全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (3) : 729 - 734
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 12 - 22; 修回日期 : 2007 - 03 - 05
基金项目 : 广州市农业新品种招标项目 ( GK023104)3 E2mail: zszhang@ scau1edu1cn
红掌四倍体的离体诱导及其鉴定
张志胜 13 , 黎扬辉 2 , 姜　蕾 1 , 李　运 1 , 王朱莹 1 , 夏　晴 2 , 易懋升 2
(1 华南农业大学广东省植物分子育种重点实验室 , 广州 510642; 2 广州花卉研究中心 , 广州 510360)
摘 　要 : 以愈伤组织为诱导材料 , 采用秋水仙素处理方法进行了红掌四倍体的离体诱导。结果发现 ,
红掌四倍体诱导率因处理方法、秋水仙素浓度和处理时间不同而异。采用液体培养的四倍体诱导率比固体
培养的高 , 低浓度秋水仙素的诱导率比高浓度的高 , 长时间处理的诱导率比短时间处理的高 , 基因型对四
倍体诱导率影响不明显。在含 012 g·L - 1秋水仙素的液体培养基中振荡培养 14 d, 四倍体诱导率最高 , 为
4515%。四倍体红掌的花药和花粉比二倍体的大 , 植株粗壮 , 叶片和佛焰苞大而厚 , 颜色深 , 叶片下表皮
上的气孔密度小 , 长度长。改良压片法与气孔长度和密度鉴定法是鉴定红掌四倍体的可靠方法。
关键词 : 红掌 ; 多倍体 ; 气孔鉴定 ; 细胞学鉴定 ; 愈伤组织
中图分类号 : S 682136　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0320729206
In V itro Tetraplo id Induction and Its Iden tif ica tion in A n thu rium andraeanum
ZHANG Zhi2sheng13 , L I Yang2hui2 , J IANG Lei1 , L I Yun1 , WANG Zhu2ying1 , XIA Q ing2 , and YIMao2sheng2
(1 Guangdong Provincia l Key Labora tory of P lan t M olecu lar B reed ing, Sou th China A gricu ltural U niversity, Guangzhou 510642,
Ch ina; 2 Guangzhou Flow er Research Center, Guangzhou 510360, China)
Abstract: Calli were emp loyed to establish the technical system of tetrap loid induction in An thu rium an2
draeanum by using colchicine treatment method. The results showed that the induction rate of tetrap loid in
vitro depended on treatment method, concentration of colchicine and duration of treatment. The lower the con2
centration of colchicine was, the higher the induction rate was. A t the same concentration of colchicine, the
induction rate of tetrap loid using liquid culture was higher than that using solid culture, and the longer the du2
ration of treatment was, the higher the induction rate was. The highest induction rate of tetrap loid, 4515% ,
was obtained from the calli cultured in the liquid medium supp lemented with 012 g·L - 1 colchicine for 14 d
on a rotator. The induction rate was not affected by genotype. Tetrap loid of A nthurium and raeanum was char2
acterized by larger and thicker leaves and spathes with deeper color and larger size of pollen, anther and
p lant. Its length of stomatal cell on lower ep iderm is leaf cell was longer than that of dip loid, while the density
of stomata was less than that of dip loid. This indicated that tetrap loids of An thu rium andraeanum could be p ro2
duced by colchicine treatment and accurately determ ined by the imp roved squash method, the length of stoma2
tal cell and the density of stomata.
Key words: An thu rium andraeanum ; Polyp loid; Stomatal app raisal; Cytological app raisal; Callus
多倍体育种是植物育种的重要手段 ( Eeckhaut et al. , 2004)。多倍体因具有花大 , 重瓣性强 , 花色
艳丽 , 花期长 , 花朵对称 , 抗性强等特点 , 越来越受到植物育种家的重视。近年来 , 国内外对观赏植物
多倍体的诱导和鉴定进行了大量研究 , 已在白掌 ( Eeckhaut et al. , 2004)、虞美人 (马新才 等 ,
2003)、沉香虎头兰 (李涵 等 , 2005a)、齿瓣石斛 (李涵 等 , 2005b)、花叶绿萝 (张兴翠 , 2004)、芦
荟 ( Imery & Cequea, 2001; 王俐 等 , 2001; 张兴翠 等 , 2001)、香石竹 (瞿素萍 等 , 2004)、三色堇
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园 　　艺 　　学 　　报 34卷
(郑思乡 等 , 2003)、百合 ( Proscevicius et al. , 2003; 郑思乡 等 , 2004)、金鱼草 (胡秀 等 , 2004)、
非洲紫罗兰 ( Seneviratne &W ijesundara, 2004)、杜鹃 (V¾inÊl¾, 2000) 等观赏植物上获得了多倍体。
红掌 (A nthurium andraeanum L ind. ) 是二倍体 , 是世界流行的切花和盆花 , 市场前景十分广阔
(姜蕾 等 , 2006)。目前红掌育种主要采用杂交育种方法进行 , 国内外尚未见到红掌多倍体育种的研
究报道。本研究以红掌品种 ‘玉女 ’和 ‘热情 ’为材料 , 研究红掌四倍体的诱导和鉴定方法 , 旨在
建立红掌多倍体诱导和鉴定技术体系 , 为开展红掌多倍体育种奠定技术基础。
1　材料与方法
111　材料
取 ‘玉女 ’ ( Pink Champ ion) 和 ‘热情 ’ ( Trop ical) 的盆栽植株幼叶进行组织培养 , 诱导出愈伤
组织 , 以继代 4代的愈伤组织为试验材料进行四倍体诱导试验。
112　方法
11211　四倍体诱导　采用固体培养和液体振荡培养两种处理方法进行。固体培养诱导是将生长旺盛
均匀的红掌愈伤组织分别接种到含 0、0105、011、012、013和 016 g·L - 1秋水仙素的固体培养基上 ,
处理 30 d; 液体培养诱导是将红掌愈伤组织分别接种到含 012、015和 1 g·L - 1秋水仙素的液体培养
基中 , 在转速为 90 r·m in - 1的摇床上振荡培养 3～14 d, 然后将处理后的愈伤组织转接到不含秋水仙
素的相同固体培养基上继续培养到 30 d。两种诱导方法每一处理均设 2个重复 , 10瓶为 1个重复 ,
每瓶 3块愈伤组织 , 处理在温度 ( 28 ±2) ℃、散射光的培养室中进行 , 基本诱导培养基为 N itsch
(NH4NO3 720 mg·L - 1 ) + 015 mg·L - 1 BA + 015 mg·L - 1 NAA + 015 mg·L - 1 2, 42D + 30 g·
L - 1蔗糖 + 5% 椰子汁。处理后的愈伤组织接种到不含秋水仙素的诱导培养基上培养 2代 (每代 30
d) 后 , 转接到 N itsch (NH4 NO3 720 mg·L - 1 ) + 015 mg·L - 1 BA + 015 mg·L - 1 KT + 012 mg·
L - 1 NAA + 5%椰子汁 + 30 g·L - 1蔗糖 + 715 g·L - 1卡拉粉进行芽分化 , 当芽长至 3～4 cm时 , 转
接到生根培养基 N itsch (NH4 NO3 720 mg·L - 1 ) + 012 mg·L - 1 BA + 1 mg·L - 1NAA + 15 g·L - 1蔗
糖 + 1 g·L - 1 AC上诱导生根。从再生植株群体中 , 随机抽取一定数目的植株进行染色体鉴定 , 计算
四倍体诱导率 ( % ) =四倍体植株数 (株 ) /鉴定植株数 (株 ) ×100。
11212　再生植株的倍性鉴定 　细胞学鉴定 : 参考 Cotias2de2O liveira等 (1999) 的压片法。具体步骤
如下 : 切取再生植株幼嫩的根尖 013～015 cm; 于 18℃黑暗条件下 , 用 01002 mol·L - 1的 82羟基喹啉
处理 6～8 h, 每隔 2 h换一次处理液 ; 将预处理后的根尖用清水洗净 , 于 4℃条件下用新鲜配制的卡
诺固定液 (95%乙醇 ∶冰醋酸 = 3∶1) 固定 18～24 h; 弃去固定液 , 将根尖置于 37℃水浴中 , 用 1
mol·L - 1 HCl酸解 40～60 m in, 然后用蒸馏水水洗 3次 ; 用卡诺固定液后固定 18～24 h; 制片前根尖
先在蒸馏水内软化 1 h, 然后切取根尖的分生组织放在预先滴一滴卡诺固定液的载玻片上 , 用镊子压
碎根尖 , 弃去残渣 , 在酒精灯上烤干 ; 滴一滴石炭酸品红染料进行染色 , 待染料快干时 , 盖上盖玻
片 , 快速经过火焰 6～7次。在 O lympus2IX71倒置显微镜下观察 , 拍照。
气孔鉴定 : 气孔长度和密度的测量采用印迹法 (张秀芳 等 , 2002)。具体方法如下 : 选取植株
中上部成熟叶片 , 用蒸馏水擦洗叶片下表面后 , 在叶片的下表面中部约 1 cm ×3 cm大小的面积上均
匀涂上一层无色指甲油 (Maypelline) , 待指甲油干燥后 , 将指甲油膜取下。将膜与叶片接触的一面向
下置于载玻片上 , 盖上盖玻片 (用镊子稍加压力 , 使膜平展 ) , 然后在 10 ×16倍镜下随机观察 10个
视野 , 重复 3次 , 计录各视野中的气孔数 ; 在 40 ×16倍镜下随机观察 10个气孔 , 用标定好的目镜测
微尺测量气孔长度。气孔密度由如下公式求出 :
气孔密度 (个 /mm2 ) =各视野中气孔个数 (个 ) /视野的真实面积 (mm2 )。
11213　统计分析 　统计分析以 SPSS软件进行 , 平均数据以 “平均数 ±标准误 (SE) ”表示。
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　3期 张志胜等 : 红掌四倍体的离体诱导及其鉴定 　
2　结果与分析
211　四倍体的诱导
采用秋水仙素处理愈伤组织的方法进行了红掌四倍体的诱导 (表 1)。结果发现 , 固体培养和液
体培养处理均能有效地诱导四倍体 , 但液体培养的四倍体诱导率比固体培养的高。在 0105～110 g·
L - 1范围内 , 秋水仙素浓度越高 , 四倍体诱导率越低。在同一秋水仙素浓度下 , 处理时间越长 , 四倍
体诱导率越高。012 g·L - 1秋水仙素振荡培养 14 d的四倍体诱导率最高 , 为 45145%。对未经秋水仙
素处理的 Pink Champ ion和 Trop ical愈伤组织再生植株进行了染色体鉴定 , 未发现有多倍体植株。说
明秋水仙素能有效诱导红掌四倍体产生。
表 1　红掌 ‘P ink Cham p ion’四倍体的诱导率
Table 1　Tetraplo id induction ra te of A n thu rium andraeanum P ink Cham p ion
秋水仙素浓度
Concentration of colchicines
( g·L - 1 )
处理方法
Treatment method
处理时间
Duration of
treatment( d)
鉴定植株数
Number of p lants
determ ined
四倍体植株数
Number of tetrap loid
p lants
诱导率
Induction rate
( % )
0105 固体培养 Solid culture 30 31 13 41194
011 固体培养 Solid culture 30 39 15 38146
012 固体培养 Solid culture 30 32 12 37150
013 固体培养 Solid culture 30 36 10 27178
016 固体培养 Solid culture 30 32 9 28113
012 液体培养 L iquid culture 14 33 15 45145
10 39 17 43159
015 液体培养 L iquid culture 10 36 15 41167
5 34 12 35129
110 液体培养 L iquid culture 5 32 11 34138
3 39 10 25164
0 固体培养 Solid culture 0 50 0 0
　　培养基 Medium: N itsch (720 mg·L - 1 NH4NO3 ) + 015 mg·L - 1 BA + 015 mg·L - 1 NAA + 015 mg·L - 1 2, 42D + 5% coconut
m ilk + 30 g·L - 1 sucrose。
将品种 Trop ical的愈伤组织接种在含 0105 g·L - 1秋水仙素的固体培养基上培养 30 d, 四倍体诱
导率为 39140% , 同一处理下的 Pink Champ ion的四倍体诱导率为 41194%。表明不同红掌品种在相同
处理条件下多倍体诱导率没有明显差异。
212　红掌四倍体的鉴定
21211　红掌四倍体的细胞学鉴定 　采用改良压片法对未经处理和经秋水仙素处理后的再生植株进行
染色体分析。结果发现 , 未经处理的再生植株均为二倍体 , 其染色体数 2n = 2x = 30 (图版 , A、B ) ,
有 1个 B染色体 (图版 , A)。而经秋水仙素处理后的部分再生植株的染色体 2n = 4x = 60, 为四倍体
(图版 , C、D )。
21212　四倍体红掌的气孔特征　由表 2和表 3可知 , Trop ical和 Pink Champ ion的四倍体与二倍体的
气孔长度与气孔密度均存在一定的变异范围 , 四倍体的气孔长度显著大于二倍体 , 但其气孔密度则均
显著小于二倍体。Trop ical和 Pink Champ ion的四倍体与四倍体和二倍体与二倍体在气孔长度上差异不
明显 , 但在气孔密度上存在着明显差异。
对红掌倍性与气孔细胞长度和密度进行相关分析。结果表明 , Pink Champ ion的气孔长度和倍性
呈极显著的正相关关系 [ 0199053 3 , r(0101, 5) = 01875 ] , 而气孔密度和倍性呈极显著的负相关关系
[ - 0188313 3 , r(0101, 5) = 01875 ]; Trop ical的气孔长度与倍性呈显著的正相关关系 [ 0162133 , r(0105, 12)
= 01532 ] , 而气孔密度和倍性呈极显著的负相关关系 [ - 0184783 3 , r(0101, 12) = 01661 ]。说明 , 通过
气孔长度和密度鉴定红掌四倍体是可靠的。
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园 　　艺 　　学 　　报 34卷
表 2　红掌二倍体与四倍体的气孔长度
Table 2　The length of stoma ta l cell of d iplo id and tetraplo id in A n thu rium andraeanum
品种
Cultivar
倍性
Ploidy level
最小值
M inimum value
(μm)
最大值
Maximun value
(μm)
平均值
Mean value
(μm)
t测验 (两尾测验 )
t2test ( two2tail test) P值P2value
Trop ical 2倍体 D ip loid 34119 36161 35138 ±0170 5153713 3 010001
4倍体 Tetrap loid 36182 55116 46109 ±1197
Pink Champ ion 2倍体 D ip loid 33195 36155 35140 ±0177 4120803 3 010084
4倍体 Tetrap loid 46146 47157 46187 ±0126
表 3　红掌四倍体与二倍体的气孔密度
Table 3　The den sity of stoma ta of d iplo id and tetraplo id in A n thu rium andraeanum
品种
Cultivar
倍性
Ploidy level
最小值
M inimun value
(个 /mm2 )
最大值
Maximum value
(个 /mm2 )
平均值
Mean value
(个 /mm2 )
t测验 (两尾测验 )
t2test ( two2tail test) P值P2value
Trop ical 2倍体 D ip loid 35193 42186 38190 ±2106
- 2174643 010177
4倍体 Tetrap loid 15127 30119 21120 ±1155
Pink Champ ion 2倍体 D ip loid 49169 63187 57112 ±4110 - 16114353 3 0
4倍体 Tetrap loid 39139 43199 41160 ±1114
21213　四倍体红掌的形态学特征 　四倍体红掌的花药和花粉明显比二倍体的大 (图版 , E、F、G)。
四倍体红掌植株的外观形态和二倍体有明显差异 (图版 , H、 I、J和 K) , 茎杆相对较粗壮 , 叶片皱、
叶片和佛焰苞质地较厚 , 颜色较深 , 株型较大且生长旺盛 ; 而二倍体植株小 , 茎杆较细 , 叶片和佛焰
苞平整且较薄、颜色较浅。
3　讨论
利用秋水仙素处理组织培养过程中产生的丛生芽、原球茎、体细胞胚、无菌扦插枝等中间繁殖体
是诱导观赏植物多倍体的有效方法。瞿素萍等 (2004) 比较了不同诱导方法对香石竹多倍体的诱导
效果。结果发现 , 无菌茎段浸泡法的效果最好 , 培养基内加秋水仙素法次之 , 注射法和涂抹法无效。
本研究结果表明 , 用秋水仙素处理红掌愈伤组织是诱导红掌四倍体的有效方法。
秋水仙素浓度和处理时间是影响离体诱导多倍体形成的重要因素。张兴翠 (2004) 研究结果表
明 , 012%秋水仙素是诱导花叶绿萝丛生芽产生多倍体的适宜浓度。李涵等 (2005b) 以齿瓣石斛丛
生芽为材料 , 研究秋水仙素浓度和处理时间对多倍体诱导的影响。结果表明 , 在 0～011 g·L - 1内 ,
秋水仙素浓度高 , 植株变异率低 ; 处理时间和变异率之间没有明显的相关性。郑思乡等 ( 2004) 发
现离体培养条件下 , 0105%秋水仙素处理百合不定芽的变异率高于 011%秋水仙素处理的变异率。本
研究结果也表明 , 在 0105～110 g·L - 1内 , 低浓度、长时间处理 , 红掌四倍体诱导率高 , 高浓度、短
时间处理的诱导率低。这与张志胜等 (2005) 在用秋水仙素处理兰花原球茎、胡秀等 (2004) 用秋
水仙素处理金鱼草的实生苗芽和郑思乡等 (2003) 用秋水仙素处理三色堇种子所得到的结果不一致。
本研究结果还表明 , 液体培养基处理的红掌四倍体诱导率高于固体培养基处理的四倍体诱导率 , 说明
液体培养方式有利于发挥秋水仙素对愈伤组织的诱导作用。
直接观察花粉母细胞、根尖或茎尖细胞内的染色体数目是鉴定植物倍性的可靠方法。本研究参考
Cotias2de2O liveira等 (1999) 的压片法 , 建立了适合红掌染色体分析的改良压片法 , 利用该方法以根尖
为材料可获得清晰、分散较好的染色体制片。这为今后开展红掌的倍性育种提供了可靠的鉴定方法。
与二倍体相比 , 四倍体通常表现为叶片厚、颜色深、植株粗壮、花粉粒增大、气孔面积增大、花
瓣厚、质感厚重等现象 (胡秀 等 , 2004; 郑思乡 等 , 2004)。本研究结果亦表明 , 红掌四倍体具有
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　3期 张志胜等 : 红掌四倍体的离体诱导及其鉴定 　
上述形态学特征 , 其气孔长度显著大于二倍体 , 而气孔密度显著小于二倍体 , 这与 Carvalho等
(2005) 在胭脂树 (B ixa orellana L. ) 上的研究结果一致。本研究对倍性和气孔长度与密度的相关分
析结果表明 , 倍性和气孔长度呈极显著的正相关关系 , 而与气孔密度呈极显著的负相关关系。说明通
过检测气孔的长度和密度可以准确地鉴定红掌四倍体。
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图版说明 : A. Pink Champ ion二倍体植株的根尖染色体数 , 2n = 2x = 30 + 1B (箭头 ) ; B. Trop ical二倍体植株的根尖染色体数 , 2n =
2x = 30; C. Pink Champ ion四倍体植株的根尖染色体数 , 2n = 4x = 60; D. Trop ical四倍体植株的根尖染色体数 , 2n = 4x = 60; E. Pink
Champ ion二倍体 (箭头 ) 和四倍体植株 (箭 ) 的花药 ; F. Pink Champ ion二倍体植株的花粉 ; G. Pink Champ ion四倍体植株的花粉 ;
H. Pink Champ ion二倍体 (箭头 ) 和四倍体 (箭 ) 试管苗 ; I. Trop ical二倍体 (箭头 ) 和四倍体 (箭 ) 试管苗 ; J. Pink Champ ion二
倍体 (箭头 ) 和四倍体 (箭 ) 开花植株 ; K. Trop ical二倍体 (箭头 ) 和四倍体开花植株 (箭 )。
Explana tion of pla tes: A. The chromosomal number of root tip of Pink Champ ion, dip loid 2n = 2x = 30 + 1B ( arrow head) ; B. The chromosomal
number of root tip of Trop ical, dip loid 2n = 2x = 30; C. The chromosomal number of root tip of Pink Champ ion, tetrap loid 2n = 4x = 60; D. The
chromosomal number of root tip of Trop ical, tetrap loid 2n = 4x = 60; E. Anthers of dip loid ( arrow head) and tetrap loid ( arrow) of Pink Champ i2
on; F. Pollen of dip loid of Pink Champ ion; G. Pollen of tetrap loid of Pink Champ ion; H. Test2tube seedlings of Pink Champ ion, dip loid ( arrow
head) and tetrap loid ( arrow) ; I. Test2tube seedlings of Pink Champ ion, dip loid ( arrow head) and tetrap loid ( arrow) ; J. Flowering p lants of
Pink Champ ion, dip loid ( arrow head) and tetrap loid ( arrow) ; K. Flowering p lants of Trop ical, dip loid ( arrow head) and tetrap loid ( arrow).
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