全 文 ：果 树 学 报 2012，29（6）: 990～996
Journal of Fruit Science
中国野生毛葡萄病原菌诱导响应 VqCOI1
基因的克隆及表达分析
牛 姣 1，2，周存田 1，2，王西平 1，2*
（1西北农林科技大学园艺学院·农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点开放实验室，陕西杨凌 712100；
2旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌 712100）
摘 要: 【目的】为了验证 COI1 基因在葡萄抗病防御机制中的作用，【方法】在前期通过抑制消减杂交技术（SSH）获得
中国野生葡萄毛葡萄株系‘商-24’ COI1 基因 EST 序列的基础上，采用 RT-PCR 从毛葡萄‘商-24’中分离到 COI1 基
因 cDNA 序列， 并通过实时定量 PCR 和半定量 PCR 分析了 COI1 基因的表达特异性，以期验证其在葡萄抗病防御机
制中的作用。 【结果】序列分析表明，VqCOI1 基因长 2 455 bp，编码 598 个氨基酸残基，相对分子量为 67.87 ku，等电
点为 5.85。 同源性分析表明，它与已克隆的大豆（Glycine max）COI1 基因（GenBank 登录号: AAZ66745.1）相似性最高
为 79%。实时定量 PCR 技术用来检测 VqCOI1 基因在受到病原菌侵染和激素处理时在抗病品种‘商－24’中的表达情
况，结果表明，在白粉菌诱导初期，抗病的毛葡萄株系‘商-24’ VqCOI1 基因表达量升高，这可能是因为它参与了病原
菌诱导的 JA 信号调节途径。 水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、乙烯（Eth）处理表明 VqCOI1 基因表达受激素分子调
节，这些信号分子可能交叉调节这一基因的表达。 在嫩叶、嫩茎、花、果皮、卷须等不同葡萄组织中的表达表明 Vq-
COI1 基因的表达具有空间差异性。 【结论】这些结果暗示着 VqCOI1 的表达响应病原菌侵染并受生物胁迫相关激素
的调控，很有可能在葡萄防御病原菌侵染的机制中发挥重要作用。
关键词: 中国野生葡萄； VqCOI1 基因； 克隆； 表达分析
中图分类号：S663．1 文献标志码：A 文章编号：1009－9980(2012)06－990－07
Cloning and expression analysis of a pathogen-responsive VqCOI1 gene in
Chinese wild Vitis quinquangularis
NIU Jiao1，2，ZHOU Cun-tian1，2，WANNG Xi-ping1，2*
（1College of Horticulture， Northwest A&F University， Key Laboratory of Horticultural Plant Biology and Germplasm Innovation in Northwest
China， Ministry of Agriculture， Yangling， Shaanxi 712100 China； 2State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas (Northwest
A&F University)， Yangling， Shaanxi 712100 China）
Abstrat: 【Objective】 The objective of the study is to verify the role of COI1 gene in grape disease resis-
tance. 【Method】Based on a EST sequence of COI1 gene in the subtractive suppression hybridization (SSH)
cDNA library from young leaves of Chinese wild Vitis quinquangularis clone ‘shang-24’ inoculated with
Uncinula necator (Schw.) Burr， we isolated the cDNA sequence of that COI1 gene using the RT-PCR
technology， which was designated as VqCOI1. Then we studied its expression patterns by Semi-Quantita-
tive RT-PCR and Quantitative RT-PCR， on the purpose of verifying its roles in grape disease resistance.
【Result】The sequence analysis indicated that the length of VqCOI1 was 2 455 bp， which encodes 598
amino acids， with a predicted molecular weight of 67.87 ku and the isoelectric point of 5.85. Multiple
Alignment of deduced amino acid sequence showed that it has the highest sequence similarity， approxi-
mately 79% similarity with other COI1 in Glycine max （GenBank acc.no: AAZ66745.1）.The qRT-PCR
showed that the expression of VqCOI1 was induced and increased in the early stages when inoculated with
U. nector in the resistant line ‘Shang-24’， which suggested that VqCOI1 might be involved in pathogen-
收稿日期： 2012－04－27 接受日期: 2012－08－14
基金项目： 国家自然科学基金（30871701， 31071782）
作者简介： 牛姣，女，在读硕士生，研究方向为果树种质资源与生物技术。 Tel: 029-87080307， E-mail：niujiao.2009@163.com
觹 通讯作者 Author for correspondence． Tel: 029-87082429， E-mail: wangxiping@nwsuaf.edu.cn
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2012.06.012
induced JA signal regulatory pathways. VqCOI1 was also regulated by Ethylene (Eth)， Methyl jasmonate
(MeJA) and Salicylic acid (SA)， and these signaling molecules may cross-regulate the expression of this
gene. VqCOI1 was also expressed differentially in leaves， stems， flowers， pericarps and tendrils. 【Con-
clusion】 These results revealed that VqCOI1 was a pathogen-responsive gene and it was regulated by cer-
tain biotic stress-related hormones， indicating it may play an important role in grape pathogen resistance.
Key words: Vitis quinquangularis； Clone； VqCOI1 gene； Gxpression analysis
牛 姣等: 中国野生毛葡萄病原菌诱导响应 VqCOI1 基因的克隆及表达分析
植物在自然条件下， 长期的生长发育过程中常
常受到周围环境中各种因子的刺激， 例如干旱、水
淹、高盐、低温、病毒、细菌和真菌等， 当植物受到病
原菌侵染时，随着植物与病原菌的长期互作，协同作
用， 已经进化出了许多防御抗性机制来抵抗病原微
生物的侵袭。 这种防御机制包括植物自身的一些生
理作用或化学障碍物以及病原物侵染植物后诱导植
物一系列防卫反应的发生。 许多植物的代谢过程都
是受到多种酶的合成与降解的平衡作用调控的，其
中， 植物通过泛素化途径对许多蛋白的降解过程在
植物的抗病反应中起着重要作用。 许多研究表明，
E3 泛素连接酶和相关蛋白的降解在植物信号转导
途径中起着重要作用， 并最终导致植物抗病性的发
生[1-2]。
病虫害的侵染会刺激植物体内的合成 JA 和
Eth，启动植物内源信号分子的调节，进而激活一些
病程相关蛋白的表达，各种途径相互交叉，使得植物
形成对病原菌的应激反应。 研究表明，JA 信号途径
在植物抗性调节中起着重要作用[3]。 COI1 基因是是
目前所发现的拟南芥茉莉酸信号传导途径中最重要
的调控基因。 它与植物的育性和抗性两类完全不同
的性状有关。 COI1 蛋白包含有一个 F-BOX 结构域
和不完整的富含亮氨酸重复结构域（LRR），它是一
个新的 F-BOX蛋白[4]。 它可以与 ASK1/ASK2、CUL1
和 RBX1 结合，形成 SCFCOI1 E3连接酶复合体[5]，这个
SCFCOI1 E3 复合物可以特异识别茉莉素信号转导途
径的一些调控因子， 使其泛素化而由 26s 蛋白体降
解， 从而开启下游基因的表达和下游茉莉素信号传
导，调控植物的生长发育和抗逆性。 在拟南芥 coil1
突变体发现后的十年中，一直没有找到 SCFCOI1的靶
蛋白。 直到 2007 年，3 个课题组分别利用不同的方
法同时发现了拟南芥中茉莉酸信号途径的重要调控
因子-JAZ蛋白[6]。 Thines等[6]利用了 JAZ1-GUS融合
蛋白证明了 JAZ 蛋白为 SCFCOI1的底物。 Yan 等 [7]采
用生物芯片技术进一步证明了这种蛋白质是茉莉酸
响应基因的负调控因子。 由于它特有的 jas 保守结
构域， 它可以通过 COI1 介导的植物泛素化途径调
节植物早期抗性反应和诱导植物抗病性 。 目前，
COI1 在葡萄等单子叶植物中的分子机制尚不清楚。
由于葡萄白粉病[Uncinula necator （Schw.） Burr]在世
界范围内的严重危害性， 为了深入了解葡萄抗白粉
病分子机理， 项目组在前期构建了接种与未接种白
粉菌的高抗白粉病的中国野生葡萄毛葡萄株系‘商-
24’ SSH 文库，获得了 COI1 基因的 EST 序列（Gen-
Bank number: JK266496）。我们就是在此基础上，采用
RT-PCR技术克隆了中国野生葡萄 COI1 基因，并进
行表达分析， 为进一步深入了解 COI1 基因的生物
学功能奠定基础。
1 材料和方法
1.1 葡萄材料与处理
高抗葡萄白粉病的中国野生毛葡萄（Vitis quin-
quangularis）‘商-24’取自西北农林科技大学葡萄种
质资源圃 。 选取感染白粉病的欧洲葡萄佳利酿
（Carignan）叶片，用压片法接种该病原菌于正常生长
的抗病材料‘商-24’，分别于接种后 0 h、6 h、12 h、24
h、48 h、72 h和 120 h取样， 每个取样点上同时取未
接种商-24 幼叶为实验对照组， 叶片采后迅速置于
液氮罐带回实验室-80℃冻存。
以抗葡萄白粉病的中国野生毛葡萄 ‘商-24’为
材料，将 SA （100 μmol·L-1）、Eth（50 μmol·L-1）、Me-
JA（0.5 g·L-1）3 种激素溶液分别用喷壶均匀喷洒于
叶片表面，同时喷蒸馏水作为对照，选取 0 h、 0.5 h、
1 h、3 h、6 h、12 h、24 h 及 48 h 8 个时间段分别采
样，将采集的叶片迅速放入液氮中冷冻，并将其带回
实验室于-80℃保存。
采集毛葡萄‘商-24’嫩叶、嫩茎、花、果皮、卷须
不同组织，迅速置于液氮罐带回实验室-80℃冻存。
1.2 总 RNA提取与 cDNA第 1链合成
葡萄叶片总 RNA的提取参照张今今等[8]改进的
SDS 酚法， 葡萄叶片总 RNA 的纯化参照王西平 [9]的
方法进行。 取 RNA 1 μL（浓度为 1 g·L-1），1.0%琼脂
糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性。 其中，用于 RT-
PCR 和 Real-time PCR 技术的第 1 链 cDNA 的合成
6 期 991
果 树 学 报 29 卷
按照 TaKaRa公司反转录试剂盒进行。
1.3 中国野生毛葡萄 COI1基因克隆
以目的 EST 序列为探针对 NCBI GenBank 数据
库的欧洲葡萄（Vitis vinifera）的 dbEST 数据库进行
Blast 分析， 获得与信息探针一致的基因序列。 用
Primer 5.0 软件根据该序列的开放阅读框设计引物
（COI1 -F1：5’ -ATAGGATCCATGATCCGCGCCTG -
3’， COI1 -R1：5’ CGCGGTACCCTACAACGTAAG
AAA AG -3’）， 以 U. necator 诱导后 72 h 的毛葡萄
叶片 cDNA第 1链为模板进行 PCR。回收目的片段，
克隆测序。PCR扩增体系：模板 1 μL，2.5 μL 10×Taq
Reaction Buffer，1.5 μL 10 mmol·L-1 dNTPs，1 μL 10
μmol·L-1上下游引物，0.3 μL Taq Polymerase， 无菌
水补足至 25 μL。 扩增程序: 94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，
58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，25 个循环；72 ℃ 5 min，4 ℃保
存。 PCR产物在 1%琼脂糖凝胶中电泳检测，凝胶成
像分析系统进行拍照及分析。 采用 Omega公司的琼
脂糖凝胶回收试剂盒纯化目的片段， 然后将纯化的
片段连接到 pGEM-T Easy载体进行克隆测序。
1.4 VqCOI1基因序列分析
将获得的序列用 Blastp（http://blast.ncbi.nlm.nih.
gov/Blast. cgi） 程序在 NCBI网站通过同源性比对验
证基因的完整性。用 ProtParam程序预测克隆得到基
因所编码产物的蛋白质一级结构、分子量和等电点。
利用 CLUSTALW（http: //align. genome. jp/clustalw/）在
线分析软件对不同物种的 COI1 基因进行进化树分
析。
1.5 VqCOI1基因表达分析
根据 VqCOI1的 cDNA序列设计定量 PCR引物
（COI1-F2：5’-AGATGAGGGGCTGTTGCTTC-3’，和
COI1-R2：5’- TCTATACCCTTGCACCCACAAA -3）。
分别取不同处理时间点的叶片组织总 RNA 各 1 μg
为模板， 反转录成 cDNA，cDNA 的合成按照 Prime-
ScriptTM RT Reagent Kit（Perfect Real Time）的说明
书操作。 利用荧光染料法进行荧光定量 PCR 反应，
以葡萄 Actin 基因 （GenBank 登录号：AY680701）作
为内参， 其引物为 Actin-F：5’-GAT TCT GGT GAT
GGT GTG AGT-3’ 和 Actin -R：5’ GAC AAT TTC
CCG TTC AGC AGT -3’，采用 20 μL PCR 体系，包括
10 μL 2 ×SYBR Green Mix，1 μL cDNA，0.8 μL 10
μmol·L-1上、下游引物，补水至总体积 20 μL。 PCR
反应程序为 94 ℃ 3 min； 94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃
60 s，40 个循环；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。 操作步骤参
照 SYBRPremixExTaqTM（PerfectReal Time）（TaKaRa
公司）的操作说明书进行，每个样品设 3 次重复。 通
过 ABI 7500 Fast Real-Time PCR System 的SDSShell.
exe分析系统分析 VqCOI1的相对表达量。
1.6 VqCOI1基因在不同组织中的表达
以 1.5 的引物为条件，取嫩叶、嫩茎、花、果皮、
卷须等不同组织总 RNA 各 1 μg 为模板， 反转录成
cDNA，cDNA 的合成按照 PrimeScriptTM RT Reagent
Kit （Perfect Real Time） 的说明书操作。 采用 20 μL
PCR 体系，包括 9.8 μL PCR Mix，1 μL cDNA，0.8 μL
10 μmol·L-1上、 下游引物， 补水至总体积 20 μL。
PCR 反应程序为 94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，
72℃ 1 min，25个循环；72℃ 5 min，4℃保存。
2 结果与分析
2.1 中国野生毛葡萄 VqCOI1 基因的克隆及序列
分析
根据前期研究获得的中国野生葡萄毛葡萄
COI1 基因 EST 序列 （GenBank number: JK266496），
在 NCBI葡萄 EST数据库进行 BLAST比对分析， 选
择与该 EST 序列一致的欧洲葡萄黑比诺 COI1 基因
序列，设计特异 PCR 引物，以白粉菌接种 72 h 后的
中国野生毛葡萄叶片 cDNA 为模板， 采用 RT-PCR
技术获得一条约 2 500 bp 的 cDNA 片段。 测序结果
表明，该序列长为 2 455 bp。序列分析表明，该 cDNA
开放阅读框编码区从第 659 个核苷酸到第 2 454 个
核苷酸，编码 598 个氨基酸残基（图 1），相对分子量
为 67.87 ku，等电点为 5.85，命名为 VqCOI1。 多重比
对分析显示它与其他植物中报道的 COI1 相似性集
中在 63% ~79% （图 2，3），其中与大豆（Glycine max）
COI1 基因（GenBank 登录号: AAZ66745.1）相似性最
高为 79%，与水稻（Oryza sativa Japonica Group）COI1
基因（GenBank登录号: AAO38719.1）最低为 63%。
图 2 不同植物中 COI1 基因氨基酸序列同源进化树分析
Fig. 2 Phyolgenetic tree of deduced amino acid sequence of
COI1 from different plants
73%
93%
82%
75%
78%
84%
80%
67%89%
59%
VqCOI1
HBCOI1
RcCOI1
GmCOI1
PsCOI1
NtCOI1
NaCOI1
S1COI1
AtCOI1
BrCOI1
OsCOI1
100% 90% 80% 70% 60% 50%
992
6 期
图 1 中国野生毛葡萄‘商-24’ VqCOI1 基因及其推导的氨基酸序列
Fig. 1 The ORF of VqCOI1 and the deduced amino acid sequence
牛 姣等: 中国野生毛葡萄病原菌诱导响应 VqCOI1 基因的克隆及表达分析 993
果 树 学 报 29 卷
图 3 不同植物 COI1 基因氨基酸序列的多重比较
Fig. 3 Multiple Alignment of deduced amino acid sequence of COI1 from different plants
994
6 期
图 5 VqCOI1 基因在抗病毛葡萄‘商-24’中
受到不同激素刺激后的表达分析
Fig. 5 Expression profiles of VqCOI1 gene induced by Eth、
SA、MeJA in PM-resistant clone ‘Shang-24’
图 4 VqCOI1 基因在抗病毛葡萄‘商-24’上接种白粉菌后
表达模式
Fig. 4 Expression analysis of VqCOI1 gene in resistant line in
response to Uncinula nector
2.2 白粉菌诱导后抗病葡萄‘商-24’中 VqCOI1 基
因表达分析
高抗葡萄白粉病的毛葡萄‘商-24’接种白粉菌
后不同时间点 VqCOI1 基因表达分析表明，VqCOI1
基因在感病初期持续上调表达，在接菌 72 h 表达量
达到最高，与 0 h 相比，增加了 5 倍多，随后表达量
又下调（图 4）。
2.3 不同激素处理后 VqCOI1 基因在在毛葡萄
‘商－24’中的表达分析
结果表明， 不同激素处理时 VqCOI1 基因均诱
导表达， SA 处理 12 h 后表达量最高， 是 0 h 的 7
倍， Eth处理 6 h 后， 诱导表达最高， 为 0 h 的 3 倍
多， 随着处理时间延长， 表达量下降。 同时， 作为
MeJA 的响应因子，VqCOI1 也诱导表达，启动 JA 信
号调节途径（图 5）。
2.4 VqCOI1 基因在毛葡萄‘商-24’不同组织中的
表达分析
半定量 PCR 在毛葡萄‘商-24’不同组织表达结
果表明，VqCOI1 基因相对内参 Actin1 基因，它在嫩
叶、嫩茎、花、果皮、卷须中虽然呈组成型表达，但在
各组织中的表达量普遍较低， 且在不同组织中的表
达量也不相同（图 6）。 不同组织的差异性表达体现
了 VqCOI1基因表达的空间差异性。
3 讨 论
在本课题组前期构建的白粉菌诱导下的中国野
生华东葡萄 ‘商-24’ cDNA文库中筛选获得的与衰
老相关蛋白基因相关的 EST 序列的基础上，克隆了
VqCOI1基因。 VqCOI1基因在不同组织中的转录表
达分析说明该基因的表达具有空间差异性。 病原菌
诱导后的实时定量结果表明，COI1 基因参与了植物
早期的抗病反应，通过病原菌的侵染，启动植物体内
源激素分子的调控途径， 参与泛素化途径的降解作
用， 激活病程相关蛋白基因的表达。 外源施加水杨
酸、茉莉酸、乙烯这 3 种激素时，COI1 基因也诱导表
达，MeJA处理下，COI1 参与了 JA 信号转导途径，通
过选择性地结合 JA应答反应的抑制因子，介导该抑
制因子与泛素结合， 然后通过泛素介导的蛋白质水
解途径使该抑制因子失活，由此开启 JA信号转导途
径，使植物产生 JA应答反应。
乙烯作为一种重要的气态激素分子， 也参与了
植物对病原菌等生物胁迫的应激反应[10]。 ERF 是乙
烯调控途径中重要的转录因子， 它可以参与植物防
卫反应的发生， 除了乙烯，ERF 也参与了茉莉酸和
水杨酸介导的信号途径， 从而调控植物下游抗病基
因的表达。有研究明确指出，乙烯参与了许多防卫反
应基因的表达，其中包括一些 PR 蛋白如几丁质酶，
PR-1，防卫素和植物抗毒素合成酶等[11]。定量结果表
明，乙烯处理可以诱导 COI1 基因的表达，由于 JA/
ET 信号途径与 SA 信号途径之间存着显著的交叉，
乙烯处理后如何参与 COI1 基因的表达仍需进一步
研究。
牛 姣等: 中国野生毛葡萄病原菌诱导响应 VqCOI1 基因的克隆及表达分析
相
对
表
达
水
平
Re
la
tiv
e
ex
pr
es
sio
n
le
ve
l
处理时间 Time post-inoculation/h
接种时间 Time post-inoculation/h
处理 Treatment
对照 CK
茉莉酸甲酯 MeJA
水杨酸 SA
乙烯 Eth
图 6 半定量表达分析 VqCOI1 基因在毛葡萄‘商-24’
不同组织中的表达模式
1. 嫩叶； 2. 嫩茎； 3. 花； 4. 果皮； 5.卷须
Fig. 6 Semi-quantitative PCR analysis of VqCOI1 in
different tissues from V. quinquangularis
1. Leaf； 2. Stem； 3. Flower； 4. Pericarp； 5. Tendril
VqCOI1
Actin 1
相
对
表
达
水
平
Re
la
tiv
e
ex
pr
es
sio
n
le
ve
l
995
SA介导的植物信号途径参与到 “基因对基因”
假说 [12]的抗性反应中，植物体内内源水杨酸信号分
子的积累会诱导多种病程相关蛋白的表达， 诱发植
物获得系统抗性。 研究表明，当病原菌侵染烟草，黄
瓜和拟南芥时，被侵染植物叶片内的水杨酸含量
迅速上升 ， 最终诱发植物系统获得性抗性的发
生[13-14]。 此外，外源施加 SA 也能使诱导植物系统获
得抗性反应的发生，从而使植物抵抗病原菌的侵入。
SA刺激后 COI1基因的表达明显升高， 这可能是由
于水杨酸能够通过专一地抑制过氧化氢酶活性来
增加植物体内 H2O2的含量， 进而导致一些与 SAR
有关的防卫反应基因的表达，最终使植物获得抗病
性[15-17]。
目前 JA 信号转导途径在单子叶植物中的研究
很少，VqCOI1 基因的获得为研究葡萄中 JA 应答反
应机制提供了很好的基础。 这对于揭示葡萄抗逆机
理， 寻找有效的途径来提高葡萄抗病性有着非常重
要的意义。
4 结 论
对 VqCOI1 基因在受到病原菌侵染和不同信号
分子刺激时的表达研究初步证明了该基因响应葡萄
白粉病病原菌的侵染并受生物胁迫不同激素的调节
作用，而这些激素均是病原菌响应的信号分子，推测
VqCOI1基因可能参与植物的抗病调节过程，将 Vq-
COI1基因的表达与葡萄白粉病的抗病机制相结合
将为后续葡萄抗白粉病的转基因育种奠定基础。
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果 树 学 报 29 卷996