全 文 ：园艺学报，2015，42 (1)：95–103.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0503；http：//www. ahs. ac. cn 95
茶树NADPH氧化酶基因的克隆、亚细胞定位与
表达分析
王明乐，王伟东，赵 真，黎星辉*
（南京农业大学茶叶科学研究所，南京 210095）
摘 要：以茶树（Camellia sinensis）‘迎霜’为试验材料，采用同源克隆的方法，利用 RACE 和 RT-PCR
技术获得茶树 NADPH 氧化酶基因 CsRBOHA 的 cDNA 全长（GenBank 登录号：KJ782632）。该基因全长
3 157 bp，开放阅读框 2 769 bp，编码 922 个氨基酸。生物信息学分析显示，该基因编码的蛋白分子量为
103.33 kD，理论等电点为 9.28；C 端序列较保守，N 端序列保守性较低，与烟草和蓖麻的相似性达 79%，
进化关系最近；蛋白结构具有典型的家族特征。该蛋白分布于细胞质膜上，与预测结果一致。实时荧光
定量 PCR 结果显示，该基因的表达存在组织特异性，并且在低温（4 ℃）、高盐（200 mmol · L-1 NaCl）、
ABA（200 mg · L-1）和干旱（10% PEG 6000）条件下出现不同程度的上调。
关键词：茶；NADPH 氧化酶；基因克隆；亚细胞定位；实时荧光定量；表达分析
中图分类号：S 571.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）01-0095-09

Molecular Cloning，Subcellular Localization and Expression Analysis of
NADPH Oxidase Gene from Tea Plant
WANG Ming-le，WANG Wei-dong，ZHAO Zhen，and LI Xing-hui*
（Tea Research Institute，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）
Abstract：In this study，the homologous gene CsRBOHA was isolated from tea plant（Camellia
sinensis）by RACE and RT-PCR. The full length of CsRBOHA gene（GenBank Accession No. KJ782632）
was 3 157 bp，which had an open reading frame of 2 769 bp，encoding 922 amino acids. The molecular
weight of the predicted enzyme was 103.33 kD and the pI value was 9.28. Homologous alignment showed
that the predicted CsRBOHA protein was similar to Nicotiana tabacum and Ricinus communis，with the
similarity of 79%. CsRBOHA was conserved with NADPH oxidase superfamily. Subcellular localization
indicated that the protein was localized in plasma membrane，which is identical to the predicted results.
Quantitative real-time PCR showed that the gene was tissue-specific and up-regulated by low temperature，
NaCl（200 mmol · L-1），ABA（200 mg · L-1）and 10% PEG 6000 at different degree.
Key words：tea plant；NADPH oxidase；gene cloning；subcellular localization；qRT-PCR；expression
analysis

收稿日期：2014–07–08；修回日期：2014–09–25
基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-23）；国家自然科学基金项目（31470690）；苏州市科技项目
（SZGD201067）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：lxh@njau.edu.cn）
Wang Ming-le，Wang Wei-dong，Zhao Zhen，Li Xing-hui.
Molecular cloning，subcellular localization and expression analysis of NADPH oxidase gene from tea plant.
96 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (1)：95–103.
NADPH 氧化酶（NADPH oxidase）又被称作呼吸爆发氧化酶同系物（Respiratory Burst Oxidase
Homologue，RBOH），作为植物“氧爆”发生的主要来源之一，主要通过调节活性氧（Reactive Oxygen
Species，ROS）的产生在植物生长、逆境胁迫和细胞信号转导中起重要作用（Sumimoto et al.，2005；
Torres & Dangl，2005；Brown & Griendling，2009）。已有的研究表明，植物 NADPH 氧化酶响应
水分、重金属、盐和高温等多种逆境胁迫（郝福顺，2005），其活性也受到 Ca2+、ABA、乙烯和亚
精胺等多种因子的调节（郝福顺和陈珈，2005）。
自水稻 OsrbohA 基因（Groom et al.，1996）被克隆以来，已在拟南芥（Torres et al.，1998；Kwak et
al.，2003）、烟草（Yoshioka et al.，2003）、西瓜（Si et al.，2010）和马铃薯（Yoshioka et al.，2001）等
多种植物中发现 NADPH 氧化酶基因。茶树作为一种多年生常绿木本植物，儿茶素和咖啡碱代谢合
成相关基因（Kato et al.，2000；陆建良 等，2007；孙美莲，2010；Yang et al.，2012）、香气形成基
因（李远华，2003；王瑾 等，2011）及抗逆相关基因（Singh et al.，2009；陈林波，2010）的研究较
多，而有关细胞质膜信号转导方面的研究未见报道。NADPH 氧化酶作为一种质膜氧化酶，在感受
到上游细胞信号后能迅速引起植物细胞下游相关信号的级联反应，这对揭示茶树的胁迫应答和生长
发育具有重要意义。为此从茶树‘迎霜’中分离得到 NADPH 氧化酶基因的 cDNA 全长并进行生物
信息学和实时荧光定量 PCR分析，以期为茶树NADPH氧化酶基因及相关基因的功能研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 菌种、质粒与植物材料
大肠杆菌菌株 DH5α 由南京农业大学茶叶科学研究所保存；亚细胞定位载体 pJIT166-GFP 由南
京农业大学作物遗传与育种国家重点实验室惠赠；pMD18-T载体、r-Taq聚合酶、DNA Marker、Reverse
Transcriptase M-MLV（RNase H-）、RNA 酶抑制剂、XbaⅠ、BamHⅠ、T4 DNA 连接酶、PrimeScriptTM
RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RnaseH Plus）
等均购自大连 TaKaRa 公司；E.Z.N.A.TM Gel Extration Kit 购自 OMEGA Bio-Tek 公司。
茶树（Camellia sinensis）材料为‘迎霜’一年生水培苗。于 2013 年 12 月 15 日取正常生长的
茶树的根、茎、叶、芽、花；果实采自南京中山陵茶厂。2014 年 6 月 14 日对茶苗进行低温（4 ℃）、
高盐（200 mmol · L-1 NaCl）、ABA（200 mg · L-1）和干旱（10% PEG 6000）处理，并分别于 0、1、
2、4、8、12 和 24 h 取第 4 叶。所采样品立即投入液氮，–80 ℃保存备用。
1.2 RNA的提取与cDNA的合成
使用快速 RNA 提取试剂盒（华越洋，中国）提取茶树不同组织的 RNA。利用 Reverse Transcriptase
M-MLV（RNase H-）试剂盒将不同组织 RNA 等量混匀后反转录成 cDNA。试验中所用引物（表 1）
委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
1.3 中间片段的扩增
根据 NCBI GenBank 中登录的其他物种 NADPH 氧化酶基因的氨基酸序列，同源比对后设计简
并引物。PCR 反应条件为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35 个循环；72 ℃ 10 min。
产物经 1%凝胶电泳检测、回收纯化后连接 pMD18-T 载体，挑选至少 3 个阳性克隆送南京金斯瑞生
物科技有限公司测序。
王明乐，王伟东，赵 真，黎星辉.
茶树 NADPH 氧化酶基因的克隆、亚细胞定位与表达分析.
园艺学报，2015，42 (1)：95–103. 97
表 1 基因克隆和定量 PCR 引物
Table 1 Primers used for cloning and RT-PCR of CsRBOHA
用途
Primer function
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence（5′–3′）
中间片段扩增
Amplifacation for internal fragement
DP-F
DP-R
GATGGKAGAATYACAGAAGARGAAGT
CCTTTGAACCADTCAAADGADCCTTG
5′ RACE 特异性引物
Gene specific primers for 5′RACE
5′GSP1
5′GSP2
GCTCAGCATTTGACTTAGGATTCT
GCTCTTCCATAATCAATGCTGC
3′ RACE 特异性引物
Gene specific primers for 3′RACE
3′GSP1
3′GSP2
ACAGTGTTCTCAGAGGTATGTCAG
CGCAACAAAGAGAAGCGGCAACAG
ORF 扩增引物
Amplifacation of CsRBOHA open reading frame
CsRBOHA-F
CsRBOHA-R
ATGCAGAAAATGGGAACGGACGACG
TTAAAAATTTTCTTTGTGGAATTC
亚细胞定位
Subcellular localization
Cs-F-XbaⅠ
Cs-R-BamHⅠ
GCTCTAGAATGCAGAAAATGGGCGAAGACGACG
CGCGGATCCAAAATTTTCTTTGTGGAATTC
CsRBOHA 荧光定量 PCR 引物
RT-PCR primers
Q-CsRBOHA-F
Q-CsRBOHA-R
ACAAGAGGAGGTGAAAGTAGAATC
CCCATTACCCCGTAGGCTGCTCTG
看家基因扩增
Housekeeping gene amplification
β-actin-F
β-actin-R
GCCATCTTTGATTGGAATGG
GGTGCCACAACCTTGATCTT
注：下划线为添加的酶切位点，TCTAGA为XbaⅠ酶切位点，GGATCC为BamHⅠ的酶切位点；双下划线为添加的保护碱基GC和CGC。
Note：TCTAGA and GGATCC underlined in primers indicate restriction enzyme sites of XbaⅠand BamHⅠ；GC and CGC double underlined in
primers indicate protective bases.

1.4 5′RACE和 3′RACE扩增全长cDNA
根据已获得的 NADPH 氧化酶基因的中间保守序列设计 3′端和 5′端基因特异性引物，PCR 反应
体系和扩增方法参照 Clontech 公司的 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit User Manual。PCR 产
物连接转化后挑选至少 3 个阳性克隆测序，获得 5′和 3′序列；用 DNAMAN 软件与中间片段拼接得
cDNA 全长。利用拼接得到的 cDNA 全长序列设计该基因的全长引物，并测序验证。
1.5 NADPH氧化酶基因序列的生物信息学分析
利用 NCBI 数据库中 BLAST 进行同源比对分析，用 ORF Finder 分析开放阅读框；DNAMAN
进行氨基酸亲水/疏水性预测，酸碱氨基酸统计分析；使用 CLUSTALW 1.83 和 MEGA 5.1 构建系统
进化树；使用 ProtParam tool（http：//web. expasy. org/protparam）计算蛋白质的相对分子质量和理论
等电点；利用 SOPMA 分析蛋白质二级结构；用 SWISS-MODEL 进行三级结构预测；利用在线软件
Wolf PSORT（http：//www. wolfpsort. org）和 PredictProtein（Rost et al.，2004）进行亚细胞定位预
测。
1.6 CsRBOHA的亚细胞定位
1.6.1 亚细胞定位载体的构建
以测序正确的 CsRBOHA ORF 为模板，Cs-F-XbaⅠ和 Cs-R-BamHⅠ为前后端引物进行 RT-PCR，
选取正确的克隆提取质粒，与 pJIT166-GFP 分别经 XbaⅠ和 BamHⅠ双酶切，回收目的片段并用 T4
DNA 连接酶过夜连接，构建 pJIT166-GFP/CsRBOHA 融合表达载体，转入 DH5α，经 PCR、酶切筛
选阳性克隆，并对阳性克隆进行测序验证。
1.6.2 基因枪转化洋葱表皮细胞
微粒子弹的制备及轰击受体材料参照尹盈等（2013）和杨光等（2011）的方法。
1.7 实时荧光定量 PCR 反应与基因表达分析
使用 PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒反转录后按照 SYBR® Premix Ex

Wang Ming-le，Wang Wei-dong，Zhao Zhen，Li Xing-hui.
Molecular cloning，subcellular localization and expression analysis of NADPH oxidase gene from tea plant.
98 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (1)：95–103.
TaqTM Ⅱ（Tli RnaseH Plus）使用说明进行荧光定量 PCR。以茶树 β-actin 基因（Accession No.
HQ420251）作为看家基因，使用 Roche 480 进行实时荧光定量 PCR 反应，采用 2-ΔΔCT 法（Livak &
Schmittgen，2001）分析结果。
试验数据采用 SPSS17.0 进行统计处理，利用邓肯式新复极差法做显著性分析。
2 结果与分析
2.1 茶树NADPH氧化酶基因全长cDNA序列的克隆
利用简并引物进行 RT-PCR 得到 1 600 bp 左右的条带，测序后 BlastX 比对证明该片段与其它物
种的 NADPH 氧化酶基因具有高度的相似性。以此片段为基础设计基因特异性引物（表 1）获得
1 100 bp 左右的 5′端序列和 600 bp 左右的 3′端序列，经 DNAMAN 拼接后预测全长 cDNA 的开放阅
读框（ORF），根据该序列设计 ORF 扩增引物获得长约 2 700 bp 的片段（图 1）。
ORF 产物测序后与拼接结果比对，确认获得了 3 157 bp 的茶树 CsRBOHA 基因的 cDNA 全长序
列（GenBank Accession No. KJ782632），图 2。



图 1 基因克隆电泳图
A：中间片段；B：5′RACE 产物；C：3′RACE 产物；D：开放阅读框扩增。
Fig. 1 Electrophoresis results of CsRBOHA cloning
A：Internal fragments；B：5′ fragments；C：3′ fragments；
D：Open reading frame of CsRBOHA（NTC：No template control）.

2.2 茶树CsRBOHA的进化分析
ORF Finder 分析表明，CsRBOHA 基因含有 2 769 bp 的开放阅读框，编码 922 个氨基酸（图 2），
其中酸性氨基酸 92 个，碱性氨基酸 145 个，中性氨基酸 685 个。同源比对发现，其氨基酸序列与烟
草（AAM28891.1）、蓖麻（XP_002511059.1）、马铃薯（NP_001275453.1）、可可（XP_007038195.1）、
毛果杨（XP_002318793.2）、西瓜（ACF05504.2）、苜蓿（XP_003602726.1）和菜豆（AEX56133.1）
的相似性较高。其中与烟草和蓖麻的一致性达到 79%。
为进一步研究 CsRBOHA 的进化关系，将双子叶模式植物拟南芥中已发现的 AtRBOH 氨基酸序
列与茶树CsRBOHA氨基酸序列一起构建NJ进化树（图 3），发现茶树CsRBOHA与拟南芥AtRBOHA
的进化关系较近，而与其他 9 个 AtRBOHs 进化关系较远。推测 CsRBOHA 与 AtRBOHA 在结构和功
能上有一定的相似性。
王明乐，王伟东，赵 真，黎星辉.
茶树 NADPH 氧化酶基因的克隆、亚细胞定位与表达分析.
园艺学报，2015，42 (1)：95–103. 99

图 2 茶树 NADPH 氧化酶基因的核苷酸序列和预测的氨基酸序列
起始密码子和终止密码子由下划线标出；其中 D（天冬氨酸）和 E（谷氨酸）为酸性氨基酸，K（赖氨酸）、R（精氨酸）和
H（组氨酸）为碱性氨基酸，其余为中性氨基酸。
Fig. 2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of NADPH oxidase gene from Camellia sinensis
Initiator codon and terminator codon are underlined. Asp（D）and Glu（E）belong to acidic amino acids. Lys（K），
Arg（R）and His（H）are basic amino acids，and the rest of them are neutral amino acids.

Wang Ming-le，Wang Wei-dong，Zhao Zhen，Li Xing-hui.
Molecular cloning，subcellular localization and expression analysis of NADPH oxidase gene from tea plant.
100 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (1)：95–103.

图 3 茶树 CsRBOHA 与拟南芥 AtRBOHs 的系统发育树
Fig. 3 Poylogenetic tree of CsRBOHA and 10 Arabidopsis thaliana RBOHs
2.3 茶树CsRBOHA的氨基酸理化性质、结构与功能分析
氨基酸亲水性/疏水性预测表明，该蛋白疏水性区域多于亲水性区域，说明该蛋白属于疏水性蛋
白。利用 ProtParam 预测该基因所编码的蛋白质相对分子量为 103.33 kD，理论等电点 9.28，是碱性
蛋白，分子式 C4649H7255N1283O1314S37，不稳定指数为 39.18，属于稳定蛋白。
CsRBOHA 与 NCBI 登录用的 8 个相似性较高的物种氨基酸序列比对发现，CsRBOHA 蛋白 N
端序列保守性相对较低，而 C 端序列保守性较高。保守域（Marchler-Bauer et al.，2011）分析发现，
CsRBOHA 具有 NADPH 氧化酶基因家族的典型结构特征，其 N 端有 1 个 Ca2+结合 EF 手性结构，6
个跨膜结构域，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合位点、黄素腺嘌呤二核苷酸结合位点、烟酰胺腺嘌呤二
核苷酸焦磷酸结合域、β–α–β 结构域以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸核糖结合域。
SOPMA 分析发现，CsRBOHA 蛋白的二级结构以 α–螺旋和无规则卷曲为主，比例分别为
44.90%和 37.20%，延伸链和 β–转角则散布在蛋白中。三级结构模型也显示 CsRBOHA 蛋白以 α–
螺旋和无规则卷曲为主。亚细胞定位预测表明该蛋白分布于细胞质膜上。
2.4 CsRBOH蛋白的亚细胞定位
基因枪轰击洋葱表皮后 25 ℃暗培养 18 h，利用激光共聚焦显微镜对绿色荧光蛋白信号进行观察
发现，转 pJIT166-GFP 空载体的细胞内布满了绿色荧光（图 4，A），而转 pJIT166-GFP/CsRBOHA
载体的细胞内只有细胞质膜上有绿色荧光信号（图 4，B），说明 CsRBOHA 蛋白具有膜定位功能。


图 4 GFP 蛋白（A）和 CsRBOHA 蛋白（B）在洋葱表皮中的定位
Fig. 4 Subcellular localization of GFP protein（A）and CsRBOHA protein（B）in onion epidermal cells
王明乐，王伟东，赵 真，黎星辉.
茶树 NADPH 氧化酶基因的克隆、亚细胞定位与表达分析.
园艺学报，2015，42 (1)：95–103. 101
图 5 CsRBOHA 基因在茶树不同组织的表达情况
Fig. 5 Relative transcription level of CsRBOHA
gene in different tissues
2.5 CsRBOHA的组织特异性表达分析
结果（图 5）表明 ，CsRBOHA 在茶树不
同组织（以叶为对照，人为设定表达量为 100）
中均有不同程度的表达，相对表达量由高到低
依次为叶 > 茎 > 花 > 芽 > 根 > 果，说明
该基因存在组织特异性表达情况。
2.6 CsRBOHA在不同胁迫下的差异表达分析
4 ℃处理茶树后（0 h 表达量设为 100，下
同），CsRBOHA 的表达水平迅速升高并在 1 h
时达到最大，然后逐渐降低（图 6），表明低温可以在短时间内上调茶树 CsRBOHA 的表达。
NaCl 处理后，CsRBOHA 的表达水平逐渐增加，在 8 h 出现降低，12 h 升高后又在 24 h 降低，
不同时间点的表达水平均高于对照（图 6），表明高盐条件上调该基因的表达。
ABA 处理条件下，CsRBOHA 的表达水平在 1 h 内迅速升高，2 h 下降后在 4 h 出现升高，而后
逐渐降低（图 6），表明外源脱落酸促进了 CsRBOHA 的表达。
PEG 6000 处理后，CsRBOHA 的表达水平逐渐升高，2 ~ 8 h 降低后在 12 h 时升高到最高水平，
而后在 24 h 降低（图 6），说明模拟干旱条件下，CsRBOHA 也有较高水平的表达。

图 6 CsRBOHA 在不同处理条件下的表达分析
Fig. 6 Expression analysis of CsRBOHA under different treatments
3 讨论
为深入研究茶树中 RBOH 活性的具体调节机制及与其他信号分子间的相互作用，本试验首先利
用 RT-PCR 和 RACE 技术从茶树品种‘迎霜’中分离出 CsRBOHA 基因，并利用生物信息学手段分
析了 CsRBOHA 基因编码的蛋白的可能结构和功能。系统进化树分析发现，CsRBOHA 氨基酸序列
与双子叶模式植物拟南芥中的 AtRBOHA 氨基酸的进化关系最近，推测 CsRBOHA 基因可能参与

Wang Ming-le，Wang Wei-dong，Zhao Zhen，Li Xing-hui.
Molecular cloning，subcellular localization and expression analysis of NADPH oxidase gene from tea plant.
102 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (1)：95–103.
与拟南芥 AtRBOHA 相似的生物化学反应。亚细胞定位结果表明该蛋白分布于细胞质膜上，这与已报
道的西瓜（Si et al.，2010）、玉米（林凡，2008）等物种的亚细胞定位结果一致，推测 CsRBOHA 基
因在茶树细胞内外之间的信号传递和活性氧的产生中起重要作用。
利用实时荧光定量 PCR 研究 CsRBOHA 基因的组织特异性表达发现，该基因为组成型表达，即
在茶树地下部根和地上部茎、叶、芽、花和果中均有表达，这与单子叶模式植物水稻 OsRBOHA 基
因的表达（李业 等，2011）类似；双子叶模式植物拟南芥中只有 AtRBOHD 和 AtRBOHF 基因属于
组成型基因，而与茶树 CsRBOHA 蛋白同源性最高的 AtRBOHA 蛋白基因只在根中特异表达（Sagi &
Fluhr，2006），表明不同物种之间 RBOH 基因在不同组织中的表达存在差异。
分析该基因在不同处理条件下的表达发现，茶树 CsRBOHA 基因响应多种逆境胁迫：低温（4 ℃）
条件下，CsRBOHA 的转录水平在 1 h 内迅速升高，而后逐渐降低，说明茶树在感受到外界低温时，
迅速将胞外信号传递到胞内，激发植物的防御反应，启动下游抗寒相关基因的表达，进而提高茶树
对冷胁迫的耐受性；而高盐（200 mmol · L-1 NaCl）、外源脱落酸（200 mg · L-1 ABA）和干旱（10%
PEG 6000）处理条件下，茶树 CsRBOHA 基因的转录水平呈现出波浪状的变化趋势，即：升—降—
升—降，这可能与采用灌根的处理方式有关，茶树根部在持续感受到外界不利环境时，将细胞信号
从地下部传递到地上部的过程中有一定的时间差，这可能造成了该基因转录水平的高低起伏变化。
植物中 NADPH 氧化酶基因通常以基因家族的形式存在（Torres et al.，1998；林凡，2008）。由
于同源克隆方法的局限性，本试验仅得到 1 条茶树 CsRBOH 基因序列，这不利于对该基因家族进行
深入研究。后期试验拟尝试其他方法进一步发掘更多的茶树 CsRBOH 基因，深入研究该基因家族在
茶树细胞信号转导中的调节机制。

References
Brown D I，Griendling K K. 2009. Nox proteins in signal transduction. Free Radical Biology and Medicine，47 (9)：1239–1253.
Chen Lin-bo. 2010. Cloning and expression analysis of cold resistance related genes from tea plant[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze] [M. D.
Dissertation]. Hefei：Anhui Agricultural University. (in Chinese)
陈林波. 2010. 茶树抗寒相关基因的克隆与表达特性分析[硕士论文]. 合肥：安徽农业大学.
Groom Q J，Torres M A，Fordhamskelton A P，HammondKosack K E，Robinson N J，Jones J D G.1996. RbohA a rice homologue of the mammalian
gp91phox respiratory burst oxidase gene. Plant Journal，10 (3)：515–522.
Hao Fu-shun. 2005. Involvement of plasma-memberance NADPH oxidase in ABA- and nickel-induced accumulation of reactive oxygen species in
plants[Ph. D. Dissertation]. Beijing：China Agricultural University. (in Chinese)
郝福顺. 2005. 植物质膜 NADPH 氧化酶参与 ABA 和镍离子诱导的活性氧积累[博士论文]. 北京：中国农业大学.
Hao Fu-shun，Chen Jia. 2005. Research advances in NADPH oxidative enzymes in the plasma membrance of plant cells. Chinese Bulletion of
Botany，22 (Supplement)：1–10. (in Chinese)
郝福顺，陈 珈. 2005. 植物细胞膜 NADPH 氧化酶的研究进展. 植物学通报，22 (增刊)：1–10.
Kato M，Mizuno K，Crozier A，Fujimura T，Ashihara H. 2000. Plant biotechnology：Caffeine synthase gene from tea leaves. Nature，406 (6799)：956–957.
Kwak J M，Mori I C，Pei Z M，Leonhardt N，Torres M A，Dangl J L，Bloom R E，Bodde S，Jones J D G，Schroeder J I. 2003. NADPH oxidase
AtrbohD and AtrbohF genes function in ROS-dependent ABA signaling in Arabidopsis. EMBO Journal，22 (11)：2623–2633.
Li Ye，Chen Yin-hua，Wu Jia-he，He Chao-zu. 2011. Expression and functional analysis of CsRboh gene family in rice immune response. Chinese
Journal of Biotechnology，27 (11)：1574–1585. (in Chinese)
李 业，陈银华，吴家和，何朝族. 2011. OsRboh 基因家族在水稻免疫应答中的表达及功能分析. 生物工程学报，27 (11)：1574–1585.
Li Yuan-hua. 2003. Clone，expression and localization of β-glucosidase gene in the tea[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze][Ph. D. Dissertation].
Hefei：Anhui Agricultural University. (in Chinese)
王明乐，王伟东，赵 真，黎星辉.
茶树 NADPH 氧化酶基因的克隆、亚细胞定位与表达分析.
园艺学报，2015，42 (1)：95–103. 103

李远华. 2003. 茶树 β–葡萄糖苷酶基因克隆、表达和分布定位[博士论文]. 合肥：安徽农业大学.
Lin Fan. 2008. Molecular cloning and characterization of NADPH oxidase gene from Zea mays seedlings[Ph. D. Dissertation]. Nanjing：Nanjing
Agricultural University. (in Chinese)
林 凡. 2008. 玉米 NADPH 氧化酶基因克隆、表达特性及功能研究[博士论文]. 南京：南京农业大学.
Livak K J，Schmittgen T D. 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods，25 (4)：402–408.
Lu Jian-liang，Lin Chen，Luo Ying-ying，Zhang Guang-hui，Liang Yue-rong. 2007. Progress in functional gene cloning of Camellia sinensis. Journal
of Tea Science，27 (2)：95–103. (in Chinese)
陆建良，林 晨，骆颖颖，张广辉，梁月荣. 2007. 茶树重要功能基因克隆研究进展. 茶叶科学，27 (2)：95–103.
Marchler-Bauer A，Lu S，Anderson J B，Chitsaz F，Derbyshire M K，DeWeese-Scott C，Fong J H，Geer L Y，Geer R C，Gonzales N R，Gwadz
M，Hurwitz D I，Jackson J D，Ke Z，Lanczycki C J，Lu F，Marchler G H，Mullokandov M，Omelchenko M V，Robertson C L，Song J
S，Thanki N，Yamashita R A，Zhang D，Zhang N，Zheng C，Bryant S H. 2011. CDD：A conserved domain database for the functional annotation
of proteins. Nucleic Acids Research，39：225–229.
Rost B，Yachdav G，Liu J F. 2004. The predict protein server. Nucleic Acids Reaearch，322：321–326.
Sagi M，Fluhr R. 2006. Production of reactive oxygen species by plant NADPH oxidases. Plant Physiology，141 (2)：336–340.
Si Y，Dane F，Rashotte A，Kang Kwonkyoo，Singh Narendra K. 2010. Cloning and expression analysis of the Ccrboh gene encoding respiratory burst
oxidase in Citrullus colocynthis and grafting onto Citrullus lanatus（watermelon）. Journal of Experimental Botany，61 (6)：1635–1642.
Singh K，Kumar S，Ahuja P S. 2009. Differential expression of Histone H3 gene in tea[Camellia sinensis (L.) O. Kuntze]suggests its role in growing
tissue. Molecular Biology Reports，36 (3)：537–542.
Sumimoto H，Miyano K，Takeya R. 2005. Molecular composition and regulation of the Nox family NADPH oxidases. Biochemical and Biophysical
Research Communications，338 (1)：677–686.
Sun Mei-lian. 2010. Gene expression of catechins biosynthesis in tea plant[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze]with real-time fluorescence quantitative
PCR[M. D. Dissertation]. Hefei：Anhui Agricultural University. (in Chinese)
孙美莲. 2010. 茶儿茶素生物合成相关基因表达的实时荧光定量 PCR 分析[硕士论文]. 合肥：安徽农业大学.
Torres M A，Onouchi H，Hamada S，Machida C，Hammond-Kosack K E，Jones J D G. 1998. Six Arabidopsis thaliana homologues of the human
respiratory burst oxidase（gp91(phox)）. Plant Journal，14 (3)：365–370.
Torres M A，Dangl J L. 2005. Functions of the respiratory burst oxidase in biotic interactions，abiotic stress and development. Current Opinion in
Plant Biology，8 (4)：397–403.
Wang Jin，Qi Li，Zhang Zheng-zhu. 2011. Differential gene expression of endogenous glycosidases induced by pathogenic fungi infection in leaves
of Camellia sinensis. Chinese Bulletin of Botany，46 (5)：552–559. (in Chinese)
王 瑾，戚 丽，张正竹. 2011. 真菌侵染引发的茶树内源糖苷酶基因差异表达. 植物学报，46 (5)：552–559.
Yang D Q，Liu Y J，Sun M L，Zhao L，Wang Y S，Chen X T，Wei C L，Gao L P，Xia T. 2012. Differential gene expression in tea（Camellia
sinensis L.）calli with different morphologies and catechin contents. Journal of Plant Physiology，169 (2)：163–175.
Yang Guang，Cao Xue，Fang Jing-gui，Huang Zhen-xi，Tao Jian-min，Wang Chen. 2011. Subcellular localization and expression analysis of genes
involved in grapevine floral development. Scientia Agricultura Sinica，44 (3)：641–650. (in Chinese)
杨 光，曹 雪，房经贵，黄振喜，陶建敏，王 晨. 2011. 葡萄花发育基因的亚细胞定位和表达分析. 中国农业科学，44 (3)：641–650.
Yin Ying，Zhang Yue，Hu Jing-yan，Zhou Lin，Wang Ming-le，Fang Wan-ping，Li Xing-hui. 2013. Subcellular localization and expression analysis
of CsICE transcription factor to cold stress in tea plant. Acta Horticulturae Sinica，40 (10)：1961–1968. (in Chinese)
尹 盈，张 玥，胡靖妍，周 琳，王明乐，房婉萍，黎星辉. 2013. 茶树低温胁迫转录因子 CsICE 的亚细胞定位及表达分析. 园艺学
报，40 (10)：1961–1968.
Yoshioka H，Numata N，Nakajima K，Katou S Kawakita K，Rowland O，Jones JDG，Doke N. 2003. Nicotiana benthamiana gp91(phox) homologs
NbrbohA and NbrbohB participate in H2O2 accumulation and resistance to Phytophthora infestans. Plant Cell，15 (3)：706–718.
Yoshioka H，Sugie K，Park H J，Maeda H，Tsuda N，Kawakita K，Doke N. 2001. Induction of plant gp91phox homolog by fungal cell wall，arachidonic
acid，and salicylic acid in potato. Molecular Plant-Microbe Interations，14 (6)：725–736.