全 文 ：园艺学报，2016，43 (7)：1402–1410.
Acta Horticulturae Sinica
1402 doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0872；http：//www. ahs. ac. cn
收稿日期：2016–02–01；修回日期：2016–07–07
基金项目：北京市科技计划研发攻关项目（YLHH201200109）；中国农业科学院与北京市大兴区科技合作项目；农业部园艺作物生物学
与种质创制重点实验室项目
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：liuchun@caas.cn）
红掌查尔酮异构酶基因的克隆与表达分析
杨 哲 1，刘克林 2，彭佳佳 1,3，秦 扬 1,3，郑高言 1，明 军 1，刘 春 1,*
（1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081：2 北京市大东流苗圃，北京 102211；3 宁夏大学农学院，银川
750021）
摘 要：以红掌栽培品种‘Dakota’为材料，采用 RACE 技术克隆获得 AnCHI 基因的 cDNA 序列，
分析花青素含量与该基因表达的关系，进一步完善红掌花青素合成途径。结果表明：AnCHI 序列全长
为 1 117 bp，其中开放阅读框为 777 bp，编码 258 个氨基酸；AnCHI 在不同时期红掌佛焰苞以及根、茎、
叶、肉穗组织中均有表达，且在佛焰苞发育前期表达量明显高于后期，测得花青素含量与基因表达量变
化基本一致；构建的 pGEX-4T1-AnCHI 重组表达载体在原核中正确表达。初步验证了 AnCHI 的表达可能
对红掌佛焰苞花青素的合成有一定促进作用。
关键词：红掌；AnCHI；花青素；表达分析
中图分类号：S 682 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）07-1402-09

Cloning and Expression Analysis of Chalcone Isomerase Gene from
Anthurium andraeanum
YANG Zhe1，LIU Ke-lin2，PENG Jia-jia1,3，QIN Yang1,3，ZHENG Gao-yan1，MING Jun1，and LIU Chun1,*
（1Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；2Nursery of
Dadongliu，Beijing 102211，China；3College of Agricuture，Ningxia University，Yinchuan 750021，China）
Abstract：A full length cDNA of chalcone isomerase（CHI）was amplified from Anthurium
andraeanum L.‘Dakota’by using RACE technology. The relationship between its expression patterns and
anthocyanin content were dissected for the purpose of further improving the anthocyanin biosynthetic
pathway of anthurium. The results showed that the AnCHI cDNA was 1 117 bp with a 777 bp open reading
frame in full-length which encoding 258 amino acids. AnCHI was expressed in different developing
periods of spathes as well as in roots，stems，leaves and spadixes and the expression levels of AnCHI in the
early stages（1–4）of spathes were significantly higher than that in mature stages（5–8）. The content of
anthocyanin was changed consistently with the gene expression，while the recombinant expression
vectors—pGEX-4T1-AnCHI was correctly expressed in prokaryotes. The research suggested that AnCHI
may play an important role in promoting the anthocyanin synthesis of Anthurium andraeanum.
Key words：Anthurium andraeanum；AnCHI；anthocyanin；expression analysis



杨 哲，刘克林，彭佳佳，秦 扬，郑高言，明 军，刘 春.
红掌查尔酮异构酶基因的克隆与表达分析.
园艺学报，2016，43 (7)：1402–1410. 1403

花色的主要贡献者是类黄酮物质和它的有色一族花色苷。类黄酮的合成是由苯丙氨酸和丙二酰
辅酶 A 起始，逐步合成结构多样的芳香类化合物（Winkel-Shirley，2001）。高等植物中的类黄酮物
质主要包括 6 个副族：查尔酮、黄酮、黄酮醇、黄烷双醇、花青素苷和原花青素苷。在影响花色的
诸多因素中，类黄酮的生物合成被研究得最为广泛。其中，花青素是有色类黄酮一族，能使植物花
色产生很大的变异（Tanaka et al.，2010），对花青素进行遗传调控，是实现花色改良的主要途径之
一。
花青素由前体物质苯丙氨酸经过一系列酶促反应合成，最终被转运至液泡中储存（Jaakola et al．，
2002）。其中查尔酮异构酶（CHI）是花青素合成途径中的第 2 个关键酶，催化查尔酮异构化形成
（2S）–黄烷酮或（2S）–5–脱氧黄烷酮，控制着类黄酮物质的合成。按其作用底物的不同可以
分为两种类型，一类存在于非豆科植物中，仅能催化 6′–羟基查尔酮形成 5′–羟基黄酮醇；另一类
存在于豆科植物中，能催化 6′–脱氧查尔酮和 6′–羟基查尔酮转化为相应的 5′–羟基黄酮醇和 5′–
脱氧黄烷酮（Shimada et al.，2003）。1987 年 CHI 基因从法国菜豆（Phaseolus vulgaris）中利用抗体
技术分离出来（Mehdy & Lamb，1987），随后陆续从矮牵牛、苜蓿、大麦、水稻和花生（van Tunen
et al.，1988；McKhann & Hirsch，1994；Druka et al.，2003；Zhang et al.，2012）等多种植物中克隆
出来。
CHI 在色素合成及花、果实、种子颜色的形成中起着重要作用。目前已有利用查尔酮异构酶
对植物进行基因遗传改造的报道。在对烟草 CHI 基因表达进行 RNAi 技术抑制后，花瓣中的花色
素含量减少，查尔酮含量上升，花瓣变成黄色（Nishihara et al.，2005）；降低翠菊（Callistephus
chinensis）、康乃馨（Dianthus caryophyllus）、仙客来（Cyclamen persicum）的 CHI 酶活性，植物中
积累大量查尔酮，产生黄色花朵（Kuhn et al.，1978；Forkmann & Dangelmayr，1980；Takamura et al.，
1995）；白色矮牵牛中过表达 CHI 基因，催化查尔酮异构化为（2S）–黄烷酮，使下游反应底物含
量增加，从而正调节整个代谢途径，最终合成部分花色素苷，使白色花瓣出现浅粉红色（祝钦泷，
2004）。
本试验中以红掌（Anthurium andraeanum L.）栽培品种‘Dakota’为材料，采用 RACE 技术克
隆获得 AnCHI 基因，分析基因表达与花青素含量的关系，进一步完善红掌花青素代谢途径的研究，
为探究红掌佛焰苞花青素合成的分子机制对红掌花色进行人工修饰，进一步提高其观赏和商品价值
提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
红掌不同组织器官与佛焰苞发育不同时期的材料取自北京市大兴苗圃两年生‘Dakota’品种。
将佛焰苞自抽出至衰老分为 8 个时期（彭佳佳，2014）：S1，花梗长 2 ~ 4 cm；S2，花梗长 7 ~ 9
cm；S3，花梗长 12 ~ 15 cm；S4，佛焰苞微卷待张开；S5，佛焰苞完全张开；S6，佛焰苞边缘变绿；
S7，佛焰苞一半变绿；S8，佛焰苞完全变绿（图 1）；并选取生长健壮红掌植株的根、茎、叶和肉穗。
样品采集日期为 2014 年 5 月，取后放入液氮中速冻于–80 ℃冰箱备用。



Yang Zhe，Liu Ke-lin，Peng Jia-jia，Qin Yang，Zheng Gao-yan，Ming Jun，Liu Chun.
Cloning and expression analysis of chalcone isomerase gene from Anthurium andraeanum.
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图 1 红掌佛焰苞发育阶段
Fig. 1 The different developmental stages of Anthurium andraeanum

1.2 基因全长克隆
红掌佛焰苞、根、茎、叶和肉穗总 RNA 的提取按照植物 RNA 提取试剂盒 Esayspin（艾德莱，
北京）的说明书进行，提取的 RNA 经 Biodrop 超微量蛋白核酸分析仪测定浓度并用 1.2%的琼脂糖
凝胶电泳检测完整性。用反转录试剂盒 SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR
（Invetrogen，美国）合成 cDNA 第 1 链。
根据本实验室红掌转录组测序获得的基因片段设计 3′、5′-RACE 引物：3′GSP-1、3′GSP-2；
5′GSP-1、5′GSP-2（表 1）。
以红掌佛焰苞 cDNA 为模板，参考 GeneRacerTM Kit（Invetrogen，美国）操作说明合成 RACE
扩增所需 cDNA。扩增条件为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，5 个循环；94 ℃ 30 s，70 ℃
1 min，5 个循环；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，20 个循环；72 ℃ 10 min。以第 1 次 PCR
产物为模板，进行 3′、5′-RACE 巢式 PCR，扩增条件为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，68 ℃
2 min，25 个循环；68 ℃ 10 min。
PCR 产物经 1.5%的琼脂糖凝胶检测后，参照胶回收试剂盒（全式金，北京）回收纯化；连接到
pEASY-Blunt Simple Vector（全式金，北京），由深圳华大基因科技有限公司进行测序。

表 1 引物序列
Table 1 Sequence of primers
引物名称
Primer
name
序列（5′–3′）
Sequence
引物名称
Primer
name
序列（5′–3′）
Sequence
3′GSP-1 ACGCAGAAGCACAAGCCGTGGACA qCYP-F GGCAAGCCCCTCCACTACAA
3′GSP-2 CCCGAGCAAGTGCCTGAGTTGGTGG qCYP-R GCCCTGGCACATGAACTGGG
5′GSP-1 ACTTGTCGTCCATCTTCGCCACCAACTCAG qUBQ5-F TCCGCATCCAGAAGTGGTAC
5′GSP-2 GTCCATCTTCGCCACCAACTCAGGCACTT qUBQ5-R TGCCGTCGTGGATCTCGTAG
CHI-F CAAGTCTCCCGTGCTTACAAT pCHI-F ATCTGGTTCCGCGTGGATCCATGGCAGCGGAGGCAGAG
CHI-R CACTGCTCTGGTCCCAATCT pCHI-R TCGAGTCGACCCGGGAATTCCTTGTCGTCCATCTTCGCC
qCHI-F AAGCCACAAGACAAAATC
qCHI-R CACCCGAAGGAGACAC

利用 BioEdit 软件进行 3′、5′序列拼接，获得全长 cDNA 序列。用 NCBI 进行核苷酸和氨基酸序
列比对及保守结构域分析，ORF Finder 进行开放阅读框（ORF）分析，ProtParam tool 计算编码蛋白
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质分子量及等电点，ProtScale 预测蛋白质亲疏水性，TMHMM Server 2.0 分析跨膜结构域，SignalP-4.1
预测蛋白质信号肽，Phyre 2 预测蛋白质二级结构及三维结构，Plant-mPLoc 进行亚细胞定位预测，
MEGA 6.0 软件构建系统进化树。
1.3 实时定量 PCR 反应
根据 AnCHI 基因全长序列设计荧光定量引物 qCHI-F 和 qCHI-R（表 1），以 CYP、UBQ5（David
& Adrian，2013）为内参，分别设计其特异引物 qCYP-F、qCYP-R、qUBQ5-F 及 qUBQ5-R（表 1）。
RT-PCR 反应体系为 20 μL，具体操作参照 Roche 公司的 FastStart Universal SYBR Green Master
（ROX）试剂盒的步骤，Taq DNA 聚合酶由北京天根公司提供。反应程序为 95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，
55 ℃ 1 min，40 个循环；72 ℃ 20 s。在 ABI7900HT 荧光定量 PCR 仪上进行分析，采用 2-ΔΔCt 法
计算相对表达量（Livak & Schmittgen，2001）。
1.4 佛焰苞颜色和花青素含量测定
取‘Dakota’不同发育时期的佛焰苞，放置光线良好的室内，将佛焰苞上中部与英国皇家园艺
学会比色卡（Royal Horticultural Society Color Chart，RHSCC）进行比对（夏婷 等，2013）。重复
20 次，选择出现频率最高的结果描述花色。
称取各时期新鲜的佛焰苞 0.2 g，液氮研磨，利用盐酸甲醇法（吕福梅，2005）提取总花青素苷，
紫外分光光度计分别测定波长为 530 和 657 nm 处的吸光度，重复 5 次。
1.5 原核表达
利用同源重组的方法，根据目的基因 AnCHI 及载体 pGEX-4T-1 序列，设计带有 BamHⅠ/EcoRⅠ
酶切位点的插入片段引物 pCHI-F、pCHI-R（表 1），扩增 AnCHI 不含终止子的开放阅读框。经 BamHⅠ
和 EcoRⅠ37 ℃过夜双酶切后，构建 PGEX-4T-1-AnCHI 重组表达载体，并转化到大肠杆菌 BL21 感
受态细胞中表达。测序合格的阳性菌液处理组加入最佳诱导浓度为 0.1 mmol · L-1 的 IPTG，对照组
不加 IPTG，16 ℃、170 r · min-1 培养 24 h。离心收集菌体，提取目的蛋白，以混合蛋白为标准样品
进行 SDS-PAGE 分析。电泳后考染显色。
2 结果与分析
2.1 AnCHI 全长克隆与序列分析
提取红掌佛焰苞、根、茎、叶和肉穗总 RNA，经 Biodrop 超微量蛋白核酸分析仪测定，显示每
个样品总 RNA OD260/280 值均介于 1.8 ~ 2.0 之间，浓度均大于 100 μg · μL-1；用 1.2%的琼脂糖凝胶电
泳检测，28S 和 18S 条带清晰，亮度比值约为 2︰1，说明 RNA 完整性较好，可进行后续试验。
利用引物 3′GSP、3′GSP Nested，3′-RACE 扩增得到 1 条长约 700 bp 的条带（图 2，A）；利用
引物 5′GSP、5′GSP Nested，5′-RACE 扩增得到 1 条长约 1 100 bp 的条带（图 2，B）。测序并将序
列拼接后得到全长为 1 117 bp 的基因，命名为 AnCHI。
设计全长引物 CHI-F、CHI-R，高保真 PCR 扩增得到包含开放阅读框（ORF）的 cDNA 序列 1 117
bp（图 2，C），与预期基因大小相符。

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图 2 AnCHI 基因扩增结果
Fig. 2 PCR product of AnCHI from Anthurium andraeanum

利用 ORF Finder 分析显示其开放阅读框（ORF）为 777 bp，编码 258 个氨基酸。ProtParam tool
分析得到 AnCHI 编码的蛋白质分子量为 27.79 kD，理论等电点为 4.98；ProtScale 显示 AnCHI 编码
的蛋白质氨基酸中有较多区段位于 0 刻度线以上，所以 AnCHI 蛋白以疏水性为主；利用在线软件
TMHMM Server 2.0 预测的整个蛋白为膜外蛋白的概率将近 1，而为膜内蛋白和跨膜蛋白的总概率接
近 0，故该蛋白无跨膜结构，非分泌蛋白；使用 Phyre2 在线蛋白结构预测软件预测出的蛋白二级结
构和三维结构均覆盖全部氨基酸序列的 82%，可信度达到 100%；利用 Plant-mPLoc 进行亚细胞定位
预测分析，结果显示该蛋白可能位于叶绿体中。
以胶球藻（Coccomyxa subellipsoidea）为外类群，由推导出的氨基酸序列构建的系统进化树（图
3）显示，参与比对的 CHI 氨基酸序列在进化上被分为两类，第一类为单子叶植物的 CHI 进化关系，
其中红掌 AnCHI 形成一个独立的分支，与水稻（Oryza sativa Japonica Group）、玉米（Zea mays）
的亲缘关系较近，但分化时间要早于这几种植物；与郁金香（Tulipa fosteriana）、药百合（Lilium
speciosum）、美国油棕（Elaeis oleifera）、海枣（Phoenix dactylifera）亲缘关系较远。第二类为双
子叶植物的 CHI 进化关系。系统进化树分析反映了 AnCHI 蛋白的进化规律，证实红掌 AnCHI 基因
属于 CHI 基因家族。


图 3 红掌 AnCHI 氨基酸与其他植物 CHI 的进化树
Fig. 3 Phylogenetic tree of AnCHI of Anthurium andraeanum and other plants
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2.2 AnCHI 的组织表达特性分析
根据 RT-PCR 技术，分析 AnCHI 在根、茎、叶和肉穗及不同发育时期佛焰苞中的表达情况。结
果（图 4）表明，AnCHI 在各组织中均有表达，主要集中在佛焰苞中表达，其中 S3 时期（花梗长
12 ~ 15 cm）佛焰苞表达量最高，在衰老的佛焰苞（S7、S8）和根、茎及肉穗中表达量很低；说明
AnCHI 在红掌‘Dakota’佛焰苞发育早期表达量高，成熟期后表达量降低。

图 4 AnCHI 在红掌不同组织器官和 8 个发育时期（S1 ~ S8）佛焰苞中的相对表达量
Fig. 4 Relative expression of AnCHI in different tissues and eight growth stages spathes of Anthurium andraeanum


2.3 佛焰苞花青素含量与颜色测定结果
8 个不同发育时期（S1 ~ S8）的佛焰苞总花青素含量如图 5 所示，佛焰苞从 S1 时期开始呈上升
趋势，S3 ~ S5 时期达到最高，之后急剧下降。


图 5 红掌佛焰苞 8 个发育时期（S1 ~ S8）总花青素含量
Fig. 5 Total anthocyanins content in eight growth stages of spathes

根据英国皇家园艺学会比色卡与红掌‘Dakota’8 个不同发育时期佛焰苞的对比结果（表 2），
S1 ~ S5 时期佛焰苞颜色以红色系为主，S6 时期开始转绿，S8 时期为全绿。
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表 2 红掌‘Dakota’佛焰苞 8 个发育时期（S1 ~ S8）颜色描述
Table 2 Spathe color of eight growth stages of‘Dakota’
发育时期
Growth stage
比色卡代码
RHSCC
色系
Color group
发育时期
Growth stage
比色卡代码
RHSCC
色系
Color group
S1 52A 红 RED S6 45A 红 RED
S2 50A 红 RED S7 外缘 Outside 143A 绿 GREEN
S3 50A 红 RED S7 中间 Middle 187A 红 RED
S4 46B 红 RED S8 外缘 Outside 143C 绿 GREEN
S5 45B 红 RED S8 中间 Middle 141A 绿 GREEN

利用软件 SPSS Statistics 分析红掌花青素含量与 AnCHI 基因表达量之间的相关性，不同发育时
期佛焰苞 AnCHI 表达量与花青素含量正相关，相关系数为 0.90。
2.4 原核表达
利用 RACE 得到的全长序列构建了重组表达载体 pGEX-4T1-AnCHI，并在大肠杆菌 BL21 感受
态细胞中表达，同时重组蛋白的 IPTG 浓度诱导表达梯度表明，该重组蛋白在 0.1mmol · L-1IPTG 诱
导下表达量最高。在高表达条件下分别培养 8、12、16、20 和 24 h，诱导出的融合蛋白约 54 kD，
其中包括目的基因编码蛋白 27.79 kD，GST（谷胱甘肽巯基转移酶）标签 26 kD，其大小与预测的
融合蛋白一致（图 6）。本实验表明 AnCHI 可以在大肠杆菌中正确表达，且表达的重组蛋白主要在
上清液中，为可溶性蛋白。



图 6 重组载体 PGEX-4T1-AnCHI 表达融合蛋白的 SDS-PAGE 电泳图
A：蛋白标准样；B：穿透液；1 ~ 5：目的蛋白（从左至右诱导时间为 24、20、16、12、8 h）。
Fig. 6 SDS-PAGE electrophoretogram of the fusion proteins expressed by PGEX-4T1-AnCHI
A：Protein marker；B：Permeabilizing solution；1–5：Fusion proteins（From left to right
for induction time：24，20，16，12，8 h）.

3 讨论
CHI 在植物中一般为单基因编码，虽然研究发现在矮牵牛中存在第 2 个与 CHI 同源的基因，但
该基因不参加黄酮代谢途径（van Tunen et al.，1988）。本研究中仅得到红掌 1 条 CHI 序列，并成
功克隆得到 AnCHI 基因的全长 cDNA 序列，红掌中 CHI 是否也为单基因编码仍需要进一步探究。
生物信息学分析结果表明其编码的蛋白在 21 ~ 219 位氨基酸之间有高度保守的 Chalcone 结构域，属
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于 CHI 基因家族的特征性结构域。基因序列比对和进化树分析表明，AnCHI 与水稻、郁金香等的氨
基酸序列同源性较高，根据 CHI 基因在物种进化上的高度保守性，推断其编码的蛋白应与其他功能
已明确的物种的 CHI 基因具有相似的功能——催化分子内环化反应，使双环的查尔酮转化为有生物
活性的三环（2S）–黄烷酮（Shimada et al.，2003）。CHI 蛋白具有三维折叠形式，这种特殊的折
叠形式是植物特有的基因标记（Gensheimer & Mushegian，2004）。通过研究苜蓿 CHI 蛋白的三维
结构，发现 T48、Y106、N113、T190 氨基酸残基在 CHI 的催化反应中起着重要作用，共同构成了
CHI 的活性中心（Jez et al.，2000），且前 3 个残基在不同植物中高度保守。而在红掌 CHI 中，丝
氨酸（Serine）取代了第 190 位的苏氨酸（Thr），为非豆科植物所特有的活性中心。
CHI 基因具有组织表达特异性，且集中表达在花青素含量高的组织中。研究发现在七彩红竹中
IhCHI 在红色幼秆中表达量明显高于无色幼秆与成熟茎秆（王晨晨 等，2014）；花生 CHI 基因主
要在花青素含量高的组织中表达，在花和根中的表达量远高于茎（Liu et al.，2015）。AnCHI 在红掌
中的表达也呈现相似规律，主要集中在佛焰苞中表达，且佛焰苞发育前期的表达量（S1 ~ S4）明显
高于后期（S5 ~ S8），在根及肉穗中表达量较低；同时研究发现，红掌佛焰苞不同发育时期颜色及
花青素含量的变化趋势基本与该基因表达量变化一致，在佛焰苞发育初期花青素含量较高，而在发
育后期花青素含量逐渐下降。从佛焰苞不同发育时期 AnCHI 的表达水平与花青素含量的相关性分析
发现，佛焰苞中 AnCHI 的表达量与花青素含量之间显著正相关。有研究表明类黄酮合成途径中的酶
结构基因主要在转录水平上受到调控（Davies & Schwinn，2003），说明 AnCHI 基因主要在转录水
平上感应各种信号的调控，在佛焰苞的发育早期开始表达，对花青素的合成及积累起着关键性作用。
本研究中 AnCHI 在原核中的正确表达，使得可以开展运用酵母双杂方法来克隆研究与 CHI 互
作的其他蛋白的后续试验；AnCHI 的克隆、序列分析和蛋白表达为下一步研究其酶活性提供支持，
通过超表达或抑制表达的方法深入研究其在花青素合成途径中的作用，为人工改良花色提高其观赏
价值奠定理论基础。

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