全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（1）：89–98 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–08–26；修回日期：2013–11–18
基金项目：国家自然科学基金项目（31071461）；重庆市科技攻关项目（CSTC，201lAB1095）；重庆市自然科学基金项目（CSTC，
2011AB1095）；重庆市教委科学技术研究项目（CSTC，KJ130510，KJ110506，KJ130509，KJ130502）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：YingFanCai@gmail.com）
茎瘤芥AP2/EREBP转录因子基因BjABR1的克
隆和表达分析
向浏欣 1,2，夏玉先 1，蔡应繁 3,*，付于银 2，王小艳 2，刘吉军 2
（1 重庆大学基因工程研究中心，重庆 400030；2 重庆邮电大学生物信息学院，重庆 400065；3 河南大学生命科学学
院，棉花生物学国家重点实验室，河南开封 475001）
摘 要：以茎瘤芥（Brassica juncea var. tumida Tsen et Lee）‘永安’为材料，通过 RACE 和 RT-PCR
技术得到 1 个 AP2/EREBP 转录因子基因的 cDNA 全长序列和基因组 DNA（gDNA）序列，该基因与拟南
芥AtABR1基因的氨基酸序列相似性高达 72%，因此命名为BjABR1（GenBank登录号：JQ713825.1）。BjABR1
基因 gDNA 序列含 1 个内含子；cDNA 序列全长 1 514 bp，含有 1 个 1 146 bp 的开放阅读框（ORF），编
码 381 个氨基酸；其推定编码的蛋白分子量为 41.674 kD，等电点为 9.11，具有 14 个磷酸化位点，含 1
个典型的 AP2 DNA 结合域和 1 个 CMX-1 基序。洋葱表皮细胞的瞬时表达显示，BjABR1 蛋白定位于细
胞核。荧光定量 PCR 分析结果表明，该基因在茎瘤芥不同发育时期的根、茎、叶中均有表达，但在根中
表达量极高；在对茎瘤芥组培幼苗进行高盐、渗透压和低温 3 种非生物胁迫处理后发现，3 种胁迫均能诱
导该基因表达，但其对高盐的响应更为迅速。
关键词：BjABR1；茎瘤芥；基因克隆；表达分析；转录因子
中图分类号：S 637.3 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）01-0089-10

Cloning and Expression Analysis of an AP2/EREBP Transcription Factor
Gene BjABR1 in Brassica juncea var. tumida
XIANG Liu-xin1,2，XIA Yu-xian1，CAI Ying-fan3,*，FU Yu-yin2，WANG Xiao-yan2，and LIU Ji-jun2
（1Genetic Engineering Research Center，Chongqing University，Chongqing 400030，China；2College of Bioinformation，
Chongqing University of Posts and Telecommunications，Chongqing 400065，China；3State Key Laboratory of Cotton
Biology，College of Life Science，Henan University，Kaifeng，Henan 475001，China）
Abstract：The full length cDNA sequence and genomic DNA（gDNA）sequence of an AP2/EREBP
transcription factor family gene were cloned from Brassica juncea var. tumida Tsen et Lee‘Yong’an’by
RACE（rapid amplification of cDNA ends）and RT-PCR. Amino acid sequence alignment showed the gene
shared 72% similarity with a known Arabidopsis thaliana AP2/EREBP family gene，AtABR1，named after
BjABR1（GenBank accession No. JQ713825.1）. BjABR1 gene contained one intron and putatively encoded
381 amino acids with the protein molecular mass of 41.674 kD，the pI of 9.11，14 phosphorylation sites
and an AP2 DNA-bind domain and a CMX-1 motif. Subcellular localization assays showed that the

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BjABR1 protein appeared in the nucleus. Quantitative real-time PCR analysis revealed that BjABR1 gene
was expressed in root，stem and leaf，and highest in the root. The expression of BjABR1 was inducible
under salt stress，osmotic stress and cold stress，and its transcriptional responses subject to salinity was
most sensitive.
Key words：BjABR1；Brassica juncea；gene cloning；expression analysis；transcription factor

APETALA2/ethylene responsive element-binding protein（AP2/EREBP）蛋白是植物中一类多基因
家族转录因子，数量庞大，如拟南芥（Arabidopsis thaliana）中有 147 个 AP2/EREBP 基因（Feng et
al.，2005），毛果杨（Populus trichocarpa）200 个（Zhuang et al.，2008），水稻（Oryza sativa）163
个（Sharoni et al.，2010），黄瓜（Cucumis sativus）131 个（Hu & Liu，2011）。此类转录因子的主
要特征是含有 1 个或 2 个由 60 ~ 70 个高度保守的氨基酸残基组成的 AP2 DNA 结合域。根据 AP2
DNA 结合域的数量，AP2/EREBP 家族可划分为 AP2、EREBP 和 RAV，3 个亚家族。其中 AP2 亚
家族含 2 个 AP2 DNA 结合域，EREBP 亚家族含 1 个，而 RAV 亚家族除具有 1 个 AP2 DNA 结合域
外还具有一个 B3 DNA 结合域（Sakuma et al.，2002）。EREBP 亚家族基因数量最多，占据比重大，
如拟南芥中有 122 个（Feng et al.，2005），黄瓜有 103 个（Hu & Liu，2011），由此根据 AP2 DNA
结合域的序列相似性进一步将其划分为 CBP/DREB 和 ERF 两个亚族（Sakuma et al.，2002），且
CBP/DREB 亚族蛋白可以识别顺式作用元件 DRE/CRT 基序 A/GCCGAC（Yamaguchi-Shinozaki &
Shinozaki，1994；Kizis et al.，2001；Agarwal et al.，2006），ERF 亚族蛋白可以识别顺式作用元件
GCC 基序 AGCCGCC（Ohme-Takagi & Shinshi，1995；Hao et al.，1998；Zhu et al.，2010）。
前期研究表明 AP2 亚家族蛋白主要参与植物生长发育过程，如调控花、分生组织、胚珠和种子
发育（Jofuku et al.，1994；Imin et al.，2007；El Ouakfaoui et al.，2010；Kitomi et al.，2011）；EREBP
和 RAV 亚家族则主要在植物激素反应、生物或非生物胁迫应答（如冷、热、高盐、干旱）等方面
起作用，还调控很多基因的表达，如非生物胁迫反应基因、乙烯反应基因等（Nakashima et al.，2000；
Sohn et al.，2006；Bihani et al.，2011；Carvallo et al.，2011；Li et al.，2011；Mizoi et al.，2011；
Zhuang et al.，2011）。
茎瘤芥（Brassica juncea var. tumida Tsen et Lee），为榨菜的主要原料，是中国重庆、四川、浙
江等地区主要的经济作物之一。AP2/EREBP蛋白基因在多种植物，如拟南芥（Nakashima et al.，2000）、
高粱（Bihani et al.，2011）、番茄（Li et al.，2011），水稻（Kitomi et al.，2011）中已有克隆和功能
研究，但在茎瘤芥中还未见报道。作者前期对茎瘤芥瘤茎膨大前后的茎进行了转录组测序，获得了
一条被注释为 AP2/EREBP 家族成员的 399 bp 基因片段（Unigene140028_num2_yongan）（Sun et al.，
2012），于是本研究中利用RACE和PCR技术克隆了此基因的 cDNA全长序列和基因组DNA（gDNA）
序列，并对其进行了洋葱表皮细胞定位、时空表达模式分析和在外界胁迫条件下的反应研究，为进
一步研究该基因的功能奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
茎瘤芥品种‘永安’的种子购于重庆涪陵农业科学研究所。2012 年 10 月初播种于重庆邮电大
学校内试验基地，采集播种后 14 周未膨大和播种后 16 周刚膨大（即膨大初期）的茎瘤芥的根、茎、
叶，用无菌水清洗后立即于液氮中速冻，–70 ℃冰箱保存，每种样品 3 个生物学重复，用于 BjABR1
1 期 向浏欣等：茎瘤芥 AP2/EREBP 转录因子基因 BjABR1 的克隆和表达分析 91

基因时空表达模式分析。BjABR1 基因 cDNA 和 gDNA 克隆的材料为 2011 年播种的茎瘤芥膨大茎。
茎瘤芥种子经消毒后播种于 MS 培养基中室内培养（温度 27 ℃，光周期昼 14 h/夜 10 h）；1
周后无菌条件下取子叶接种于 MS + 3 mg · L-1 6-BA + 0.15 mg · L-1 NAA 培养基上继续培养；35 d 后
无菌条件下取幼苗于 MS + 0.15 mg · L-1 NAA 培养基上诱导生根；30 d 后对组培苗进行胁迫处理。
低温胁迫为将幼苗置于 4 ℃；高盐胁迫为对幼苗全株喷洒 300 mmol · L-1 NaCl 溶液；渗透压胁迫为
对幼苗全株喷洒 250 mmol · L-1 甘露醇（Mannitol）溶液。分别于处理后 0、2、4、6 和 12 h 取幼苗
叶片立即于液氮中速冻，–70 ℃冰箱保存，每种样品 3 个生物学重复，用于分析胁迫条件下 BjABR1
基因的表达。
宿主菌大肠杆菌（E. coli）DH5α、表达载体 pCAMBIA1302 为重庆邮电大学分子生物学实验室
保存。Trizol 购自 Invitrogen 公司；5′-Full RACE Kit 试剂盒、Plant DNA Isolation Reagent 试剂盒、
SYBR PrimeScriptTM Kit 试剂盒、M-MLV Reverse Transcriptase、Premix Ex Taq、pMD19-T 载体和
Dnase I 购自大连宝生物工程有限公司；DNA 纯化试剂盒和 DNA Markers 购自天根生化科技有限公
司。引物合成与 DNA 测序委托北京六合华大基因科技股份有限公司。
利用 Trizol 法提取已保存的茎瘤芥各个组织的总 RNA，DEPC 水溶解 RNA，用分光光度计测
定 OD260 和 OD280 数值，根据 OD260/OD280 值判断 RNA 的质量，用琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完
整性。
1.2 茎瘤芥 BjABR1 基因全长 cDNA 和 gDNA 的克隆
BjABR1 基因 3′端序列克隆：按照 M-MLV Reverse Transcriptase 说明书以 AP（表 1）为逆转录
引物将茎瘤芥膨大茎的总 RNA 逆转录为 cDNA 第 1 链。根据已知片段设计两条 3′RACE 上游特异
引物 GSP1 和 GSP2（表 1）。以 cDNA 为模板进行第 1 轮 PCR 反应，引物为 GSP1 和接头引物 AP1
（表 1），反应程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，32 个循环；72 ℃ 10
min。以第 1 轮产物为模板进行第 2 轮 PCR 反应，引物为 GSP2 和接头引物 AP1（表 1），反应程
序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35 个循环；72 ℃ 10 min。
BjABR1 基因 5′端序列的克隆：按照 5′-Full RACE Kit 试剂盒说明书将茎瘤芥膨大茎的总 RNA
逆转录为 cDNA 第 1 链。根据已知片段设计两条 3′RACE 下游特异引物 GSP3 和 GSP4（表 1）。以
cDNA 为模板进行第 1 轮 PCR 反应，引物为 5RACE Outer primer（5′-Full RACE Kit 试剂盒提供）
和特异引物 GSP3，反应程序为：94 3 min℃ ；94 30 s℃ ，55 30 s℃ ，72 90 s℃ ，30 个循环；72 ℃
10 min。以第 1 轮产物为模板进行第 2 轮 PCR 反应，引物为 5RACE Inner primer（5′-Full RACE Kit
试剂盒提供）和特异引物 GSP4。反应程序：94 3 min℃ ，94 30 s℃ ，58 30 s℃ ，72 80 s℃ ，30 个
循环；72 10 min℃ 。
应用 DNAMAN 对 BjABR1 基因的已知片段、3 端和 5 端序列进行拼接，并在 NCBI 网站上预
测其 ORF。从两端非编码区序列设计特异引物 GSP5 和 GSP6（表 1）扩增该基因。PCR 反应程序为：
94 3 min℃ ；94 30 s℃ ，58 30 s℃ ，72 80 s℃ ，35 个循环；72 10 min℃ 。
表 1 茎瘤芥 BjABR1 基因克隆及表达分析所用引物
Table 1 Primers used to isolate BjABR1 gene and analyze its expression in Brassica juncea
引物名称
Primer name
序列（5→3）
Primer sequence（5→3）
引物名称
Primer name
序列（5→3）
Primer sequence（5→3）
AP ATCTTGAGGCACGAGCGGCGCGACTAG-d(T)20 GSP1 ATTTTGCCCGTAAGACATGCTTCG
AP1 ATCTTGAGGCACGAGCGGCGCGACTAG GSP2 AGTTACTTGGAGTTGGCTCATCAC
ABR1-F ATTTCGCAGGCGGTAGTTCT GSP3 CTGGCTGATTCTGGCTTTGG
ABR1-R TCGGTATTCGCATTTGGTGT GSP4 GGTGATGAGCCAACTCCAAG
18S-F TCTGACGCAAGCACAACTA GSP5 AACCATCTGATAAAACTCTCCTCTC
18S-R TCTTCTCAGCTTTAGCCATT GSP6 CATTCAATTAAGAGGATGGGCT
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按照 Plant DNA Isolation Reagent试剂盒说明书提取茎瘤芥基因组 DNA。以基因组 DNA为模板，
用特异引物 GSP5 和 GSP6（表 1）进行 BjABR1 基因的 gDNA 序列扩增。PCR 反应程序为：94 3 ℃
min；94 30 s℃ ，58 30 s℃ ，72 3 min℃ ，35 个循环；72 10 min℃ 。
将所有 PCR 产物凝胶电泳后回收目的片段，与 pMD19-T 载体连接并转化 DH5α，重组质粒鉴
定后测序。
1.3 BjABR1 基因的生物信息学分析
采用 ProtParam、TMHMM、SignalP、KinasePhos、Psort 等程序对 BjABR1 基因进行理化性质和
序列结构分析。克隆序列经 GenBank 中的 BLAST 进行同源序列查找，采用 DNAMAN 软件进行同
源性比对；利用 Clustalx1.83 和 MEGA5.0 软件进行系统进化树的构建。
1.4 BjABR1–GFP 融合蛋白洋葱表皮细胞亚细胞定位
根据目的基因 BjABR1 序列及表达载体 pCAMBIA1302，设计引物，上游引物：CATGCCATGG
（NcoⅠ）ATGCGTGCCTTAAAAG；下游引物：GAAGATCT（BglⅡ）TTAAGAGGATGGGCTA 扩
增 BjABR1 基因。扩增产物用 NcoⅠ和 BglⅡ进行双酶切，同样 pCAMBIA1302 质粒也用相同酶进行
双酶切。目的片段回收以后，利用 T4 连接酶将两个酶切后的目的片段进行连接，从而完成
pCAMBIA1302-BjABR1 表达载体的构建。最后再将所获得的连接产物转化到大肠杆菌 DH5α 感受态
细胞中，经 PCR 扩增、酶切筛选和测序验证正确后，筛选阳性克隆并提取质粒。
构建好的表达载体通过基因枪轰击洋葱表皮细胞，以空载体 pCAMBIA1302 作为对照，轰击后
的洋葱表皮细胞 22 ℃暗培养 24 h 后在荧光显微镜下观察 BjABR1-GFP 融合蛋白的表达情况。
1.5 荧光定量 PCR 分析茎瘤芥 BjABR1 基因的表达
参照荧光定量试剂盒 SYBR PrimeScriptTM Kit 说明书，采用 Bio-Rad iQ5 荧光定量 PCR 仪，研
究 BjABR1 基因在茎瘤芥瘤茎膨大前和膨大初期的根、茎、叶中的时空表达模式，以及在不同胁迫
条件下随时间变化的表达情况。首先按照 M-MLV Reverse Transcriptase 说明书，用引物 Oligo（dT）12–18
将提取的用于表达分析的各组织的总 RNA 分别逆转录为 cDNA 第 1 链，并稀释 10 倍作为荧光定量
PCR 反应模板。根据已克隆的 BjABR1 基因 cDNA 序列在非保守区设计 1 对上下游特异引物 ABR1-F
和 ABR1-R（表 1），目的片段为 106 bp。内参为茎瘤芥 18S 基因，上下游引物分别为 18S-F 和 18S-R
（Sun et al.，2012）。荧光定量 PCR 扩增反应体系为：cDNA 模板 2 µL，2 times SYBR Premix Ex TaqTM
10 µL，上下游引物（10 µmol · L-1）各 0.4 µL，50 times ROX Reference Dye 0.4 µL，ddH2O 6.8 µL。
PCR 程序为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，40 个循环；95 ℃变性 1 min，58 至 95 ℃做
熔解曲线分析，每个循环增加 0.5 ℃，每个温度停留 10 s。每个样品设 3 次重复。
数据分析得到各个样品的 CT 值，采用 ΔΔCT 法计算相对定量，目标基因相对定量 = 2-ΔΔCT（Livak
& Schmittgen，2001）。
2 结果与分析
2.1 茎瘤芥 BjABR1 基因的 cDNA 克隆与序列分析
根据已知片段设计引物并经 RACE-PCR 扩增后，分别得到长度为 1 055 bp 的 5′末端（图 1，A）
和 484 bp 的 3′末端（图 1，B），拼接后得到 1 514 bp 全长基因序列；经 NCBI 的 ORF 预测其 3′ utr
和 5′ utr 长度分别为 214 bp 和 146 bp，CDS 长 1 146 bp，包含 381 个氨基酸的开放阅读框；从 3′ utr
1 期 向浏欣等：茎瘤芥 AP2/EREBP 转录因子基因 BjABR1 的克隆和表达分析 93

和 5′ utr 设计引物扩增的片段（图 1，C）为 1 299 bp，与预期大小一致，且测序结果与拼接序列一
致，说明成功获得该基因全长 cDNA 序列。Blast 在线比对得知其氨基酸序列含 1 个 AP2 DNA 结合
域，且与拟南芥 AP2/EREBP 家族 ERF 亚族 AtABR1 基因氨基酸相似性最高，达 72%，因此将该基
因命名为 BjABR1（GenBank 登录号：JQ713825.1）。
对 BjABR1 基因编码的氨基酸序列分析如下：ProtParam 程序推测其理化性质，蛋白分子式为
C1789H2804N546O595S6，相对分子量为 41.674 kD，等电点为（pI）9.11；不稳定参数为 51.7，属不稳定
蛋白（标准：40 以下为稳定蛋白）；相对含量较多的氨基酸是丝氨酸 Ser（13.9%，53 个），亮氨酸
Ala（8.1%，31 个），甘氨酸 Gly（7.3%，28 个）和苏氨酸 Thr（7.3%，28 个）；总的带负电荷残基
（Asp + Glu）为 37，总的带正电荷残基（Arg + Lys）为 41；脂肪指数 57.14，亲水性平均数–0.812，
为亲水性蛋白。SignalP 程序分析，BjABR1 蛋白不存在信号肽；TMHMM 程序推测该蛋白不存在跨
膜结构域，不属于跨膜蛋白；KinasePhos 程序预测其具有 14 个磷酸化位点，其中 11 个丝氨酸磷酸
化位点，2 个苏氨酸磷酸化位点和 1 个酪氨酸磷酸化位点；Psort 程序分析，其亚细胞定位最大可能
性为细胞核。

图 1 BjABR1 基因的 RT-PCR 和 RACE 扩增结果
M：DNA marker；A：5RACE 扩增产物；B：3RACE 扩增产物；C：BjABR1 编码区 PCR 产物。
Fig. 1 The RT-PCR and RACE amplification result of BjABR1 gene
M：DNA marker；A：Product of 5RACE；B：Product of 3RACE；C：Product of BjABR1 open reading frame.
2.2 茎瘤芥 BjABR1 基因的 gDNA 克隆与序列分析
以茎瘤芥基因组 DNA 为模板，BjABR1 基因 cDNA 两端非编码区序列设计的引物克隆得到
BjABR1 基因的 gDNA 序列。该序列从起始密码子序列（ATG）至终止密码子（TAA）共 2 000 bp
（GenBank 登录号：KF268453），包含 2 个外显子和 1 个内含子。2 个外显子的长度分别为 415 bp
和 731 bp；内含子的长度为 854 bp，位于第 139 个氨基酸密码子的第 1 个碱基之后；第 2 个外显子
含 AP2 DNA 结合域。
2.3 茎瘤芥 BjABR1 基因氨基酸序列同源性分析和系统进化树分析
BlastP 比对发现，BjABR1 基因与多种植物的 AP2/EREBP 基因具有同源性，与拟南芥相似性高
达 72%，但与其它植物的相似性较低，小于 50%。将这些植物的 AP2/EREBP 基因氨基酸序列用
DNAMAN 软件进一步进行多序列比对（图 2），发现它们除具有非常保守的 AP2 DNA 结合域（AP2
Domain）外，在N端还具有一个保守的氨基酸基序CMX-1（CMX-1 Motif），该基序是在拟南芥EREBP
亚家族蛋白的结构和进化分析（Nakano et al.，2006）中发现，但功能尚不清楚；其余部分氨基酸序
列变化非常大，因此导致 BjABR1 基因与除拟南芥外的其它植物的 AP2/EREBP 基因氨基酸相似性较
低。
94 园 艺 学 报 41 卷
利用 Clustalx1.83 和 MEGA5.0（邻接法）对 AP2/EREBP 蛋白进行进化分析表明，AP2/EREBP
蛋白的进化具有种属特征（图 3），豆科植物苜蓿、百脉根、鹰嘴豆和大豆聚为一支，其它科属植物
聚为另一支，其中茎瘤芥与拟南芥同为十字花科，亲缘关系最近，聚为一类，与茄科的番茄、蔷薇
科的苹果亲缘关系较近。

图 2 不同植物 AP2/EREBP 氨基酸序列的比对
（1）拟南芥；（2）蓖麻；（3）大豆；（4）番茄；（5）黄瓜；（6）茎瘤芥：Brassica juncea；（7）毛果杨；
（8）苜蓿；（9）苹果；（10）葡萄；（11）草莓。
Fig. 2 Comparison of amino acid sequences of AP2/EREBP from different plants
（1）Arabidopsis thaliana；（2）Ricinus communis；（3）Glycine max；（4）Solanum lycopersicum；（5）Cucumis sativus；
（6）Brassica juncea；（7）Populus trichocarpa；（8）Medicago truncatula；（9）Malus × domestica；
（10）Vitis vinifera；（11）Fragaria vesca ssp. vesca.
1 期 向浏欣等：茎瘤芥 AP2/EREBP 转录因子基因 BjABR1 的克隆和表达分析 95

图 3 不同植物 AP2/EREBP 氨基酸序列的系统发育树分析
Fig. 3 Phylogenetic analysis of amino acid sequences of AP2/EREBP from different plants

2.4 茎瘤芥 BjABR1 编码蛋白亚细胞定位
利用基因枪轰击洋葱表皮细胞后，使用共聚焦显微镜观察洋葱表皮细胞内绿色荧光蛋白基因的
表达情况。结果显示，表达 GFP 蛋白的空载体轰击洋葱表皮细胞后，整个细胞都有绿色荧光；而表
达 BjABR1-GFP 融合蛋白的 pCAMBIA1302-BjABR1 载体轰击洋葱表皮细胞后，只在细胞核内有绿色
荧光（图 4），表明该基因编码蛋白定位于细胞核，与之前的生物信息学分析结果一致，符合转录因
子的亚细胞定位特征。

图 4 BjABR1-GFP 在洋葱表皮细胞中的定位
Fig. 4 Subcellular localization of the BjABR1-GFP fusion protein in onion epidermal cells

2.5 茎瘤芥 BjABR1 基因的时空表达模式分析
采用荧光定量 RT-PCR 法，对 BjABR1 基因在茎瘤芥不同发育时期的根、茎、叶中的表达进行
相对定量分析。从图 5 可知，BjABR1 在茎瘤芥瘤茎膨大前和瘤茎膨大初期的各组织中均有表达，其
中根中的表达量非常高。说明其可能对茎瘤芥的生长发育，尤其是对根的发育或生理功能具有重要
作用。
96 园 艺 学 报 41 卷

图 5 BjABR1 基因的时空表达特性
Fig. 5 Spatiotemperal expression patterns of BjABR1 gene

2.6 茎瘤芥 BjABR1 基因在逆境条件下的表达分析
对茎瘤芥组培幼苗进行盐（NaCl）、渗透压（甘露醇）和低温（4 ℃）处理后，采用荧光定量
RT-PCR 法对 BjABR1 基因在幼苗叶片中的表达进行相对定量分析。从图 6 可知，BjABR1 在各胁迫
处理后的表达量均上升，NaCl 处理 2 h 达到最高，之后逐渐降低；甘露醇渗透处理 6 h 达到最高，
之后降低；4 ℃低温处理时间越长表达量越高。说明该基因可能参与茎瘤芥的胁迫反应，且对 NaCl
的反应更迅速。


图 6 不同胁迫下 BjABR1 的表达分析
Fig. 6 Expression analysis of BjABR1 in different stresses
3 讨论
AP2/EREBP 转录因子具有重要的生物学功能，其中 EREBP 亚家族蛋白主要参与植物激素和胁
1 期 向浏欣等：茎瘤芥 AP2/EREBP 转录因子基因 BjABR1 的克隆和表达分析 97

迫反应（Hao et al.，1998；Nakashima et al.，2000；Feng et al.，2005；Agarwal et al.，2006；Bihani
et al.，2011；Mizoi et al.，2011）。本研究从茎瘤芥中克隆了 AP2/EREBP 转录因子家族的 1 个基因
BjABR1，序列比对得知其具有 1 个 AP2 DNA 结合域，属于 EREBP 亚家族，与 EREBP 亚家族其它
基因氨基酸序列比对显示，AP2 DNA 结合域序列非常保守，与拟南芥 AtABR1 基因相似性最高，达
72%。
拟南芥 AtABR1 基因参与脱落酸（ABA）和高盐、高渗透压胁迫反应；AtABR1 缺失突变体中
ABA 和 NaCl 反应抗逆蛋白基因如 RD29A、RD29B、RD22 等的表达较野生型高，且在外源 ABA 和
渗透胁迫环境下突变体具有比野生型更高的 ABA 过敏症状，表现为种子发芽率更低，发芽后的根
及幼苗生长更缓慢（Pandey et al.，2005）。因此，AtABR1 在 ABA 和逆境反应途径中起的是负调控
作用，这是自 WRI1（Cernac et al.，2006）以来发现的第 2 个起负调控作用的 AP2/EREBP 基因。本
研究中对茎瘤芥组培幼苗进行高盐、渗透压和低温 3 种胁迫处理后发现，它们均能诱导 BjABR1 基
因的表达，说明该基因也参与胁迫反应，可能对植物的逆境适应过程起作用；同时，洋葱表皮细胞
瞬时表达显示 BjABR1 基因定位于细胞核，符合转录因子亚细胞定位特征。而 BjABR1 基因是否与
AtABR1 一样诱导抗逆蛋白基因的转录和在植物逆境反应中起负调控作用呢？本研究茎瘤芥
AP2/EREBP 转录因子 BjABR1 基因的克隆及逆境胁迫下的表达分析为进一步研究该基因在植物逆境
反应中的功能和分子机制奠定了基础。

References
Agarwal P K，Agarwal P，Reddy M K，Sopory S K. 2006. Role of DREB transcription factors in abiotic and biotic stress tolerance in plants. Plant
Cell Rep，25 (12)：1263–1274.
Bihani P，Char B，Bhargava S. 2011. Transgenic expression of sorghum DREB2 in rice improves tolerance and yield under water limitation. J Agric
Sci，149 (1)：95–101.
Carvallo M A，Pino M T，Jeknic Z，Zou C，Doherty C J，Shiu S H，Chen T H，Thomashow M F. 2011. A comparison of the low temperature
transcriptomes and CBF regulons of three plant species that differ in freezing tolerance：Solanum commersonii，Solanum tuberosum，and
Arabidopsis thaliana. J Exp Bot，62 (11)：3807–3819.
Cernac A，Andre C，Hoffmann-Benning S，Benning C. 2006. WRI1 is required for seed germination and seedling establishment. Plant Physiol，141
(2)：745–757.
El Ouakfaoui S，Schnell J，Abdeen A，Colville A，Labbe H，Han S，Baum B，Laberge S，Miki B. 2010. Control of somatic embryogenesis and
embryo development by AP2 transcription factors. Plant Mol Biol，74 (4–5)：313–326.
Feng J X，Liu D，Pan Y，Gong W，Ma L G，Luo J C，Deng X W，Zhu Y X. 2005. An annotation update via cDNA sequence analysis and
comprehensive profiling of developmental，hormonal or environmental responsiveness of the Arabidopsis AP2/EREBP transcription factor gene
family. Plant Mol Biol，59 (6)：853–868.
Hao D，Ohme-Takagi M，Sarai A. 1998. Unique mode of GCC box recognition by the DNA-binding domain of ethylene-responsive element-binding
factor（ERF domain）in plant. J Biol Chem，273：26857–26861.
Hu L，Liu S. 2011. Genome-wide identification and phylogenetic analysis of the ERF gene family in cucumbers. Genet Mol Biol，34 (4)：624–
633.
Imin N，Nizamidin M，Wu T，Rolfe B G. 2007. Factors involved in root formation in Medicago truncatula. J Exp Bot，58 (3)：439–451.
Jofuku K D，den Boer B G，Van Montagu M，Okamuro J K. 1994. Control of Arabidopsis flower and seed development by the homeotic gene
APETALA2. Plant Cell，6 (9)：1211–1225.
Kitomi Y，Ito H，Hobo T，Aya K，Kitano H，nukai Y. 2011. The auxin responsive AP2/ERF transcription factor CROWN ROOTLESS5 is
involved in crown root initiation in rice through the induction of OsRR1，a type-A response regulator of cytokinin signaling. Plant J，67：
472–484.
Kizis D，Lumbreras V，Pages M. 2001. Role of AP2/EREBP transcription factors in gene regulation during abiotic stress. FEBS Lett，498 (2–3)：
98 园 艺 学 报 41 卷
187–189.
Li C W，Su R C，Cheng C P，Sanjaya，You S J，Hsieh T H，Chao T C，Chan M T. 2011. Tomato RAV transcription factor is a pivotal modulator
involved in the AP2/EREBP mediated defense pathway. Plant Physiol，156 (1)：213–227.
Livak K J，Schmittgen T D. 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods，25
(4)：402–408.
Mizoi J，Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki K. 2011. AP2/ERF family transcription factors in plant abiotic stress responses. Biochim Biophys Acta，
1819 (2)：86–96.
Nakano T，Suzuki K，Fujimura T，Shinshi H. 2006. Genome-wide analysis of the ERF gene family in Arabidopsis and rice. Plant Physiol，140 (2)：
411–432.
Nakashima K，Shinwari Z K，Sakuma Y，Seki M，Miura S，Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki K. 2000. Organization and expression of two
Arabidopsis DREB2 genes encoding DRE-binding proteins involved in dehydration- and high-salinity-responsive gene expression. Plant Mol
Biol，42 (4)：657–665.
Ohme-Takagi M，Shinshi H. 1995. Ethylene-inducible DNA binding proteins that interact with an ethylene-responsive element. Plant Cell，7：
173–182.
Pandey G K，Grant J J，Cheong Y H，Kim B G，Li L，Luan S. 2005. ABR1，an APETALA2-domain transcription factor that functions as a repressor
of ABA response in Arabidopsis. Plant Physiol，139 (3)：1185–1193.
Sakuma Y，Liu Q，Dubouzet J G，Abe H，Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki K. 2002. DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of
Arabidopsis DREBs，transcription factors involved in dehydration- and cold-inducible gene expression. Biochem Biophys Res Commun，290
(3)：998–1009.
Sharoni A M，Nuruzzaman M，Satoh K，Shimizu T，Kondoh H，Sasaya T，Choi I R，Omura T，Kikuchi S. 2010. Gene structures，classification
and expression models of the AP2/EREBP transcription factor family in rice. Plant Cell Physiol，52 (2)：344–360.
Sohn K H，Lee S C，Jung H W，Hong J K，Hwang B K. 2006. Expression and functional roles of the pepper pathogen-induced transcription factor
RAV1 in bacterial disease resistance，and drought and salt stress tolerance. Plant Mol Biol，61 (6)：897–915.
Sun Q，Zhou G，Cai Y，Fan Y，Zhu X，Liu Y，He X，Shen J，Jiang H，Hu D，Pan Z，Xiang L，He G，Dong D，Yang J. 2012. Transcriptome
analysis of stem development in the tumourous stem mustard Brassica juncea var. tumida Tsen et Lee by RNA sequencing. BMC Plant Biol，
12：53.
Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K. 1994. A novel cis-acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought，
low-temperature，or high-salt stress. Plant Cell，6 (2)：251–264.
Zhu Q，Zhang J，Gao X，Tong J，Xiao L，Li W，Zhang H. 2010. The Arabidopsis AP2/ERF transcription factor RAP2.6 participates in ABA，
salt and osmotic stress responses. Gene，457：1–12.
Zhuang J，Cai B，Peng R H，Zhu B，Jin X F，Xue Y，Gao F，Fu X Y，Tian Y S，Zhao W，Qiao Y S，Zhang Z，Xiong A S，Yao Q H. 2008.
Genome-wide analysis of the AP2/ERF gene family in Populus trichocarpa. Biochem Biophys Res Commun，371 (3)：468–474.
Zhuang J，Sun C C，Zhou X R，Xiong A S，Zhang J. 2011. Isolation and characterization of an AP2/ERF-RAV transcription factor BnaRAV-1-HY15
in Brassica napus L. HuYou 15. Mol Biol Rep，38 (6)：3921–928.