全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（1）：107–117 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–06–24；修回日期：2013–12–16
基金项目：国家自然科学基金项目（30871731）；农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：gaojp@cau.edu.cn）
激素和非生物胁迫对月季 RhPIP1;1 启动子活性
的调节作用
阴 霞 1，陈 雯 1，王 磊 1，杨若韵 1，薛璟祺 2，高俊平 1,*
（1 中国农业大学观赏园艺与园林系，北京 100193；2中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）
摘 要：通过反向 PCR 方法克隆得到月季（Rosa hybrida L.）‘萨蔓莎’质膜型水孔蛋白基因 RhPIP1;1
上游 2 126 bp 的启动子序列。PLACE 分析发现，RhPIP1;1 启动子序列中含有 GA、ABA 和乙烯等激素诱
导相关顺式作用元件及干旱、低温和盐胁迫等非生物胁迫相关顺式作用元件。在 RhPIP1;1promoter：：GUS
转基因拟南芥中发现，RhPIP1;1 启动子活性与植株发育进程相关；几乎所有器官均可检测到 GUS 表达，
而且在迅速扩展的器官以及叶片和花的维管组织中尤为强烈。同时在 6 d 和 9 d 苗龄的转基因植株中，GA
处理上调了莲座叶中 RhPIP1;1 启动子的活性，而 ABA、甘露醇、NaCl 和冷处理分别下调了莲座叶和根
中 RhPIP1;1 启动子的活性。将 RhPIP1;1 启动子不同长度的 5′端缺失片段融合 GUS 基因，并在烟草叶片
中瞬时表达，缺失–580 ~–256 之间的 324 bp 片段后，启动子活性显著降低。研究结果表明 RhPIP1;1 启
动子对多种激素和非生物胁迫存在响应，并且这种响应具有发育和器官特异性；RhPIP1;1 启动子中–580 ~
–256 区段对于启动子活性具有重要的作用。
关键词：月季；RhPIP1;1；启动子活性；激素；非生物胁迫
中图分类号：S 685.12 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）01-0107-11

Regulation of the Rose RhPIP1;1 Promoter Activity by Hormones and
Abiotic Stresses
YIN Xia1，CHEN Wen1，WANG Lei1，YANG Ruo-yun1，XUE Jing-qi2，and GAO Jun-ping1,*
（1Department of Ornamental Horticulture，China Agricultural University，Beijing 100193，China；2Institute of Vegetables
and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）
Abstract：A 2 126 bp sequence of the RhPIP1;1 promoter was isolated from rose（Rosa hybrida L.
‘Samantha’）through inverse PCR. PLACE analysis indicated that the RhPIP1;1 promoter harbors
hormone-responsive elements，such as GA，ABA，and ethylene related cis-elements，and abiotic
stresses-responsive elements，such as dehydration-，salt-，and cold-related cis-elements. In
RhPIP1;1promoter：：GUS-expressing Arabidopsis，the activity of RhPIP1;1 promoter was found to be
associated with the development process. Almost all the organs exhibited the promoter activity，which is
particularly active in expanding organs and vascular tissues of leaves and flowers. Moreover，in the 6- or
9-day-old transgenic plants，the promoter activity was up-regulated by GA treatment in the rosettes，
whereas down-regulated by ABA，mannitol，NaCl，and cold treatment in the rosettes and roots. A series of

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5′ deletion fragments of the RhPIP1;1 promoter were fused with GUS gene，and transiently expressed in
tobacco leaves. It was found that deleting 324 bp fragment from–580 to–256 led to a significant
decrease of the promoter activity. Taken together，our results demonstrated that the RhPIP1;1 promoter
responds to various hormones and abiotic stresses in a developmental- and spatial-dependent manner. And
the–580 to–256 region is important for the activity of the RhPIP1;1 promoter.
Key words：rose；RhPIP1;1；promoter activity；hormone and abiotic stress

水通道蛋白（AQP）是一类大家族的膜内在蛋白，能够促进水分和小分子物质的跨膜运输（Maurel
et al.，2008）。质膜型水通道蛋白（PIP）作为水分进入细胞内部的第一道门槛，在植物细胞吸水过
程中起重要作用。PIP 依据氨基酸序列中 N 端和 C 端保守序列的不同，分为 PIP1 和 PIP2 两个亚家
族（Danielson & Johanson，2008；Srivastava et al.，2010）。已有研究证明，PIPs 广泛参与了植物生
长发育的各个阶段，包括种子萌发、根和茎伸长、叶片生长、花朵开放和果实成熟等（Obroucheva &
Sin’kevich，2010）。PIPs 基因的表达受多种植物激素如 ABA（Lian et al.，2006）、GA（Suga et al.，
2002）、生长素（Péret et al.，2012）和乙烯（Tungngoen et al.，2009，2011）等，以及非生物胁迫
如干旱（Vandeleur et al.，2009）、高盐（Bae et al.，2011；Horie et al.，2011； Abdelkader et al.，
2012）、冷胁迫（Li et al.，2009a）和渗透胁迫（Jang et al.，2004）等因素的调节，而且这种调节具
有个体差异性和器官特异性（Buzeli et al.，2002；Jang et al.，2004）。
为了研究 PIPs 基因在转录水平上的调节机制，已经从多种植物如水稻、油菜和橡树（Yu et al.，
2003；Lian et al.，2006；Ayadi et al.，2011；Tungngoen et al.，2011）中分离得到 PIPs 基因的启动
子。研究表明，PIPs 启动子的表达具有发育阶段和组织特异性，通常在运输水分的组织、迅速膨胀
的器官以及发育的初期阶段中表达强烈。在冰叶日中花（Mesembryanthemum crystallinum）中，
McMipB（PIP 的同源基因）启动子在迅速扩展的组织如根部的分生组织和未成熟的新叶中表达强烈，
并且在根尖表达最强，而 McMipA（PIP 的同源基因）启动子在维管组织中表达强烈（Yamada et al.，
1997；Yamada & Bohnert，2000）；在油菜中，BnPIP1 启动子在顶端分生组织及其相邻组织中表达
强烈（Yu et al.，2003）；棉花中 GhPIP2;7 启动子在拟南芥幼苗的早期发育阶段具有强烈表达，之后
随幼苗生长逐渐减弱（Zhang et al.，2013）。
在不同物种的 PIPs 的启动子中都发现了激素和非生物胁迫响应元件。橡树中，HbPIP1;1 启动
子包含乙烯响应元件 AWTTCAAA、生长素响应元件 ARF 和多种干旱响应元件如 Myb、Myc 和
WRKY（Tungngoen et al.，2011）。水稻中，OsPIP1;2 启动子含有 ABA 响应元件 ABRE，OsPIP1;3
启动子含有干旱相关元件 DRE/CTR boxes（Lian et al.，2006），RWC3 启动子含有 GA 响应元件（Sun
et al.，2004）。然而，目前关于 PIPs 启动子响应激素和非生物胁迫的研究还比较少，主要集中在水
分胁迫的响应方面。在转基因拟南芥中，AtPIP1;4 启动子活性响应干旱处理上调，与 AtPIP1;4 基因
的表达趋势一致（Alexandersson et al.，2010）；棉花 GhPIP2;7 启动子在甘露醇处理下，GUS 表达
显著升高，并随甘露醇浓度的升高呈上升趋势（Zhang et al.，2013）；Li 等（2009b）在前期的研究
克隆得到了月季 RhPIP2;1（PIP2 家族成员）的启动子序列，并对启动子活性响应激素和非生物胁
迫的机制做了全面的探讨。结果表明，RhPIP2;1 启动子可以被 ABA、ACC、NaCl 和冷处理抑制，
而被 GA 和甘露醇处理上调。并且，这种转录调控依赖于器官和发育阶段。
关于月季花瓣中 PIP1 家族成员在转录水平上的调控机制仍然不清楚。在前期的研究中已经分
离得到月季 RhPIP1;1 基因（PIP1 家族成员），发现 RhPIP1;1 表达受乙烯处理下调，并证实 RhPIP1;1
参与了月季花瓣吸水扩展的过程（Chen et al.，2013）。本试验中从切花月季‘萨蔓莎’（Rosa hybrida
L.‘Samantha’）中克隆到 RhPIP1;1 基因上游的启动子序列，并进行顺式作用元件分析；在表达
1 期 阴 霞等：激素和非生物胁迫对月季 PhPIP1;1 启动子活性的调节作用 109

RhPIP1;1 启动子的拟南芥中研究 RhPIP1;1 启动子的组织表达特性和其对多种激素及非生物胁迫的
响应，同时通过启动子 5′端连续的缺失片段鉴定了启动子中影响其活性的核心区域。
1 材料与方法
1.1 植物材料与菌株
试验于 2011 年 9 月至 2013 年 1 月在中国农业大学完成。切花月季‘萨蔓莎’来自北京市昌平
区月季生产基地。拟南芥（Arobidopsis thaliana）和烟草（Nicotiana benthamiana）、大肠杆菌菌株（E.
coli）菌株 DH5α、农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株 GV3101 为本实验室保存。
1.2 月季 RhPIP1;1 启动子的克隆及序列分析
用 CTAB 法从月季幼嫩叶片中提取 DNA。在 RhPIP1;1 基因已知序列中选择靠近 5′端且只有 1
个酶切位点的 3 种限制性内切酶：NcoⅠ，ApaLⅠ和 EcoRⅤ，将月季 DNA 用这 3 种酶分别酶切过
夜。酶切产物经凝胶电泳确定呈弥散形条带后，分别进行 DNA 纯化，并用 T4 连接酶（Promega）
连接过夜。连接产物纯化后作为反向 PCR 的模板。于所选酶切位点的上游设计两对反向扩增嵌套引
物：Promoter-upper1：5′-TTTGCCCTTGTTTACTGC-3′；Promoter-lower1：5′-ATGCCCTGAATACC
CACA-3′；Promoter-Nest-upper2：5′-GGTGGCTCCTTGTAGTCC-3′；Promoter-Nest-lower2：5′-ATGCC
CTGAATACCCACA-3′。经两轮 PCR 扩增后获得的序列连接 T-easy 载体（Promega）进行测序鉴定。
采用植物顺式调控元件数据库PLACE（Higo et al.，1999；http：//www.dna.affrc.go. jp/PLACE/
signalscan.html）对启动子序列进行分析，并在http：//www.fruitfly.org/seq-tools/promoter.html网站预
测启动子的转录起始位点。
1.3 转基因载体构建
表达载体 CP-INR 由中国农业大学生物学院郭泽建老师惠赠。用于扩增 RhPIP1;1 启动子片段的引
物 P1-PRO-PstⅠ：5′-CGTCTGCAGTGAGGTCTCTTTTGGTCCTACC-3′；P1-PRO-BglⅡ：5′-CGC
AGATCTACCATCTTTTTCTCTCTCTGAAACTCTGG-3′。将 PCR 扩增获得的片段用 PstⅠ/BglⅡ双酶
切后装入 CP-INR 表达载体，得到重组质粒 CP-INR- RhPIP1;1promoter。转化大肠杆菌 E. coli 并选择阳
性克隆测序验证。用于扩增 RhPIP1;1 启动子 5 个缺失片段的上游引物（含 PstI）：D1（– 1 432）5′-CG
T CTGCAGCCTCATTTGAGTATAGTGGCTCGTAG-3′；D2（– 1 136）5′-CGTCTGCAGCGGAAAACTT
TCAGTGCTCAT-3′；D3（– 894）5′-CATCTGCAGTCCATTCTCGGGAAACGTCC-3′；D4（– 580）5′-CG
GCTGCAGACCCTTTAAGATATTGGATAGGTG-3′；D5（– 256）5′-CGTCTGCAGATTTTGGGTTTCTG
GTGAGG-3′。下游引物同 P1-PRO-BglⅡ。将各个缺失片段分别插入 CP-INR 表达载体，构建过程同上。
1.4 拟南芥转化和烟草瞬时表达
将构建好的各个重组质粒分别转入农杆菌 GV3101。
拟南芥转化参考 Clough 和 Bent（1998）的花序浸蘸法。将 CP-INR-RhPIP1;1promoter 载体转入拟
南芥，潮霉素抗性培养基筛选阳性植株。同时转化插入 35S 启动子的 CP-INR 拟南芥作为正对照。
烟草瞬时表达方法：携带 CP-INR-D1 ~ 5 表达载体的农杆菌 GV3101 于 28 ℃下摇菌 12 ~ 16 h。
5 000 r · min-1 离心 10 min，弃上清液。用侵染液（10 mmol · L-1 MES，10 mmol﹒L-1 MgCl2，100
mmol · L-1 Acetosyringone，pH 5.6）悬浮菌液，并调节浓度至 OD600 = 0.8。选择烟草上部处于扩展
中的叶片进行注射。暗培养 24 h 后在白色荧光灯照明（16 h 光照/8 h 黑暗）、21 ℃的环境下生长 3 d。
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1.5 激素和非生物胁迫处理
将萌发后 6 d 和 9 d 的拟南芥转基因植株分别转移到含有 ABA（200 μm · L-1）、GA（160 μm · L-1）、
NaCl（125 mm · L-1）和甘露醇（250 mm · L-1）的 MS 培养基中，在白色荧光灯照明（16 h 光照/8 h
黑暗）、21 ℃环境下培养 4 d。冷胁迫处理为将植株移到新的 MS 培养基中，置于 4 ℃培养箱中培养
4 d。对照转基因植株移到新的不含激素的 MS 培养基中，于正常条件下培养 4 d。
1.6 GUS 表达的组织化学定位
将不同苗龄的拟南芥转基因植株的叶片、根和花等器官放入 Eppendorf 试管中，加入 200 μL 组
织化学染色液（75.5 mmol · L-1 sodium phosphate，pH 7.0，0.1% Triton X-100，0.05 mmol · L-1 K3/K4
FeCN，10 mmol · L-1 EDTA，20% methanol（体积比），50 μg · mL-1 5-bromo-4-chloro-3-indolyl
glucuronic acid）。37 ℃培养箱中放置 4 h，再用 70%的酒精脱色 2 ~ 3 次，直到对照材料显现白色为
止。在显微镜下观察 GUS 表达部位。启动子缺失片段重组质粒侵染烟草 3 d 后，在烟草叶片注射区
域内避开针孔取直径 0.5 cm 的叶圆片并放入染色液中进行染色，操作方法同拟南芥。
1.7 GUS 活性荧光检测
（1）拟南芥：参照 Li 等（2009b）的方法分别检测拟南芥叶片和根部的 GUS 酶活。将处理后
单个转基因拟南芥植株的莲座叶和根分开，取 4 ~ 6 片莲座叶或全部根系，分别放入 1.5 mL Eppendorf
试管中，加入 300 μL 拟南芥 GUS 提取液[50 mmol · L-1 sodium phosphate，pH 7.0，10 mmol · L-1
Na2-ethylenediaminetetra acetic acid（EDTA）pH 8.0，0.1% sodium lauryl sarcosine，0.1% Triton X-100，
10 mmol · L-1 β-mercaptoethanol]，在冰上用匀浆机将组织磨碎，4 ℃ 8 000 r · min-1 离心 10 min。将
上清液转入新管。预先准备 160 μL 的 MUG 溶液（1 mmol · L-1）于 1.5 mL Eppendorf 试管中，37 ℃
下水浴 5 min，加入 40 μL 的上清液，迅速充分混匀，并立刻取出 100 μL 反应混合液加入到 900 μL
的终止液中（0.2 mol · L-1 的 NaCO3），将该管作为酶促反应的 0 点。15 min 后，取出剩余的 100 μL
反应混合液，加入到 900 μL 的终止液中。用分光光度计在激发波长 365 nm、发射波长 455 nm 下测
定不同时间点的荧光值。取 100 μL 上清液用考马斯亮蓝法测定样品蛋白含量（Bradford，1976）。
计算每个样品单位时间内的 GUS 活性。对照和每个处理都用来自 5 株 6 d 或 9 d 苗龄转基因拟南芥
的莲座叶和根部进行活性分析。
（2）烟草：在烟草叶片注射区内避开针孔取直径 0.5 cm 的圆片（每个叶片取两个圆片作为一
个重复，每个片段取 10 个重复），迅速在液氮中研磨成粉末，转入 1.5 mL 离心管中，加入 300 μL
烟草 GUS 提取液［50 mmol · L-1 sodium phosphate，pH 7.0，10 mmol · L-1 Na2-ethylenediaminetetra
acetic acid（EDTA）pH 8.0，0.1% sodium lauryl sarcosine，0.1% Triton X-100，10 mmol · L-1
β-mercaptoethanol，20% methyl alcohol］，采用与拟南芥相同的方法测定 GUS 酶活。
2 结果与分析
2.1 月季 RhPIP1;1 启动子的克隆及顺式作用元件分析
2.1.1 RhPIP1;1启动子的克隆
经过两轮反向 PCR 后，从 EcoRⅤ酶切体系中获得 1 条大于 2 kb 的片段，生物信息学预测
RhPIP1;1启动子的转录起始位点位于ATG上游 98 bp，即该片段包含RhPIP1;1基因上游 98 bp 5′UTR
和 2 126 bp 启动子序列（图 1）。

1 期 阴 霞等：激素和非生物胁迫对月季 PhPIP1;1 启动子活性的调节作用 111

图 1 RhPIP1;1 基因启动子序列
C 为转录起始位点，该位置标记为 +1；数字表示相对于转录起始位点 +1 的位置；ATG 为翻译起始位点。
Fig. 1 The sequence of the RhPIP1;1 promoter
‘C’represents the transcriptional start site which position is defined as +1；Numbers indicate the positions relative to the
transcription start site；‘ATG’represents the translation start site.

2.1.2 RhPIP1;1启动子顺式作用元件分析
采用顺式元件数据库 PLACE 软件（Higo et al.，1999）对所获 RhPIP1;1 启动子进行序列分析。
如表 1 所示，该启动子除了含有大多数真核生物启动子的保守元件 TATA box 和 CAAT 外，还具有

表 1 RhPIP1;1 启动子中顺式作用元件预测
Table 1 The analysis of cis-acting elements of RhPIP1;1 promoter by PLACE
顺式作用元件 Cis-element 序列 Sequence 特征 Description
PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A CCTTTT 赤霉素响应元件 cis-element of GARE
PYRIMIDINEBOXHVEPB1 TTTTTTCC 赤霉素诱导相关 Required for GA induction
MYB2CONSENSUSAT YAACKG 脱落酸信号转录激活因子 Transcriptional activators in abscisic acid signaling
DRE2COREZMRAB17 ACCGAC 脱落酸诱导相关元件 Induced by ABA
DPBFCOREDCDC3 ACACNNG 脱落酸诱导相关元件 Induced by ABA
MYB1LEPR GTTAGTT ERF 调控元件 Regulates defence-related gene expression via non-GCC box cis element
ERE AWTTCAAA 乙烯调控元件 Mediated ethylene-induced activation of the U3 promoter region
GT1GMSCAM4 GAAAAA 盐胁迫诱导相关元件 Plays a role in salt-induced SCaM-4 gene expression
MYBCORE CNGTTR 失水胁迫相关元件 Involved in regulation of genes that are responsive to water stress in Arabidopsis
MYCATERD1 CATGTG 失水元件 Necessary for expression of erd1 (early responsive to dehydration)
CBFHV RYCGAC 失水响应元件Binding site of CBFs，known as dehydration-responsive element (DRE) binding proteins
LTRE1HVBLT49 CCGAAA 低温响应元件 Low-temperature-responsive element
LTRECOREATCOR15 CCGAC 低温响应元件 Core of low temperature responsive element
IBOX GATAAG 光调控相关元件 Conserved sequence upstream of light-regulated genes
OSE2ROOTNODULE CTCTT 器官特异元件 Activated in infected cells of root nodules
GATABOX GATA 组织特异相关元件 Required for high level，light regulated，and tissue specific expression
TATABOX3 TATTAAT 转录起始-30 核心元件 Core promoter element around -30 of transcription start
CAATBOX1 CAAT 启动子和增强子区调控元件 Common cis-acting element in promoter and enhancer regions
INRNTPSADB YTCANTYY Inr（initiator） elements
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Inr 元件 INRNTPSADB，这 3 个元件已经被证明参与了大多数植物启动子的转录起始过程。RhPIP1;1
启动子序列中还包含了许多与激素和非生物胁迫响应相关的元件。激素响应元件包括：GA 响应元
件 PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A 和 PYRIMIDINEBOXHVEPB1；ABA 响应调控元件 MYB2CONSE
NSUSAT、DPBFCOREDCDC3 和 DRE2COREZMRAB17；乙烯响应元件 MYB1LEPR 和另一个存在
反义链上的 ERE 元件。非生物胁迫响应元件包括：盐胁迫响应元件 GT1GMSCAM4；干旱响应元件
MYBCORE、MYCATERD1 和 CBFHV；低温响应元件 LTRECOREATCOR15 和 LTRE1HVBLT49。
这些元件的发现说明 RhPIP1;1 基因可能在转录水平上受到激素（如 GA、ABA、乙烯）和非生物胁
迫（如高盐、干旱、低温）等多种因素的调节。同时在 RhPIP1;1 启动子序列中还发现了 OSE2ROOT
NODULE 和GATABOX 器官特异表达元件，说明RhPIP1;1 在植物体内的表达也可能具有器官特异性。
2.2 月季 RhPIP1;1 启动子在拟南芥中的组织化学定位
为了检测 RhPIP1;1 启动子在植物中的组织表达特性，将 RhPIP1;1promoter::GUS 转基因拟南芥
T2 代纯合体进行组织化学定位。如图 2 所示，未经过春化的转基因拟南芥种子（图 2，S）没有 GUS
活性，而只有经过春化后（图 2，T）才能检测到 GUS 表达。在 3 ~ 9 d 的早期营养生长阶段，大部
分器官中均可检测到 GUS 表达活性。其中叶和根的维管组织中的 GUS 表达活性强烈，而且子叶中


图 2 RhPIP1;1promoter::GUS 转基因拟南芥中 GUS 的组织化学定位
A：负对照（None）5 d 植株；B：正对照（35S::GUS）5 d 植株；C ~ F：萌发后 3、5、7、9 d 植株；G：子叶；H：真叶；I：30 d 植株叶
片；J：3 d 植株胚轴与根的转换区；K：3 d 植株根尖；L：侧根；M：未开放花朵；N：成熟花朵；O：雌蕊；P：雄蕊；
Q：花瓣；R：成熟果荚；S：成熟种子；T：经春化后的种子。
Fig. 2 Histochemical localization of GUS expression driven by the RhPIP1;1 promoter in transgenic Arabidopsis
A：Negative control（None）5-day-old plant；B：Positive control（35S::GUS）5-day-old plant；C–F：3，5，7，9-day-old plants after germination；
G：Cotyledons；H：Leaves；I：Leaves in 30-day-old plants；J：Transition zones between hypocotyls and roots in 3-old-day plants；
K：Root tips in 3-old-day plants；L：Lateral roots；M：Flower bud；N：An opened flower；O：Pistil；P：Stamen；
Q：Petal；R：Matured siliques；S：Matured seeds；T：Vernalized seeds.
1 期 阴 霞等：激素和非生物胁迫对月季 PhPIP1;1 启动子活性的调节作用 113

的活性比真叶强。3 d 苗龄植株中，胚轴与根转换处的 GUS 表达活性比胚轴上部强烈。7 d 苗龄植株
的侧根开始发育，与侧根根尖相比，根原基与侧根连接处的 GUS 表达活性更强。当进入生殖生长阶
段，叶片中的 GUS 表达变弱，对于 30 d 苗龄植株的叶片，只在叶脉中检测到微弱的 GUS 表达活性。
同时，在早期的花序中即可检测到 GUS 表达活性；花朵开放后 GUS 表达活性在萼片中最强，在雄
蕊的花丝和雌蕊柱头中也较强烈，而在花药中未检测到，在花瓣的维管组织中也能检测到 GUS 表达
活性。成熟果荚中 GUS 活性只在果梗中检测到，其他部位均未检测到。
2.3 激素和非生物胁迫对月季 RhPIP1;1 启动子的活性影响
为了研究 RhPIP1;1 启动子对激素和非生物胁迫的响应机制，将 RhPIP1;1promoter::GUS 转基因拟
南芥植株分别用 GA、ABA、NaCl、甘露醇和低温进行处理，检测莲座叶和根中的 GUS 活性。前期
试验证明，不同生长阶段的植株对胁迫处理的敏感性不同，随着苗龄增大，对胁迫处理的敏感性也
逐渐降低。因此，采用 6 d 和 9 d 苗龄的转基因植株作为试验对象。
如图 3 所示，GA 处理增强了叶中 GUS 的表达活性，相比对照，6 d 和 9 d 苗龄的植株叶片分别
增加了 24%和 18%；但是在根中 GUS 活性差异不明显。ABA 处理显著抑制了 GUS 的表达活性：
在 6 d 植株的叶和根中，ABA 处理使 GUS 活性下降了近 50%；在 9 d 植株的叶中抑制效果更加明显，
使 GUS 活性下降了近 70%，而在根中下降了 50%左右。
非生物胁迫中，甘露醇处理与 ABA 处理的效果相近。NaCl 处理对于 6 d 植株根和叶的 GUS 活
性具有相反的效果：叶中下降了 24%，而在根中有 15%的上升；而在 9 d 植株的叶和根中 GUS 活性
都显著降低。冷处理对叶中 GUS 表达的抑制效果较为稳定，在 6 d 和 9 d 时分别下降了 41%和 36%；
而在根中，6 d 时无明显的变化，9 d 时则降低了 66%（图 3）。
试验结果说明，RhPIP1;1 启动子对激素与非生物胁迫的响应存在发育阶段和器官特异性，整体
而言，RhPIP1;1 启动子对激素与非生物胁迫的响应在叶中比在根中的敏感性更高，而且 9 d 苗龄的
植株较 6 d 的更加敏感性。


图 3 转基因拟南芥 6 d 和 9 d 苗龄植株在激素和非生物胁迫诱导下叶片和根系 RhPIP1;1 启动子的 GUS 活性分析
星号表示处理与对照之间差异显著（* P < 0.05，** P < 0.01）。
Fig. 3 The GUS activity analysis of RhPIP1;1 promoter in response to hormone treatments and various
abiotic stresses in 6 and 9-day-old transgenic Arabidopsis plant
Asterisks represent significant difference between treatment and untreated control
（* P < 0.05，** P < 0.01）.

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2.4 月季 RhPIP1;1 启动子 5′端缺失片段的表达活性分析
为了研究 RhPIP1;1 启动子不同区域的表达活性，将 RhPIP1;1 启动子从转录起始位点上游近
1 400 bp 的 5′端逐一缺失形成 5 个片段，在烟草叶片中瞬时表达并进行 GUS 组织化学染色和荧光定
量分析。
对 GUS 荧光定量分析（图 4）发现，缺失–1 432（D1）与–1 136（D2）之间的区域对启动子
的 GUS 活性无明显影响；缺失–1 136（D2）至–894（D3）和–894（D3）至–580（D4）间的区
域都略微增强了 GUS 活性；而缺失了–580（D4）与–256（D5）间的区域导致了 GUS 活性的迅速
下降，与 D4 活性相比降低了 45%。
烟草叶圆片 GUS 染色结果（图 5）显示，缺失 D2 至 D3 间的区域使烟草中 GUS 的染色略有加
深，缺失 D3 至 D4 间的区域后 GUS 活性达到最强。而与 D4 片段相比，缺失 D4 至 D5 间的区域导
致 GUS 染色明显变浅，这与 GUS 荧光定量分析的结果一致。
该结果表明，在 RhPIP1;1 启动子中，–1 136 至–894 和–894 至–580 间的区域可能存在对启
动子活性负调控的元件，而–580 至–256 间的区域对于启动子的活性具有重要作用。


图 4 RhPIP1;1 启动子缺失片段在烟草中的 GUS 活性分析
A1：RhPIP1;1 启动子缺失片段；A2：RhPIP1;1 启动子缺失片段在烟草中的 GUS 活性荧光定量分析。
Fig. 4 GUS assays of RhPIP1;1 promoter deletions in the tobacco
A1：Schematic diagram of the RhPIP1;1 promoter deletions；A2：GUS fluorometric assays of
RhPIP1;1 promoter deletions in the tobacco.




图 5 RhPIP1;1 启动子缺失片段在烟草叶圆片中的 GUS 染色
Fig. 5 GUS staining of RhPIP1;1 promoter deletions in the tobacco disc
1 期 阴 霞等：激素和非生物胁迫对月季 PhPIP1;1 启动子活性的调节作用 115

3 讨论
本研究中从月季花瓣中分离到 RhPIP1;1 基因上游 2 126 bp 的启动子序列。 该序列中包含了与
ABA、GA、乙烯等激素和干旱、盐胁迫、低温、光等非生物胁迫相关的元件，其中盐和低温的响
应元件尚未在其他 PIPs 启动子中报道。此外，RhPIP1;1 启动子中还具有调控转录起始精确度和效
率的保守元件 TATA box、CAAT 和 Inr。通常植物启动子的转录起始需要 TATA box 和 CAAT 元件；
也有少量的报道证实 Inr 元件在缺乏 TATA box 的情况下对基因转录起到了关键的作用（Nakamura et
al.，2002）。之前的研究发现在 RhPIP2;1 的启动子中也只有 Inr 元件，而没有 TATA box（Li et al.，
2009b）。然而本研究中发现在 RhPIP1;1 启动子中这 3 个元件同时存在。Inr 元件能否在 TATA box
存在的情况下参与转录起始，还有待于进一步研究。
关于启动子活性对激素和非生物胁迫的响应，发现 GA、ABA、NaCl、甘露醇和低温处理都可
以调节 RhPIP1;1 启动子的活性，并且响应机制具有发育阶段和器官依赖性。值得注意的是，之前研
究发现，甘露醇处理可以增强 9 d 植株叶片中 RhPIP2;1 启动子的表达（Li et al.，2009b）；而 RhPIP1;1
启动子在 6 d 和 9 d 植株的根、叶中均响应甘露醇处理显著下调。RhPIP1;1 和 RhPIP2;1 启动子对甘
露醇处理的差异响应，说明水分胁迫对这两个基因在转录水平上可能具有不同的调控机制。
同时，作为影响月季切花采后花朵开放的两个重要因素（Ma et al.，2008），作者特别关注了
ACC（乙烯合成前体）和甘露醇（渗透调节物）处理对启动子活性的影响。目前关于 PIPs 基因的启
动子活性响应乙烯处理的报道很少。橡树的 HbPIP1;1 受乙烯利处理后表达显著下调，并且 HbPIP1;1
启动子中发现了一个典型的乙烯响应元件 AWTTCAAA（Tungngoen et al.，2011）。前期研究证明，
ACC 处理显著抑制了 RhPIP2;1 启动子的活性。然而，在 RhPIP2;1 启动子中并没有发现典型的乙烯
作用元件。最近的研究表明，RhPIP1;1 启动子活性也被 ACC 处理显著下调（Chen et al.，2013），
但 RhPIP1;1 启动子中包含 2 个潜在的乙烯响应元件，推测这些元件在响应乙烯的转录调控中可能起
到了重要作用。
PIPs 基因对于植物体内的水分平衡至关重要，然而在干旱胁迫下 PIPs 基因具有不同的表达模
式（Alexandersson et al.，2010）。拟南芥中多数 AQP 基因的表达受干旱胁迫下调（Jang et al.，2004），
而 AtPIP1;4 的表达却有近两倍的上调（Alexandersson et al.，2005）。在水稻中，20%的聚乙二醇（PEG）
处理使根中 OsPIP1;3 和叶中 OsPIP1;2、OsPIP1;3 的表达升高（Lian et al.，2006）。葡萄中，水分
胁迫导致葡萄根中 VvPIP1;1 的表达上调近 3 倍（Vandeleur et al.，2009）。PIPs 大部分成员表达的下
调可能是植物减少水分散失和维持叶片膨压的一种方式，而少数 PIPs 的上调可能会使水分直接进入
特定器官或者细胞，避免干旱对植物造成损伤（Alexandersson et al.，2005，2010）。在本研究中
RhPIP1;1 启动子活性在模拟干旱胁迫的甘露醇处理后显著下降，说明 RhPIP1;1 可能对月季花朵的
耐失水能力发挥了一定的作用。
已有研究表明，PIPs 基因启动子的表达具有时空表达特性。本研究中 RhPIP1;1 启动子在幼嫩
叶片和根的维管组织中表达强烈，表明 RhPIP1;1 可能参与幼嫩器官的扩展生长。同时，RhPIP1;1
启动子在未开放的花朵中可检测到 GUS 表达，开放后在花瓣的维管组织中表达较强，说明 RhPIP1;1
启动子的表达与花瓣的吸水扩展相关，暗示了 RhPIP1;1 基因可能参与月季花瓣扩展。此外，在柱头
和花丝中均检测到 RhPIP1;1 启动子的表达，在花药中未检测到，而月季 RhPIP2;1 启动子和烟草
NtPIP2 基因在花药中均有表达（Bots et al.，2005；Li et al.，2009b ），说明不同的 PIP 成员之间的
表达特性存在差异，可能与它们的功能特异性相关。
在启动子短截分析中，发现删除 RhPIP1;1 启动子中–580 至–256 之间 324 bp 的片段后，启动
116 园 艺 学 报 41 卷
子活性迅速下降，表明该片段中可能含有增强启动子活性的核心元件，而在这 324 bp 的片段中发现
了一个 CAAT box。已有报道证实 CAAT box 对于启动子的活性非常重要，点突变 CAAT box 后，胭
脂碱和酶 nos 启动子的活性显著下降（Dai et al.，1999）。因此，该元件的缺失可能导致了 RhPIP1;1
启动子活性的下降，然而该推测还有待进一步验证。

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