全 文 ：园艺学报，2015，42 (1)：149–156.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0769；http：//www. ahs. ac. cn 149

收稿日期：2014–10–28；修回日期：2014–12–30
基金项目：农村领域国家科技计划（‘863’）课题（2011AA100205）；国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-27）；
枳根cDNA全长文库的构建与分析
姚利晓，王金萍，何永睿，雷天刚，许兰珍，彭爱红，邹修平，陈善春*
（西南大学柑桔研究所，国家柑桔工程技术中心，国家柑桔品种改良中心，重庆 400712）
摘 要：为了解柑橘优良砧木枳（Poncirus trifoliata）根部的基因表达信息，利用 SMART 技术构建
了枳的根组织全长 cDNA 文库。检测结果显示所建枳根原始文库的容量为 1.08 × 106 cfu · mL-1，扩增后文
库容量为 1.30 × 109 cfu · mL-1，重组率为 95%。通过文库随机测序获得 182 个长度大于 100 bp 的 ESTs 序
列（GenBank 登录号为 JK316116 ~ JK316297），序列拼接后得到 96 个 Unigenes，包括 12 个 Contigs 和 84
个 singletons。其中，68 个 Unigenes 可与 GenBank 中登录的基因相匹配，56 个与已知的柑橘基因相匹配，
36 个为全长基因。对 24 个全长基因完成了功能注释，并进一步开展了生物信息学分析，发现有 6 个应激
反应基因和 3 个根发育相关基因。
关键词：枳；根；全长 cDNA 文库；表达序列标签；生物信息学分析
中图分类号：S 666 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）01-0149-08

Construction and Analysis of a Root Full-length cDNA Library of Poncirus
trifoliate
YAO Li-xiao，WANG Jin-ping，HE Yong-rui，LEI Tian-gang，XU Lan-zhen，PENG Ai-hong，ZOU
Xiu-ping，and CHEN Shan-chun*
（Citrus Research Institute，Southwest University；National Citrus Engineering Research Center；National Citrus
Improvement Center，Chongqing 400712，China）
Abstract：For understanding the gene expression information in roots of trifoliate orange（Poncirus
trifoliata），an excellent citrus rootstock，a full-length cDNA library was successfully constructed with the
root material. According to the quality analysis results，the library reached 1.08 × 106 cfu · mL-1 in capacity
with a recombinant efficiency as high as 95%. One hundred and eighty-two expressed sequence tags
（ESTs，GenBank No.：JK316116–JK316297）were obtained from 200 clones that were randomly
selected from the library，and then subjected to further assay. Among 96 unigenes obtained from those
ESTs，which included 12 contigs and 84 singletons，68 unigenes were homologous with the genes in
GenBank database while 56 unigenes were homologous with the citrus genes published. These unigenes
may have biology function such as binding，catalytic activity and so on，and may play important roles in
biology process such as cellular process，metabolic process，response to stimulus and so forth. Twenty-four
unigenes were annotated among the 36 genes with the open reading frame（ORF）and 9 genes might be
related with stress responsing or root developing.

重庆市基础与前沿研究计划项目（cstc2013jcyjA80009）；中央高校基本科研业务费专项资金项目（XDJK2013C105，XDJK2014A018）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：chenshanchun@cric.cn）
Yao Li-xiao，Wang Jin-ping，He Yong-rui，Lei Tian-gang，Xu Lan-zhen，Peng Ai-hong，Zou Xiu-ping，Chen Shan-chun.
Construction and analysis of a root full-length cDNA library of Poncirus trifoliate.
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Key words：Poncirus trifoliata；root；full-length cDNA library；expressed sequence tages；
bioinformatic analysis

枳（Poncirus trifoliata）是具有优良抗性的柑橘砧木之一，不仅耐寒，耐旱而且抗脚腐病、衰退
病、木质陷点病、溃疡病及柑橘线虫病等多种病害，因而在柑橘产区得到了广泛应用。了解枳的功
能基因，尤其是根部功能基因的表达信息将有助于更好地利用其优良性状。
为了解柑橘根中基因的表达信息，柑橘功能基因组项目（Citrus Functional Genomics Project，
CFGP）以克利曼丁、甜橙、枳橙、酸橙、酸橘等为材料，构建了 9 个根cDNA文库（Forment et al.，
2005），其EST的平均长度在 510.5 ~ 698.9 bp，Unigenes数为 141 ~ 1 595 个。其后，柑橘在非生物
胁迫下根中基因的表达情况受到关注，试验材料包括甜橙、柠檬、酸柚、枳柚和枳橙（Boscariol-
Camargo et al.，2007；Yang et al.，2012；de Ollas et al.，2013；Martinez-Cuenca et al.，2013；Lu et al.，
2014）。目前，虽然从枳中获得一些优良的抗逆基因，如PtCBF和耐寒相关的渗透压调节基因HOS1
（Champ et al.，2007；Wang et al.，2009；Liu et al.，2010；He et al.，2012）、耐旱相关的多胺合成
酶基因PtADC、蛋白激酶基因PtrMAPK等和一些耐旱相关转录因子基因PtsrMYB和PtrABF等（Huang
et al.，2010，2011；Wang et al.，2011；Sun et al.，2014）。但这些抗逆基因均来自于枳的叶片组织，
而非根组织，当枳作为砧木应用时这些基因的表达情况仍需要进一步研究。
本研究构建了枳根全长 cDNA 文库，并从中获得了一些新的抗逆相关功能基因和根发育相关基
因，为枳根特异表达基因的克隆和鉴定奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料及根RNA的提取
试验于 2009—2010 年在国家柑桔品种改良中心进行。枣阳小叶枳的果实取自国家果树种质重庆
柑桔圃，将种子剥去种皮，放在湿润的滤纸上 28 ℃催芽。萌发的种子移植于营养钵中，室温下培养，
植株生长约 10 cm 时，取枳的根尖 1 ~ 2 cm，流水洗净后剪碎，立即放于液氮中速冻保存。
按照植物总 RNA（小量）抽提试剂盒说明书提取枳根组织总 RNA。1%琼脂糖凝胶电泳检测总
RNA 的完整性，紫外分光光度计检测其纯度和浓度。
1.2 文库构建
取 1 μg 枳根总 RNA 作为模板，参照试剂盒操作程序进行反转录及 LD-PCR，分别在 LD-PCR 14、
16、18、20、22、24、26、28、30 个循环结束后取 5 μL 反应产物进行电泳检测。取 50 μL LD-PCR
产物，加入 2 μL 蛋白酶 K（20 g · L-1），于 42 ℃温育 20 min 去除 Taq 酶，纯化回收 cDNA。用 SfiⅠ
酶于 50 ℃酶切 2 h 产生黏性末端，加入 2 μL 1%的二甲基苯腈蓝，充分混匀。将酶切产物过 CHROMA
SPIN-400 柱，每管过柱收集物取 3 μL 电泳检测，将含 500 bp 以上 cDNA 片段的各管合并，重新进
行沉淀后溶解。取 5 μL cDNA 与 1.0 μL pDNR-LIB 载体 16 ℃连接过夜，热激转化感受态细胞 JM109，
所得菌液全部涂布于含氯霉素的 LB 平板。对构建好的枳根 cDNA 文库扩增后保存。
取 5 μL 原始文库依次做 10 倍梯度稀释，按下列公式计算文库容量（colony forming unit，CFU），
文库容量（cfu · mL-1）= 平板上的克隆数 × 稀释倍数 × 103/稀释菌液的铺板体积。
随机挑取 20 个克隆进行菌液 PCR 鉴定，所用引物为试剂盒所带的 M13 引物，菌液 PCR 扩增
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条件为 94 5 min℃ ；94 1 min℃ ，55 1 min℃ ，72 1 min℃ ，35 个循环；72 ℃延伸 10 min。阳性克
隆个数与总克隆数的百分比即为文库重组率。
1.3 序列测定和分析
随机挑取 200 个克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，去除测序结果中的载体
序列和引物序列。所有序列用 DNASTAR 软件进行序列比对和拼接。将所得到的 Unigenes 用
BLAST2GO 软件进行生物学功能注释和分类。利用 ORFFinder（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/
gorf. html）、ProtParam（http：//www. expasy. org/tools/protparam. html）、InterPro Scan（http：//www.
expasy. org/tools/protparam. html）、ScanProsite（http：//www. expasy. org/tools/scanprosite/）等软件对
全长基因进行生物信息学分析。
2 结果与分析
2.1 原始文库的获得
枳根总 RNA 琼脂糖凝胶电泳结果显示 28S 和 18S 条带清晰，其比例约为 2︰1，表明所提取的
RNA 完整性较好。紫外分光光度计检测结果 D260 nm/D280 nm为 1.96，显示 RNA 纯度较高，可用于全
长文库的构建。
分别取 LD-PCR 反应 14、16、18、20、22、24、26、28、30 个循环的产物，经电泳检测，发
现第24个循环结束时产物的泳带较亮。将24个循环结束时的LD-PCR产物用SfiⅠ酶切，过CHROMA
SPIN-400 柱去除小的片段，电泳结果表明第 5 ~ 8 管中含有大于 500 bp 的片段，将这 4 管的收集液
合并，用乙醇进行沉淀。
cDNA 产物与载体 pDNR-LIB 连接后转化感受态 JM109 细胞，获得原始文库。
2.2 文库容量和重组率
经测定，所构建枳根 cDNA 原始文库容量为 1.08 × 106 cfu · mL-1，扩增后文库容量为 1.30 × 109
cfu · mL-1。
从原始文库中随机挑取 20 个克隆进行菌液 PCR 检测，电泳检测结果（图 1）显示在随机挑取
的 20 个克隆中 19 个有扩增条带，计算所构建枳根 cDNA 文库的重组率为 95%。

图 1 文库插入片段和重组率检测
M：DNA marker DL2000；1 ~ 20：随机克隆 PCR 产物。
Fig. 1 Detection of inserted fragments and recombination efficiency by PCR
M：DNA marker DL2000；1–20：PCR products from random clones.

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2.3 文库分析
随机从枳根 cDNA 文库挑取 200 个克隆进行测序，得到 182 个长度大于 100 bp 的有效片段，插
入片段的平均长度为 560 bp。GenBank 登录号为 JK316116 ~ JK316297。
经序列拼接后，182 个 EST 组成 96 个 Unigenes，其中 12 个 Contigs，84 个 singletons。在这 96
个 Unigenes 中，共有 68 个可与 GenBank 中登录的基因相匹配，其中 56 个与已知的柑橘基因相匹
配，它们分别来源于克利曼丁（Citrus clementina）（51 个）、甜橙（C. sinensis）（2 个）、温州蜜柑（C.
unshiu）（2 个）和酸橙（C. aurantium）（1 个）。
GO 功能注释结果（图 2）显示，这些基因具有结合功能、催化活性、转运活性和转录因子等
生物学功能，参与细胞过程、代谢过程、应激反应、发育等生物学过程。




图 2 枳根全长文库部分 Unigenes GO 归类结果
1：细胞过程；2：代谢过程；3：应激反应；4：单个有机体过程；5：发育过程；6：定位；7：多细胞有机体过程；
8：生物学调节；9：繁殖过程；10：细胞成分构成；11：生长过程；12：信号传递；13：多个有机体过程；
14：结合功能；15：催化活性；16：转运活性；17：结构分子；18：转录因子；
19：分子修饰；20：细胞；21：细胞器；22：细胞膜；
23：大分子复合体；24：细胞间隙；25：膜封闭腔。
Fig. 2 Distribution of some Unigenes in the root library according to the GO consortium
1：Cellular process；2：Metabolic process；3：Response to stimulus；4：Single-organism process；5：Developmental process；
6：Localization；7：Multicellular organismal process；8：Biological regulation；9：Reproduction；
10：Cellular component organization；11：Growth；12：Signaling；13：Multi-organism process；
14：Binding；15：Catalytic activity；16：Transporter activity；17：Structural molecule activity；
18：Nucleic acid binding transcription factor activity；19：Molecular transducer activity；
20：Cell；21：Organelle；22：Membrane；23：Macromolecular complex；
24：Extracellular region；25：Membrane-enclosed lumen.

2.4 全长基因的生物信息学分析
在所构建枳根 cDNA 文库的 96 个 Unigenes 中，发现全长基因 36 个，占 37.5%。其中 24 个基
因完成了功能注释，并进一步开展了其生物信息学分析，其蛋白名称、开放阅读框长度、相对分子
量、理论等电点和参与的生物学过程见表 1。


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表 1 24 个与已知功能基因同源的全长基因
Table 1 Twenty-four unigenes homologous with known-function genes
单一基因
编号
Unigenes No.
GenBank
No.
蛋白名称
Protein name
基因长
度/bp
Length
ORF/
aa
理论分
子量/kD
MW
理论等
电点
pI
生物学过程
GO biological process
频次
Frequency
Contig 2 JK316196 MLP43 770 156 17.6 5.5 防御反应
Defense response，response
to biotic stimulus
4
Contig 6 JK316290 Dormancy associated
protein
1 278 152 17.2 9.1 果糖/葡萄糖/蔗糖应激反应
Response to fructose/
glucose/sucrose stimulus
1
Contig 8 JK316286 Two-component
response
regular ARR9
1 033 242 27.4 5.0 信号传递，转录调节
Signal transduction，
regulation of transcription
1
Contig 9 JK316181 Defender against
apoptotic death1
626 115 12.6 9.1 抗细胞凋亡
Anti-apoptosis
1
Contig 11 JK316173 O-methyltransferase 1 274 366 40.0 5.6 黄酮醇合成过程，木质素合
成过程
Flavonol biosynthetic process，
lignin biosynthetic process
1
Contig 16 JK316154 Nucleic acid binding 1 129 251 27.8 10.5 转录调节
Regulation of transcription
4
Contig 18 JK316131 Metallothionein-like
protein 1A
561 68 7.1 4.2 金属离子应激反应
Response to metal ion
3
Contig 21 JK316274 Coatomer delta
subunit
1 963 533 58.4 5.7 高尔基体内颗粒传递
Intra-Golgi vesicle mediated
transport
1
Contig 24 JK316220 DNA binding
protein
440 49 5.4 3.8 DNA 复制，根发育
DNA endoreduplication，root
development
1
Contig 25 JK316258 DNA binding
protein
436 51 5.6 4.1 DNA 复制，根发育
DNA endoreduplication，root
development
1
Contig 30 JK316287 DYL1 732 122 13.3 9.5 果糖/葡萄糖/蔗糖应激反应
Response to fructose/glucose/
sucrose stimulus
1
Contig 42 JK316187 Peroxidase 1 384 335 37.8 8.5 氧压力反应
Response to oxidative stress
1
Contig 47 JK316236 Zinc finger protein 990 172 18.3 8.0 生物学过程
Biological process
1
Contig 53 JK316251 DNA polymerase
epsilon P17 subunit
539 59 6.6 5.8 DNA 复制
DNA replication
1
Contig 60 JK316125 Cytochrome C
oxidase subunit Vb
639 165 18.2 5.7 翻译
Translation
1
Contig 66 JK316278 PhyH family protein 1 199 282 31.8 5.2 脂肪酸代谢
Fatty acid metabolic process
1
Contig 72 JK316256 Ubiquitin-binding
protein
689 159 18.0 4.7 复制后修复
Postreplication repair
1
Contig 73 JK316293 Nydroxyproline-rich
glycoprotein family
protein
743 131 14.5 8.7 植物细胞壁组成
Plant-type cell wall
organization
1
Contig 74 JK316270 Chaperon protein
DnaJ
1 524 216 24.0 4.9 低温反应
Response to very low light
intensity stimulus
1
Contig 77 JK316117 Flavonol synthase 1 160 337 38.0 5.9 类黄酮合成过程
Flavonoid biosynthetic process
1
Contig 82 JK316273 60S acidic ribosomal
protein
700 113 11.3 4.4 翻译
Translation
1
Contig 84 JK316172 Ubiquitin-like
protein 5
521 77 9.0 7.8 蛋白修饰
Protein modification process
1
Contig 87 JK316179 Alcohol
dehydrogenase
1 257 346 38.1 5.9 乙醇分解代谢过程
Alcohol catabolic process
1
Contig 88 JK316268 Profilin 825 131 14.1 5.0 肌 动 蛋 白 集 结 Actin
nucleation
1

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在这 24 个全长基因中，有 6 个与植物的应激反应相关，它们是主要乳液蛋白基因 Contig 2、休
眠相关蛋白基因 Contig 6、金属硫蛋白基因 Contig 18、DYL1 基因 Contig 30、过氧化物酶基因 Contig
42、DnaJ 编码基因 Contig 74；3 个与根发育相关基因，即 Profilin 编码基因 Contig 88 和 DNA 结合
蛋白基因 Contig 24、Contig 25。
随后，对编码蛋白质功能域进行了分析。Contig 2 编码 MLP43（major latex proteins）蛋白，具
有 Bet v 1 超家族蛋白的配体结合位点。Contig 6 编码休眠相关蛋白，有两个植物生长素的结合位点，
分别位于 5 ~ 33aa 和 81 ~ 150aa 区间，34 ~ 54aa 预测为跨膜区。Contig 8 编码蛋白具有反应调节结
构域（response regulatory domain）（51 ~ 187aa）和一个磷酸化位点（121aa）。Contig 11 编码甲基转
移酶，N 端具有二聚化区和与 DNA 结合的区域。Contig 16 编码蛋白属于 Alba（acetylation lowers
binding affinity）族蛋白，该蛋白可与 DNA 非特异性地紧密结合，在染色体构建和维持中可能具有
作用。Contig 21 编码蛋白的 285 ~ 533aa 为 MHD（Mu homology domain）结构域，是构成笼形蛋白
适配器（clathrin adaptors）的 mu 亚基，参与蛋白质的胞内运输过程。Contig 42 编码蛋白具有信号
肽（1 ~ 25aa）、4 对二硫键（42aa/121aa、75aa/80aa、127aa/325aa 和 206aa/233aa）、4 个钙离子结合
位点（200aa、249aa、252aa 和 257aa）、1 个铁离子结合位点（199aa）和 1 个质子受点（73aa），是
一种分泌型的过氧化物酶。Contig 47 编码蛋白具有两个锌指结构域 ZF_A20（12 ~ 46aa）和 ZF_AN1
（110 ~ 153aa），参与泛素化途径。Contig 60 编码蛋白具有三个锌离子结合位点（114aa、138aa 和
141aa）和信号肽区域（1 ~ 24aa）。Contig 66 编码 phytanoyl-CoA dioxygenase（PhyH），具有 Neuraxin
和 MAP1B 蛋白的特征位点（65 ~ 74aa），催化植烷酸 α 氧化的第 1 个步骤。Contig 73 编码蛋白具
有信号肽（1 ~ 39aa）和跨膜区（22 ~ 42aa）的结构。Contig 77 编码蛋白具有 3 个铁离子结合位点
（218aa、220aa 和 274aa）和一个 2–氧戊二酸的结合位点（284aa），参与类黄酮的合成。
3 讨论
本研究中以枳为材料构建了其根部组织的全长 cDNA 文库，在 24 个全长基因中发现的 9 个与
植物抗逆或根组织发育相关的基因，除金属硫蛋白基因（Contig 18）在柑橘中获得克隆（Endo et al.，
2007；Nishimura et al.，2013），其它 8 个基因 Contig 2、Contig 6、Contig 24、Contig 25、Contig 30、
Contig 42、Contig 74 和 Contig 88 在柑橘中尚无相关报道，下一步打算利用定量 PCR、转基因等技
术手段对其表达和功能进行深入研究。
主要乳液蛋白参与植物对生物或非生物逆境的防御反应，在高盐、低温、干旱等非生物逆境下，
其表达量在短期内迅速提高（Chen & Dai，2010；Sun et al.，2010）；在病原物诱导下主要乳液蛋
白基因的表达增强，与植物的抗病性相关（Chen & Dai，2010）。分析显示所获得的Contig 2 为主
要乳液蛋白基因，可能与枳抗逆性相关。
过氧化物酶是一类广泛存在于动物、植物和微生物中的活性物质，研究发现柑橘过氧化物酶基
因受转录因子PtrbHLHc的调控，与植物的低温抗性相关（Huang et al.，2013）；并且，在病毒侵染
后，柑橘过氧化物酶基因的表达上调（Rizza et al.，2012）。DnaJ是热激蛋白hsp40 家族（也称为J
蛋白家族）的成员，该家族的成员对hsp70 家族成员的活性具有调节作用，通过促进部分变性的蛋
白复性（重新折叠）来保护胁迫损害的细胞并使其恢复正常功能，在应对热激胁迫、盐胁迫、重金
属胁迫等方面具有作用。从枳根全长cDNA文库所获得的过氧化物酶基因Contig 42 和DnaJ基因可能
属于广谱的应激反应基因。
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休眠是多年生植物应对环境逆境的一种生理现象，果树的休眠突变体中，休眠相关蛋白基因的
表达降低，但这种下调似乎不能被顺式调节、启动子甲基化和内含子插入所解释（Saito et al.，2013）。
前期的研究发现，虽然梨PsDRM1 在休眠的腋芽中表达量高，但在其它非生长组织中表达也增强，
如在根中的表达量远大于根尖（Saito et al.，2013），这也能够解释为何能从枳根全长文库测序获得
两个休眠相关基因Contig 6 和Contig 30。
Profilin是一种单体肌动蛋白结合蛋白，也是一个多基因家族，在不同组织和发育时期特异表达，
其生物学功能复杂且呈多样性，在调控肌动蛋白纤丝聚合和解聚中具有双重作用（Sun et al.，2013）。
在十字花科植物和拟南芥的根毛中，Profilin和肌动蛋白在顶端和凸起部分形成一个顶冠，当根毛生
长终止时Profilin和肌动蛋白顶冠消失（Braun et al.，1999）。最近研究发现拟南芥PRF3 是一个组成
型表达的profilin基因，是根、下胚轴和根毛生长的重要负调节因子（Fan et al.，2013）。本研究获
得的Contig 88 编码profilin蛋白，也可能参与枳根的发育过程。另外，Contig 24 和Contig 25 属于DNA
结合蛋白基因，GO功能分类显示可能是与枳根发育相关的两个新基因。

References
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