全 文 ：园艺学报，2015，42 (4)：731–740.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0894；http：//www. ahs. ac. cn 731
收稿日期：2014–11–18；修回日期：2015–03–27
基金项目：国家‘863’计划项目（2011AA100208）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：gxjia@bjfu.edu.cn）
月季响应黑斑病的早期差异表达基因分析
刘瑞峰 1,2，刘 强 1，张非亚 1，袁晓娜 1，贾桂霞 1,*
（1 北京林业大学园林学院，花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室，国家花卉工程技术研究中心，北京 100083；
2中南林业科技大学林学院，长沙 410004）
摘 要：为了获得月季抗黑斑病的相关基因，探究月季抗病分子机制，以月季高抗黑斑病品种‘粉
和平’叶片为材料，采用单孢子离体接种法对其接种黑斑病菌，以接种 24、48 和 72 h 的 cDNA 等量混合
样为检测子，以相应对照的 cDNA 混合样为驱动子，构建抑制差减杂交文库。挑选 200 个阳性克隆进行
测序、BLASTx 比对分析，获得 37 条非冗余 EST 序列，其中 32 条序列在蛋白数据库中具有同源序列。
将获得的 EST 序列导入相应样本的转录组测序数据库，以其在两个样本中的 RPKM 比值作为基因相对表
达量。结果表明，接种病原菌后，上调表达基因涉及信号识别、离子转运、活性氧清除、光呼吸途径及
苯丙烷代谢等方面，其中以活性氧清除、光呼吸途径和苯丙烷代谢途径的基因数最多。这一结果说明月
季抗病是通过多基因的协同作用实现的，活性氧清除、光呼吸途径和苯丙烷代谢途径在月季抵抗黑斑病
菌过程中发挥重要作用。
关键词：月季；黑斑病；抑制差减杂交；活性氧清除；光呼吸；苯丙烷途径
中图分类号：S 685.12 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）04-0731-10

The Analysis of Differential Expression Genes for Rose Early Responding
to Black-spot Disease
LIU Rui-feng1,2，LIU Qiang1，ZHANG Fei-ya1，YUAN Xiao-na1，and JIA Gui-xia1,*
（1Beijing Key Laboratory of Ornamental Plants，Germplasm Innovation and Molecular Breeding，National Engineering
Research Center for Flowers，College of Landscape Architecture，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China；
2College of Forestry，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，China）
Abstract：Black-spot disease is the most serious disease for roses. In order to isolate the genes related
with the rose resistance and further to explore the interaction molecule mechanism between rose and
Diplocarpon rosae Wolf.‘Pink Peace’as the high resistance variety in the preliminary screening was
selected as the material，the cDNA of its inoculated leaves in 24 h，48 h and 72 h were mixed equivalently，
and the mixture was regarded as the tester，the cDNA mixture of non-inoculated leaves corresponding
hours were used as the driver. Based on these，the subtracted cDNA library were builted. A total of 200
positive clones were picked and  sequenced，and 37 non-redundant sequences were obtained. Among
them，32 ESTs showed similarity to known sequences in GenBank. Then，all 37 EST sequences were
imported to the database of transcriptome sequencing built with the samples of the same two mixtures，and
their RPKM ratios of the inoculated samples to non-inoculated ones were regarded as the gene relative

Liu Rui-feng，Liu Qiang，Zhang Fei-ya，Yuan Xiao-na，Jia Gui-xia.
The analysis of differential expression genes for rose early responding to black-spot disease.
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expression. The results showed that the genes including ion transport，reactive oxygen removal，
photorespiration and phenylpropanoid pathway and so on were up-regulated in the inoculated samples，and
the genes involved in photorespiration，reactive oxygen removal and phenylpropanoid pathway were
more，which suggested that multiple genes involved in the rose defending system. Among of them，reactive
oxygen removal，photorespiration and phenylpropanoid pathway are playing important roles in rose’s
resistance to black spot pathogen.
Key words：rose；black-spot disease；suppression subtractive hybridization；reactive oxygen removal；
photorespiratory；phenylpropanoid pathway

月季黑斑病（Diplocarpon rosae Wolf.）是一种危害性极大的世界性病害，多发生于温暖潮湿的
季节，以月季叶片、花瓣、茎部出现黑色斑点为主要特征，常引起叶片黄化、落叶、生活力降低，
植株死亡等问题，严重影响月季的观赏价值和商品价值，限制了其推广和应用。
目前对月季抗黑斑病机制的研究主要集中在垂直抗性方面。前人通过染色体加倍（Byme et al.，
1995；Khosravi et al.，2008）、图位克隆（Kaufmann et al.，2003）、分子标记（Yan et al.，2005；Hattendorf
& Debener，2007；Biber et al.，2010；Spiller et al.，2011）、杂交及抗病表型分离（Whitaker et al.，
2007，2010；Whitaker & Hokanson，2009）等多种方法对月季黑斑病抗病机制进行了研究，克隆得
到了个别抗病基因（Rdr1 和 Rdr3）（Biber et al.，2010；Whitaker et al.，2010），选育出了少量的抗
病材料，但是，对月季这种垂直抗性机制所介导的抗病信号途径的认识并不清楚，也很少从转录层
面对月季抗病性进行综合性的研究分析。
月季抗病性的最终体现是通过一系列基因的表达调控实现的，是多基因协同作用的结果。月季—
黑斑病菌早期互作基因体现了月季对病原菌效应子的识别、抗病信号级联传递及抗病防御系统的激
活等关键信息，获得这些信息能够有助于全面深入了解月季的抗病机制。本研究中利用抑制消减杂
交技术获得高抗品种‘粉和平’参与响应黑斑病菌的早期差异表达基因及上调表达基因，并根据差
异基因的注释分析、功能分类及相对表达量分析结果，分析月季早期抗病响应的相关分子机制，为
月季黑斑病抗病育种及黑斑病的综合防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
月季‘粉和平’是前期以单孢子离体接种法筛选获得的高抗黑斑病品种。‘粉和平’在筛选的
60 份材料当中，发病潜伏期为 13 ~ 15 d，发病率为 2%，病情指数 2.3，表现出较强的抗病能力。
1.2 病菌培养及接种
黑斑病菌（Diplocarpon rosae Wolf.）来自中国林业科学院微生物研究所菌种保藏中心，编号为
cfcc87205 的单一小种。接种孢子采用菌种复活后培养 20 d 的二代孢子（PAD 培养基，23 ℃下，80%
RH）。选择返青后生长 4 ~ 6 周健康无病植株 3 株，采集生长一致中等成熟的健康叶片，用湿报纸包
裹放入冰盒迅速带回实验室。先在自来水下轻柔冲净叶片表面尘土，再将其置于 2%的 NaClO 水溶
液中灭菌 4 min，无菌水冲洗 3 次。在无菌接种盘内铺两层用无菌水浸润的滤纸，将叶片置于接种
盘中（叶柄用湿润的无菌棉包裹）。采用 1 × 105 的孢子悬浮液全叶片喷施接种。接种后用透明的保
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图 1 总 RNA 电泳检测
C：对照；J：接种。
Fig. 1 The electrophoretogram of total RNA
C：Non-inoculation（Control）；J：Inocultation.

鲜膜将接种盘密封，置于 23 ℃，80%相对湿度的人工气候箱中（Yokoya et al.，2000）。分别于接种
后 24、48、72 h 取样（取样时间根据前期病菌侵入观测确定）。对照喷施无菌水。
1.3 总 RNA 的提取及 mRNA 纯化浓缩
取接种及对照叶片各 0.2 g，放入液氮中冷冻研磨。采用北京艾德莱生物科技有限公司（Aidlab
Biotechnologies Co.，Ltd）RNA38 试剂盒提取样品总 RNA。检测总 RNA 浓度及完整性，分别将 3
个时间点的接种及对照样品的总 RNA 等量混合。采用 Oligotex mRNA mini Kit（Qiagen，德国）获
得 mRNA，并保证其含量不低于 2 μg，真空冷冻仪干燥仪（Eppendorf 5301，美国）浓缩，–80 ℃
保存备用。
1.4 抑制差减文库的构建及插入片段鉴定
依照 PCR-Select cDNA Subtraction Kit（Clontech）的说明书进行 SSH 操作。以对照叶片 cDNA
为驱动子（Driver），以接种叶片 cDNA 为检测子（Tester）进行两次消减杂交和两次 PCR。将富含
差异表达序列的第 2 次 PCR 产物克隆到 pGEM-T Easy Vector（Promega，北京）上并转入感受态 E. coli
top10（Promega，北京）中进行氨苄抗性和蓝白斑筛选。随机挑取白色饱满的克隆于 96 孔细胞培养
板中，加入含 50 mg · L-1 Amp 的 LB 液体培养基 150 μL，37 ℃ 过夜，取 1 µL 菌液为模板，用
PCR-Select cDNA Subtraction Kit（Clontech）试剂盒给定的巢式引物（nested primer 1：5′-TCGAGCGG
CCGCCCGGGCAGGT-3′和 nested primer 2R：5′-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3′）进行菌落 PCR
并电泳检测。其余菌液加入甘油后液氮速冻，–80 ℃保存。抑制差减文库构建完成（乔金莲 等，
2011；王家保 等，2013）。
1.5 差异克隆 Blastx 分析、GO 注释及相对表达量分析
挑选差减杂交目标克隆送北京诺赛生物工程公司进行测序。所获序列去除载体和接头获得 EST。
在 E 值小于等于 1e-10 条件下，采用 NCBI（http：//www. ncbi. nih. gov）的 Blastx 在线序列比对工具
进行 Blast 分析。根据 the Gene Ontology（http：//www. geneontology. org/）进行基因 GO 注释。基
因表达量依据 Mortazavi 等（2008）的方法，将获得的 EST 序列带入相同样本的转录组测序数据库
计算获得，以 RPKM 接种/RPKM 对照表示。
2 结果与分析
2.1 总 RNA 及 mRNA 提取结果
琼脂糖电泳及微量核酸定量仪测定，提取
的总 RNA 28S 条带比 18S 条带亮两倍以上（图
1），清晰完整，未发生降解。经 Nano DropTM
2000c 测定，A260/A280 在 1.90 ~ 2.15 之间，质
量符合试验要求。mRNA 纯化后 A260/A280 为
2.1，mRNA 总含量为 2.4 ~2.6 μg（> 2 μg），可
以用于下一步试验。

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2.2 抑制差减杂交阳性克隆的重组子鉴定
挑取正向杂交 480 个菌斑进行菌落 PCR 筛选，发现差减的基因片段多数在 100 ~ 500 bp 之间，
集中在 100 ~ 400 bp 区段（图 2），考虑到片段太小会影响序列比对时的特异性及准确性，去除电泳
结果小于 150 bp 的克隆和无带克隆（占克隆总数的 58.33%），最终选择正向差减杂交 200 个阳性克
隆进行测序。

图 2 菌落 PCR 电泳检测
Fig. 2 The electrophoesis detection of colony

2.3 EST 序列 Blastx 分析和 GO 功能归类及相对表达量分析
对测序获得的序列进行 Blastx 比对，共获得 81 条 EST 序列，去除重复序列，最终获得已知功
能 EST 序列 32 条和未知功能 EST 5 条，获得的 37 条 EST 序列中，仅有 9 条 EST 的长度大于 500 bp，
而 500 bp 以下的序列占 75.67%（表 1）。

表 1 差异 EST 序列的 Blastx 比对
Table 1 Blastx alignment of differential EST clone
克隆编号
Clone
No.
同源基因
Matching sequence from database
登录号
Accession No.
长度/bp
Length
种属
Source of matching sequence
E 值
E value
YR1 类金属巯蛋白 Metallothionein-like protein AAW52725.1 593 草莓 Fragaria × ananassa 4e-20
YR2 类 TSJT1 蛋白 Stem-specific protein TSJT1-like XP_004291659.1 494 草莓亚种
Fragaria vesca subsp. vesca
2e-62
YR3 叶绿体结合蛋白 a/b
Chlorophyll a/b binding protein 3，chloroplastic
XP_007049480.1 493 可可树
Theobroma cacao
4e-43
YR4 葡萄糖转运蛋白
Putative glucose transport protein STP1
BAC81184.1 395 粳稻组
Oryza sativa Japonica Group
1e-52
YR5 叶绿体双半乳糖基甘油二酯
Digalactosyldiacylglycerol synthase 1，chloroplastic-like
XP_004303377.1 229 野草莓
Fragaria vesca subsp. vesca
2e-27
YR6 过氧化物酶体(S)–2–羟基酸氧化酶
Peroxisomal (S)-2-hydroxy-acid oxidase-like
XP_004294094.1 296 野草莓
Fragaria vesca subsp. vesca
7e-49
YR7 Cysteine proteinase 15A-like
类半胱氨酸蛋白酶 15A
XP_004291404.1 497 野草莓
Fragaria vesca subsp. vesca
8e-84
YR8 类 β–葡萄糖苷酶 24–假设蛋白
Beta-glucosidase 24-like hypothetical protein
XP_004151252.1 528 黄瓜
Cucumis sativus
3e-59
YR9 果糖–二磷酸醛缩酶细胞质同工酶
Fructose-bisphosphate aldolase cytoplasmic isozyme
EMS58841.1 389 乌拉尔图小麦
Triticum urartu
1e-39

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续表 1
克隆编号
Clone No.
同源基因
Matching sequence from database
登录号
Accession No.
长度/bp
Length
种属
Source of matching sequence
E 值
E value
YR10 V–型质子腺苷三磷酸 E（未被命名的蛋白产物）
V-type proton ATPase subunit E unamed protein product
XP_002274995.1 397 葡萄
Vitis vinifera
1e-83
YR11 保守 C–末端区域 2 同工酶
Evolutionarily conserved C-terminal region 2 isoform 2
EOY32242.1 633 可可树
Theobroma cacao
8e-43
YR12 泛素结合酶 Ubiquitin-conjugating enzyme ABQ41977. 222 白海桑 Sonneratia alba 3e-27
YR13 控制肿瘤变化蛋白同系物
Translationally-controlled tumor protein homolog
XP_004296846.1 448 野草莓
Fragaria vesca subsp. vesca
2e-42
YR14 丝氨酸–苏氨酸蛋白激酶 SRK2I
Serine/threonine-protein kinase SRK2I-like
XP_004232055.1 495 番茄
Solanum lycopersicum
6e-91
YR15 14-3-3 蛋白 14-3-3 protein 1-like XP_004250139.1 432 番茄 Solanum lycopersicum 1e-44
YR16 钾离子转运体 Potassium transporter XP_003629906.1 744 蒺藜苜蓿 Medicago truncatula 1e-97
YR17 腺苷三磷酸 H+转运酶 H+-transporting ATPase AAQ19041.1 261 尖叶菜豆 Phaseolus acutifolius 1e-35
YR18 Ribulose-1,5–二磷酸羧化/加氧酶
Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase
AEA48975.1 285 缫丝花
Rosa roxburghii
6e-34
YR19 叶绿体多酚氧化酶
Polyphenol oxidase F，chloroplastic-like
XP_004246033.1 562 番茄
Solanum lycopersicum
1e-73
YR20 (E)–橙花叔醇合成酶 (E)-nerolidol synthase AGB14626.1 197 苹果 Malus domestica 3e-20
YR21 肉桂醇脱氢酶 Cinnamyl alcohol dehydrogenase ADK63098.1 346 甘薯 Ipomoea batatas 2e-79
YR22 谷胱甘肽氧化酶 Glutathione peroxidase AGT80153.1 439 三浅裂叶牵牛 Ipomoea trifida 2e-117
YR23 HLH 超家族 DNA 结构域
Putative HLH DNA-binding domain superfamily protein
NP_001146644.1 689 玉米
Zea mays
6e-39
YR24 叶绿体碳酸酐酶 2
Carbonic anhydrase 2，chloroplastic-like
XP_004290540.1 425 野草莓
Fragaria vesca subsp. vesca
3e-12
YR25 同型半胱氨酸甲基转移酶 2 同工酶 2，部分
Homocysteine methyltransferase 2 isoform 2，partial
EOX94688.1 250 可可树
Theobroma cacao
1e-21
YR26 果糖–1,6–二磷酸醛缩酶
Putative fructose-1,6-biphosphate aldolase
CAD12665.1 715 小麦
Triticum aestivum
3e-61
YR27 腺苷二磷酸核糖基化表达因子
ADP-ribosylation factor，putative，expressed
ABF99503.1 151 粳稻组
Oryza sativa Japonica Group
7e-27
YR28 聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白
Polygalacturonase inhibitor protein
AAK43439.1 371 火棘
Pyracantha fortuneana
2e-28
YR29 N–氨甲酰–L–氨基酸水解酶类
N-carbamoyl-L-amino acid hydrolase-like
XP_002535756.1 586 野草莓
Fragaria vesca subsp. vesca
5e-25
YR30 叶绿体 ATP 蛋白水解酶亚基
ATP-dependent Clp protease proteolytic subunit
AFX67013.1 228 马铃薯
Solanum tuberosum
8e-78
YR31 线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶（泛醌）黄素蛋白 1
NADH dehydrogenase（ubiquinone）flavoprotein 1，
mitochondrial
EMT32185.1 329 山羊草
Aegilops tauschii
1e-38
YR32 渗透胁迫激活蛋白
Osmotic stress-activated protein kinase
AAL89456.1 324 烟草
Nicotiana tabacum
2e-54
YR33 假设蛋白 PRUPE_ppa015953mg
Hypothetical protein PRUPE_ppa015953mg
EMJ26301.1 604 碧桃
Prunus persica
4e-13
YR34 假设蛋白 PRUPE_ppa025539mg，部分的
Hypothetical protein PRUPE_ppa025539mg，partial
EMJ04478.1 265 碧桃
Prunus persica
1e-22
YR35 非特异膜蛋白 C2G11.09
Uncharacterized membrane protein C2G11.09-like
XP_004293515.1 265 野草莓
Fragaria vesca subsp. vesca
5e-18
YR36 非特异蛋白 LOC101313290
Uncharacterized protein LOC101313290
XP_004294478.1 413 野草莓
Fragaria vesca subsp. vesca
6e-63
YR37 非特异 LOC101312647 同工蛋白酶 2
Uncharacterized protein LOC101312647 isoform 2
XP_004302320.1 437 Fragaria vesca subsp. vesca
野草莓
1e-34

GO 功能分类表明，已知功能的 32 条 EST 中，参与生物过程有 8 条 EST，占 25.00%，组成细
胞成分构成的 EST 有 4 条，占 12.50%，解释分子功能的 EST 有 20 条，占 62.50%（表 2）。
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表 2 差异 EST GO 注释及相对表达量（RPKM）
Table 2 GO annotation and relative expression（RPKM）of differential EST clone
GO 注释 GO Annotation 克隆编号
Clone No.
基因相对表达量（RPKM 接种/ RPKM 对照）
Relative expression
（RPKMinoculation / PPKMnon-inoculation） GO No. 功能 Function
YR1 1.5290 GO：0005575 细胞成分 Cellular component
YR2 1.0050 GO：0005575 细胞成分 Cellular component
YR3 1.2340 GO：0009503 细胞成分 Cellular component
YR4 0.9750 GO：0005575 细胞成分 Cellular component
YR5 0.5200 GO：0008150 生物过程 Biological process
YR6 1.7897 GO：0008150 生物过程 Biological process
YR7 0.9658 GO：0008150 生物过程 Biological process
YR8 1.3023 GO：0008150 生物过程 Biological process
YR9 无限 Infinity GO：0008150 生物过程 Biological process
YR10 无限 Infinity GO：0008150 生物过程 Biological process
YR11 无限 Infinity GO：0071894 生物过程 Biological process
YR12 1.2570 GO：0008150 生物过程 Biological process
YR13 1.3890 GO：0003674 分子功能 Molecular function
YR14 无限 Infinity GO：0004674 分子功能 Molecular function
YR15 4.1690 GO：0071889 分子功能 Molecular function
YR16 1.6580 GO：0003674 分子功能 Molecular function
YR17 无限 Infinity GO：0000260 分子功能 Molecular function
YR18 1.9365 GO：0046863 分子功能 Molecular function
YR19 无限 Infinity GO：0004097 分子功能 Molecular function
YR20 1.6823 GO：0097008 分子功能 Molecular function
YR21 无限 Infinity GO：0045551 分子功能 Molecular function
YR22 无限 Infinity GO：0004602 分子功能 Molecular function
YR23 无限 Infinity GO：0043398 分子功能 Molecular function
YR24 1.6700 GO：0004089 分子功能 Molecular function
YR25 无限 Infinity GO：0008898 分子功能 Molecular function
YR26 1.7160 GO：0004332 分子功能 Molecular function
YR27 2.1760 GO：0030306 分子功能 Molecular function
YR28 1.0000 GO：0090353 分子功能 Molecular function
YR29 无限 Infinity GO：0050538 分子功能 Molecular function
YR30 无限 Infinity GO：0003824 分子功能 Molecular function
YR31 0.9630 GO：0003955 分子功能 Molecular function
YR32 无限 Infinity GO：0016909 分子功能 Molecular function
YR33 1.4860 – –
YR34 2.9220 – –
YR35 0.8680 – –
YR36 0.4230 – –
YR37 0.4690 – –

将所得到的序列带入相应样本的转录组测序数据库中获得其 RPKM 值，基因相对表达量表示为
RPKM 接种/RPKM 对照的比值并对其分析，结果表明：月季在接种黑斑病菌后，获得的多数 EST 的相
对表达量发生明显上调，主要涉及信号识别，包括 YR14（Serine/threonine-protein kinase SRK2I-like）、
YR15（14-3-3 蛋白）和 YR17（H+-transporting ATPase）；活性氧产生和清除，包括 YR31[NADH
dehydrogenase（ubiquinone）flavoprotein 1，mitochondrial]，YR1（Metallothionein-like protein）、YR19
（Polyphenol oxidase F，chloroplastic-like）和 YR22（Glutathione peroxidas）；光呼吸途径，包括 YR5
（digalactosyldiacylglycerol synthase 1，chloroplastic-like），YR6[Peroxisomal(S)-2-hydroxy-acid oxidase-
like]、YR18（Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase bisphosphate）；苯丙烷代谢途径，包
括 YR19（Polyphenol oxidase F，chloroplastic-like）、YR20[(E)-nerolidol synthase]和 YR21（Cinnamyl
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月季响应黑斑病的早期差异表达基因分析.
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alcohol dehydrogenase）。此外，离子转运蛋白 YR16（Potassium transporter），渗透胁迫蛋白 YR32
（Osmotic stress-activated protein kinase），YR23（putative HLH DNA-binding domain superfamily
protein）等在月季感病叶片中也显著上调表达。
这一结果说明众多基因参与了月季对黑斑病菌的响应，病原菌的侵入引起的是植物体内代谢活
动的连锁改变。植物首先通过信号识别和传导系统，识别病原菌释放的激发子并将信号传导出去，
活性氧的产生是月季受到病原菌胁迫的所发出的反应信号，而活性氧清除系统，光呼吸途径及苯丙
烷代谢途径的相关基因在此次差减中出现较多、且全部上调表达则表明其在月季抗黑斑病菌过程中
可能发挥着重要作用。
3 讨论
本试验中发现，差减试剂盒给定的限制性内切酶在月季 cDNA 中的酶切位点较多，得到的酶切
片段偏小。由于太短的差异片段在 Blastx 比对中的特异性和准确性较低，为了提高比对的特异性和
准确度，舍弃了近 60%的小片段信息，这在一定程度上减少了获得的差异基因的信息量。尽管通过
序列拼接软件可以补充部分信息，但同时也增加了试验的成本。因此，采用 PCR-Select cDNA
Subtraction Kit（Clontech）对月季乃至蔷薇属植物进行抑制差减杂交试验时，有必要考虑替换给定
的内切酶 RsaⅠ或缩短酶切时间，从而提高抑制差减杂交效率。
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族是细胞膜上的主要受体蛋白，参与植物激素传导与植物—病原菌互
作响应（郭泽建和蒋冬花，2005）。相关研究表明，丝氨酸/苏氨酸保守结构域在部分抗病同源序列
RGA 中承担对病原菌的识别功能（Xu & Deng，2010；Morel et al.，2014）。Chen 等（2013）通过
试验证明丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在高抗番茄中上调表达，而在敏感型番茄中下调表达。本试验中，
YR14（serine/threonine-protein kinase SRK2I-like）在病原菌诱导后上调表达，暗示着其可能承担着
月季对黑斑病菌激发子的识别功能。
病原菌激发子与植物细胞质膜上的受体专化识别后，首先引起植物受侵染部位细胞质膜的去离
子化与细胞内外的离子交换，由此产生跨膜离子流，钙信号等，激发下游的抗病反应。K 是植物的
大量元素，细胞内 K+浓度的改变极易导致细胞质膜内外产生电势差，细胞质膜内外的电势差异直接
调控细胞膜上钙离子信号通道，影响钙信号途径以及下游的抗病反应（Amtmann et al.，2008）。同
样，质膜 H+-ATPase 也是质膜上的质子泵，研究发现 H+-ATPase 参与植物对病原菌的识别反应，并
且动态调节植物—病原相关分子模式 PAMP（Pathogen-associated molecular pattern）（Elmore &
Coaker，2011）。14-3-3 蛋白在真核生物中高度保守，作为大多数蛋白质磷酸化和脱磷酸化的接头蛋
白，参与植物细胞凋亡，细胞信号传导及逆境调节等众多生理功能（文彬和王小菁，2004）。14-3-3
蛋白与 H+-ATPase 的结合能抑制 H+-ATPase C–末端的自我抑制功能，提高 H+-ATPase 的转运活性。
同时，14-3-3 蛋白够提高植物体 K+通道蛋白的活性，进而提高 K+离子的转运能力（Roberts et al.，
2002）。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶也是 14-3-3 蛋白的靶蛋白，在 14-3-3 蛋白作用下，丝氨酸/苏氨酸蛋
白激酶活性提高（Tzivion & Avruch，2002）。月季经黑斑病菌诱导后，YR14（serine/threonine-protein
kinase SRK2I-like），YR15（14-3-3 protein），YR16（Potassium transporter）及 YR17（H+-ATPase）
均上调表达，这可能暗示了它们在月季响应黑斑病菌过程中的协同作用。
半乳糖二酰基甘油（DGDG）是叶绿体类囊体膜的组成成分，半乳糖二酰基甘油合成酶
（digalactosyldiacylglycerol synthase）负责催化 DGDG 的合成，并稳定类囊体膜上光合系统Ⅱ（PS
Liu Rui-feng，Liu Qiang，Zhang Fei-ya，Yuan Xiao-na，Jia Gui-xia.
The analysis of differential expression genes for rose early responding to black-spot disease.
738 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (4)：731–740.
Ⅱ）放氧复合体，提高植物在逆境下的光合能力（Sakurai et al.，2007）。YR6[Peroxisomal (S)-2-hydroxy-
acid oxidase-like]是植物光呼吸途径的催化酶，Peroxisomal (S)-2-hydroxy-acid oxidase-like 能够增强
Rubisico 的加氧活性而抑制其羧化反应，从而起到反馈调节着植物的光合途径（http：//www. uniprot.
org/uniprot/B8AKX6）。本试验中 YR5（digalactosyldiacylglycerol synthase 1，chloroplastic-like）在月
季响应黑斑病菌过程中下调表达，这说明黑斑病菌的入侵在一定程度上对月季的 PSⅡ具有抑制作
用。叶绿体的 PSⅠ和 PSⅡ是植物体内活性氧的产生中心（Apel & Hirt，2004）。黑斑病菌对月季叶
绿体光合系统的破坏，极易造成叶绿体光合系统中的电子传递链被抑制，引起了电荷重组和电子渗
漏，最终导致了叶绿体活性氧（ROS）爆发（Kangasjärvi et al.，2012）。植物光合系统受到抑制，植
物对 CO2 的同化能力能力减弱，叶绿体内 Rubisco 加氧能力提高，植物光呼吸作用加强，在光呼吸
及过氧化物酶体的协同作用下，植物产生大量的 H2O2（Takahashi & Murata，2008）。H2O2 具有双重
作用，一方面能够引起植物细胞膜脂过氧化，造成植物细胞损伤，另一方面能够杀死病菌并激发植
物的抗病防御系统（Mittler et al.，2004；Kangasjärvi et al.，2012）。徐强（2007）发现光呼吸在刺
梨抵抗白粉病入侵中发挥重要作用。本试验中 YR5（digalactosyldiacylglycerol synthase 1，
chloroplastic-like）在感病叶片样本中下调表达，而 YR6[Peroxisomal (S)-2-hydroxy-acid oxidase-like]
和 YR18（ribulose-1,5- bisphosphate carboxylase/oxygenase bisphosphate）在感病叶片上调表达，表明
黑斑病菌对月季的光合系统具有抑制作用，光呼吸途径可能参与了月季对黑斑病菌的防御反应。
金属硫蛋白（metallothionein protein）是植物体内富含半胱氨酸的金属离子转运和结合蛋白，其
主要功能是调节植物体内金属离子的平衡和清除植物体内的活性氧。金属硫蛋白在清除活性氧的过
程中会释放一定量的金属离子，这些金属离子很可能在植物信号的级联传递中起作用（Hassinen et
al.，2011）。除 YR1（metallothionein protein）外，YR22（Glutathione peroxidase）和 YR19（Polyphenol
oxidase F，chloroplastic-like）在受黑斑病菌诱导后上调表达，这些现象表明黑斑病菌的侵入引起了
月季体内的氧爆发，激活了月季的抗氧化酶系统。
苯丙烷代谢途径负责植物木质素及次生代谢产物的合成，在植物抗病防御反应中发挥着重要的
作用（Dixon et al.，2002）。YR21（cinnamyl alcohol dehydrogenase）是控制木质素合成的一个关键
酶（Tronchet et al.，2010；Cheng et al.，2013）。苯丙烷的次生代谢会产生很多萜类、半萜类及酚类
物质，这些物质的生成能够在一定程度上抵御和限制病原菌的入侵。YR19（polyphenol oxidase F，
chloroplastic-like）能够催化苯丙烷途径中产生的酚类物质转化为对病原菌有毒害的醌类物质，限制
病原菌的生长（Vaughn & Duke，1984）。YR20[(E)-nerolidol synthase]主要负责催化(E)–4,8–二甲
基–1,3,7–壬三烯的合成，研究发现这种挥发性萜类化合物的生成和释放可能是植物自我保护的一
种机制，且主要受茉莉酸信号途径调控（Bouwmeester et al.，1999；Degenhardt & Gershenzon，2000；
Kappers el al.，2005）。YR19、Y20、Y21 同时在感病月季中上调表达，说明了苯丙烷代谢途径在月
季响应黑斑病菌入侵中发挥着重要，茉莉酸信号可能参与了月季对黑斑病的响应。
YR23（putative HLH DNA-binding domain superfamily protein）属MYB和BHLH（helix-loop-helix）
转录因子家族。植物体中 MYB 和 BHLH（helix-loop-helix）转录因子家族成员数量庞大，在功能上
也也形成了不同的分支。在抗病调控方面，MYB 和 BHLH 主要参与细胞壁建成，木质素合成，苯
丙烷代谢途径的调控以及抑制或者诱导激素调控的抗病防御反应（Feller et al.，2011）。Deluc 等
（2006）在葡萄中过量表达 VvMYB5a 转录因子，结果发现 VvMYB5a 对苯丙烷代谢有正调控作用，
转基因葡萄中苯丙烷代谢产物——酚类、木质素及丹宁酸等含量增加。YR23 的上调表达很可能是
通过正向调控苯丙烷代谢途径来抑制黑斑病菌的入侵。然而，Song 等（2013）发现病原菌的无毒基
刘瑞峰，刘 强，张非亚，袁晓娜，贾桂霞.
月季响应黑斑病的早期差异表达基因分析.
园艺学报，2015，42 (4)：731–740. 739

因可以通过激活 MYB 和 BHLH（helix-loop-helix）转录因子家族的部分成员，抑制植物茉莉酸信号
途径调控的抗性防御系统。月季黑斑病菌属于半活体营养型病原菌，植物对这类病原菌的主要抗性
途径因植物——病原菌物的互作形式不同而发生改变（Achuo et al.，2004）。如果茉莉酸信号途径参
与了月季抗黑斑病反应，MYC 和 MYB 转录因子的上调表达很可能是病原菌侵入植物的一种策略。
依靠目前的数据暂不能断定 YR23 在月季抗病反应中担任何种角色，茉莉酸信号途径很可能参与了
月季对黑斑病菌的响应，但其扮演的角色及具体功能还有待确定。

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