，and a putative transcription repression domain
（EAR/DLN-box）at the C-terminus. Phylogenetic analysis showed that the PtrZPT2-2 clustered with
PtaZFP2，ZPT2-12，ZPT2-13，ZAT12 and ZAT7. PtrZPT2-2 shared high identity with other C2H2-type
zinc finger proteins involved in abiotic stress responses. Semi-quantitative PCR analysis showed that
expression of PtrZPT2-2 was upregulated by cold，salt，drought and ABA treatments in leaves，stems and
roots of trifoliate orange seedlings. Our data suggested that PtrZPT2-2 is a new member of the C2H2-type
zinc finger protein genes and may play an important role in response to cold，salt，drought and ABA
stresses in citrus.
Key words：trifoliate orange；C2H2-type zinc finger；PtrZPT2-2

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低温、干旱和高盐等植物生长中经常遭受的非生物胁迫严重限制了植物的生长发育、产量及地
理分布。为了抵御外界的非生物胁迫，经过长期的进化，植物形成了对各种非生物胁迫的应答机制，
这种应答机制都是通过相关胁迫功能基因表达的变化来实现。转录因子是一类可以调控下游胁迫功
能基因表达的蛋白，在植物非生物胁迫应答机制中起重要作用（Chinnusamy et al.，2004；Nakashima
et al.，2009）。
锌指蛋白（zinc finger protein，ZFPs）是一类具有“手指状”结构域的转录因子，其特征是通
过结合 Zn2+来稳定一种很短的可自我折叠成“手指状”的蛋白结构。根据半胱氨酸（cysteine，C）
和组氨酸（histidine，H）残基的数量和位置可将锌指蛋白转录因子分为 C2H2、C2HC、C2C2 等亚
类，其中 C2H2 型锌指蛋白研究较多（Wolfe et al.，2000；Laity et al.，2001）。植物 C2H2 型锌指蛋
白具有两个比较独特的结构特征：一是相邻两个锌指间的氨基酸数量较多，而且有较大的变化，而
大部分动物锌指蛋白的两个锌指间的氨基酸数较少；二是在锌指结构域中，与 DNA 的结合处存在
一段高度保守的氨基酸序列 QALGGH（Klug & Schwabe，1995）。
前人研究发现许多 C2H2 型锌指蛋白基因都与植物抗逆性相关，如大豆 SCOF-1 在冷胁迫下被
诱导表达（Kim et al.，2001）；矮牵牛 ZPT2-3 在寒冷和干旱时被诱导表达（Sugano et al.，2003）；
蒺藜苜蓿 MtZFP1 被证明参与脱落酸（ABA）、细胞分裂素、茉莉酮酸甲酯介导的应激反应（Xu & Ma，
2004）；大豆 SCTF-1 基因转入烟草后能够显著提高转基因烟草的耐冷能力（宋冰 等，2012）；水稻
ZFP182 参与植物 ABA 诱导的抗氧化防御机制，并且 ZFP182 的表达在 ABA 信号转导途径中受蛋
白激酶 MAKPs 的调控（Gao et al.，2012）；大豆 GmC2H2 基因的表达主要集中在根部，并受低温和
ABA 的诱导，将该基因转化拟南芥，转基因拟南芥抗逆性明显提高（单曙光 等，2011）；野生大豆
GsZFP1 基因在叶片中可以被 ABA、高盐和低温诱导表达，在根中被 ABA、低温和干旱诱导，另外
在拟南芥中超量表达该基因可以增加 CBF1、CBF2、CBF3、NCED3、COR47、RD29A、RAB18、P5CS、
RD22 等胁迫响应基因的表达量，并且提高了转基因植株抵御低温、干旱和高盐等环境胁迫的能力
（Luo et al.，2012；Tang et al.，2013）；Gao 等（2012）将菊花锌指蛋白基因 CgZFP1 转入拟南芥中，
发现在高盐和干旱胁迫下一些涉及渗透调节、氧化应激反应和离子平衡的基因在转基因拟南芥中表
达增强，证明了 CgZFP1 在植物高盐和干旱胁迫响应中起着重要的调控作用。
许多柑橘品种都不耐寒，低温常严重影响其产量。因此，抗寒性是柑橘育种重要的指标。枳是
常用的柑橘砧木，极耐寒，经冷驯化后可耐–26 ℃低温，对干旱、高盐等逆境胁迫也有一定的抗性，
若从中克隆一些抗逆基因导入栽培品种中，较其他植物外源抗逆基因更容易获得抗逆新品种。本研
究中从柑橘的抗逆种类枳中克隆出了一个新的 C2H2 型锌指蛋白基因，并使用半定量 PCR 的方法检
测了 PtrZPT2-2 在低温、干旱、高盐和 ABA 胁迫下的表达模式，为研究柑橘抗逆分子机制提供了新
的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与逆境胁迫处理
2012 年 7 月，将枳[Poncirus trifoliata（L.）Raf. ]种子播种于含有 7 g · L-1 琼脂，40 g · L-1 蔗糖，
pH 5.8 的 MT 培养基中，置于江西农业大学农学院园艺系实验室培养箱（25 ℃ ± 1 ℃，16 h 光照，
12 000 lx，8 h 黑暗）中培养。幼苗长到约 30 cm 时，移植到 Hongland 培养液中预培养 5 d，然后分
别进行低温、高盐、干旱和 ABA 处理。低温处理：幼苗转移到 4 ℃培养箱中培养；盐处理：幼苗
转移到含有 250 mmol · L-1 NaCl的Hongland营养液试管中；干旱处理：幼苗转移到含有 20% PEG6000
1 期 刘德春等：枳抗逆基因 PtrZPT2-2 的克隆与表达分析 11

的 Hongland 营养液试管中；ABA 处理：幼苗转移到含有 100 μmol · L-1 ABA 的 Hongland 营养液试
管中。幼苗（每个处理 10 个植株）的叶、茎、根分别在处理后不同时间点（0、0.5、1、3、6、12、
24、48 和 72 h）取样，液氮处理后–80 ℃超低温冰箱保存。
1.2 枳 RNA 提取及第一链 cDNA 合成
用 Trizol 总 RNA 提取试剂盒（Invitrogen，美国）提取枳叶、茎、根总 RNA。采用分光光度法
鉴定 RNA 质量，DNaseⅠ（Promega，美国）处理去除剩余的基因组 DNA。用 Reverse Transcriptase
M-MLV（RNase H-）试剂盒（TaKaRa，日本）合成第一链 cDNA，用于基因克隆和半定量 PCR 分
析。
1.3 PtrZPT2-2 基因克隆
通过检索 HarvEST-Citrus 数据库（http：//harvest.ucr.edu/）找到与植物 C2H2 型锌指蛋白家族基
因同源性很高的表达序列标签（EST）序列，数据库自动将这些 EST 序列拼接成一条一致性序列。
基于该一致性序列利用引物设计软件 Primer5 设计合成 1 对基因特异性引物 Ptrzpt2s（5′ACAAA
AGACAGTTGAGACAGC3′）和 Ptrzpt2a（5′CGAGGAAACGAACTCTATTAC3′），同时以枳叶片第
一链 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，获得 PtrZPT2-2 基因序列。PCR 扩增程序如下：95 ℃ 5 min；
95 30 s℃ ，60 ℃（退火温度）30 s，72 2 min℃ （35 个循环）；72 10 min℃ 。PCR 产物经回收、纯
化，与 PMD18-T 载体（TaKaRa，日本）连接，转化大肠杆菌感受态细胞 DH5α，蓝白斑筛选后挑
选白色阳性菌落，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
1.4 生物信息分析
利用 NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的 ORF Finder 程序预测 PtrZPT2-2 的开放阅读框，
并获得氨基酸序列。使用 Blast 程序在 GenBank 搜素与 PtrZPT2-2 蛋白同源性高的植物蛋白序列。
用 Jalview 软件进行蛋白多序列比对和一致性分析，MEGA4 软件构建系统进化树，ExPASy ProtParam
在线分析工具分析 PtrZPT2-2 蛋白的理化性质、蛋白质分子量和等电点。
1.5 PtrZPT2-2 的半定量 PCR 分析
以 Ptrzpt2s 和 Ptrzpt2a 为引物，半定量 PCR 检测枳叶、茎、根在低温、高盐、干旱和 ABA 处
理后 PtrZPT2-2 的表达模式。以柑橘 Actin 基因为内参，Actin 的扩增引物为 Actins（5′CCGACCGTA
TGAGCAAGGAAA3′）和 Actina（5′TTCCTGTGGACAATGGATGGA3′）。利用 2× easy Taq super mix
（北京全式金生物技术有限公司）进行 PCR 反应。PCR 反应体系包括 11 μL H2O，12.5 μL 2× easy Taq
super mix，0.5 μL 正义引物，0.5 μL 反义引物，0.5 μL 模板 cDNA。PtrZPT2-2 基因 PCR 程序为：
94 ℃ 预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min（25 个循环）；72 ℃再延伸
10 min。Actin 基因 PCR 程序为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min
（25 个循环）；72 ℃再延伸 10 min。每处理样品设 3 个生物学重复，1%琼脂糖凝胶电泳分析。
2 结果与分析
2.1 PtrZPT2-2 的克隆和序列分析
通过电子克隆和 RT-PCR 方法，从枳中克隆到 1 个新的基因，命名为 PtrZPT2-2（GenBank 登录
号：KF258893）。测序和生物信息学分析结果表明：PtrZPT2-2 cDNA 序列全长 778 bp，含有 477 bp
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的开放阅读框（Open Reading Frame，ORF），编码 159 个氨基酸的蛋白质，预测蛋白分子量为 17.28
kD，等电点为 9.51。对 PtrZPT2-2 编码的蛋白与其它类似蛋白的氨基酸序列进行一致性分析，结果
表明与杨树（Populus tremula × Populus alba）PtaZFP2（GenBank序列号CAQ64474.1），拟南芥（Arabidopsis
thaliana）ZAT12（CAA67232.1）、ZAT7（NP_190195.1），矮牵牛（Petunia × hybrida）ZPT2-11
（BAA21920.1）、ZPT2-12（BAA21921.1）、ZPT2-13（BAA21922.1），ZPT2-1（CAA43111.1）等
C2H2 型锌指蛋白一致性依次为 51.8%、50.90%、43.37%、37.37%、53.85%、52.69%、33.5%。
PtrZPT2-2 和其它植物 C2H2 型锌指蛋白的氨基酸序列的多重比对分析结果（图 1）表明：
PtrZPT2-2 蛋白序列含有两个保守的锌指蛋白结构域，每个结构域都包括一个植物特有的 QALGGH
序列。另外，在PtrZPT2-2蛋白C–末端还含有一个起转录阻遏作用的DLN-box/EAR结构域（DLNL）。

图 1 枳 PtrZPT2-2 与其他植物类似蛋白氨基酸序列比对
PtaZFP2：杨树（CAQ64474.1）；ZAT12：拟南芥（CAA67232.1）；ZAT7：拟南芥（NP_190195.1）；
ZPT2-11：矮牵牛（BAA21920.1）；ZPT2-12：矮牵牛（BAA21921.1）；ZPT2-13：
矮牵牛（BAA21922.1）；ZPT2-1：矮牵牛（CAA43111.1）。
Fig. 1 Sequence alignment between trifoliate orange PtrZPT2-2 and other PtrZPT2-2-like proteins from different plant species
PtaZFP2：Populus tremula × Populus alba（CAQ64474.1）；ZAT12：Arabidopsis thaliana（CAA67232.1）；
ZAT7：Arabidopsis thaliana（NP_190195.1）；ZPT2-11：Petunia × hybrida（BAA21920.1）；
ZPT2-12：Petunia × hybrida（BAA21921.1）；ZPT2-13：Petunia × hybrida（BAA21922.1）；
ZPT2-1：Petunia × hybrida（CAA43111.1）.

利用 MEGA4 软件构建了植物 C2H2 型锌指蛋白的系统进化树（图 2）。系统进化树显示，
PtrZPT2-2 与杨树 PtaZFP2、矮牵牛 ZPT2-12、ZPT2-13、拟南芥 ZAT12、ZAT7 等蛋白亲缘关系较近。

1 期 刘德春等：枳抗逆基因 PtrZPT2-2 的克隆与表达分析 13


图 2 PtrZPT2-2 与其它植物锌指蛋白系统进化树
Fig. 2 Phylogenetic tree of close homologues of the PtrZPT2-2 and other zinc finger proteins

2.2 PtrZPT2-2 的半定量表达分析
在叶片中，4 ℃低温处理 0.5 h 后，PtrZPT2-2 表达开始增强，此后基本维持在同一水平，并在
处理 24 h 后达到最大值，其后稍有降低；在茎中，低温处理 3 h 后，PtrZPT2-2 表达量开始逐步上
调，24 h 后达到高峰，随后略有减弱；在根中，低温处理 6 h 后，PtrZPT2-2 基因表达明显增强，随
后维持在这一水平直到处理 48 h 后达到最大值，处理 72 h 后表达略有下降（图 3，A）。
250 mmol · L-1 NaCl 处理 6 h 前，叶片中 PtrZPT2-2 表达几乎没有变化，处理 6 h 后表达水平明
显提高，并保持这一水平直到处理 48 h 后达到最大值，随后表达稍有减弱，但仍远高于处理前期；
在茎中，PtrZPT2-2 响应盐处理的时间较早，处理 1 h 后，表达就明显增强，之后保持这一水平直到
处理 24 h 后表达再度增强，并在处理 72 h 后达到最大值；在根中，盐处理 0.5 h 后表达即开始增强，
6 h 后再度提高，并在处理 24 h 后达到最大值，以后一直维持这个水平（图 3，B）。
在 20%PEG6000 模拟干旱处理 12 h 前，PtrZPT2-2 表达在叶片中一直处于较弱的水平，处理
12 h 后表达明显增强，此后一直维持在这一水平；在茎中，PEG6000 处理前期（0.5 ~ 6 h）PtrZPT2-2
表达量几乎没变化，处理 12 h 后，表达显著增强，并在处理 48 h 后达到最大，之后一直维持这一
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表达水平；在根中，PtrZPT2-2 对 PEG6000 的响应较早，处理 3 h 后，表达就明显增强，处理 6 h
后，表达再度增强，此后一直维持这一水平直到处理 72 h 后表达达到最大值（图 3，C）。
如图 3，D 所示，ABA 处理 3 h 后叶片中 PtrZPT2-2 表达开始增强，此后一直维持这一水平直
到处理 24 h 后达到高峰，随后表达量降低（48 ~ 72 h）；在茎中，ABA 处理前期（1 ~ 3 h）PtrZPT2-2
表达较弱，处理 6 h 后，表达增强，并在处理 24 h 后达到最大值，随后逐渐减弱；在根中，PtrZPT2-2
响应 ABA 速度较快，在处理根 1 h 后，表达即显著增强，此后一直保持这一水平（3 ~ 6 h），然后
在处理 12 h 后达到最大值，随后逐渐减弱（48 ~ 72 h）。
总之，低温、高盐、干旱和 ABA 处理后，PtrZPT2-2 在枳叶、茎、根中均表达上调，说明 PtrZPT2-2
可能在柑橘非生物胁迫反应中起着重要作用。

图 3 胁迫处理后 PtrZPT2-2 在枳叶、茎、根中的表达
Fig. 3 Expression pattern of PtrZPT2-2 in leaves，stems and roots in trifoliate orange after different stress treatments
3 讨论
研究表明，C2H2 型锌指蛋白基因在植物对非生物逆境胁迫应答中起重要作用。目前国内外有
关研究主要集中在拟南芥、矮牵牛以及水稻等模式植物中。本研究中从枳中分离出了一个新的 C2H2
型锌指蛋白基因 PtrZPT2-2，分析表明其含有两个锌指结构域，每个锌指结构域都包含有一个植物
特有的保守序列 QALGGH。有研究表明，QALGGH 序列与植物 C2H2 型锌指蛋白的 DNA 结合活性
有关（Takatsuji & Matsumoto，1996；Yoshioka et al.，2001）。另外，在 PtrZPT2-2 蛋白中还发现了 1
个保守的 EAR/DLN-box（DLNL）。目前报道的含有 EAR/DLN-box 的 C2H2 型锌指蛋白大多数具有
1 期 刘德春等：枳抗逆基因 PtrZPT2-2 的克隆与表达分析 15

转录抑制活性，在植物对非生物胁迫的防御反应中起着关键的作用。例如拟南芥 AZF1、AZF2、AZF3
和 STZ/ZAT10（Sakamoto et al.，2004；Kodaira et al.，2011），矮牵牛 ZPT2-3（Sugano et al.，2003），
烟草 ZFT1（Uehara et al.，2005）等锌指蛋白。然而，也有些植物的锌指蛋白虽然有 EAR/DLN-box，
却表现出转录激活活性，如水稻 ZFP179 和小盐芥 ThZF1（Xu et al.，2007；Sun et al.，2010）。因
此，需要进一步的试验来确定 PtrZPT2-2 是否作为 1 个转录抑制因子存在。
系统发育进化树分析表明，PtrZPT2-2与杨树 PtaZFP2，矮牵牛ZPT2-12、ZPT2-13，拟南芥ZAT12、
ZAT7 亲缘关系较近。杨树 PtaZFP2 与机械损伤、高盐、低温等环境胁迫有关（Coutand et al.，2009；
Martin et al.，2009）。拟南芥 ZAT12 表达受包括低温、高盐、干旱、高温、伤害、过氧化氢、光照
等多种非生物胁迫的诱导（Rizhsky et al.，2004；Davletova et al.，2005；Vogel et al.，2005）。拟南
芥 ZAT7 参与了拟南芥盐胁迫响应过程（Ciftci-Yilmaz et al.，2007）。以往的研究表明，许多植物
C2H2 型锌指蛋白是由不同的非生物胁迫诱导表达的。例如，水稻 ZFP182 表达是受冷、NaCl 和 ABA
诱导（Huang et al.，2007）；水稻 ZFP245 表达由干旱、冷诱导，但不受盐和 ABA 诱导（Huang et al.，
2009）；水稻 ZFP179 由 NaCl、PEG6000 和 ABA 处理诱导（Sun et al.，2010）。矮牵牛的锌指蛋
白基因 ZPT2-3 在冷和干旱诱导下表达（Sugano et al.，2003）。因此推测 PtrZPT2-2 表达也可能受非
生物胁迫调控。本试验结果显示，经低温、高盐、干旱和 ABA 胁迫处理后，PtrZPT2-2 在枳叶、茎、
根中均表达上调，说明该基因与柑橘抗逆胁迫响应有关。
综上所述，PtrZPT2-2 的生物信息学分析以及表达特性的分析结果表明，PtrZPT2-2 是植物 C2H2
型锌指蛋白家族基因的 1 个新成员，可能在枳响应低温、高盐和干旱胁迫的过程中起了重要的作用。

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