全 文 ：园艺学报，2015，42 (3)：569–575.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0575；http：//www. ahs. ac. cn 569
收稿日期：2014–10–20；修回日期：2015–02–03
基金项目：河南省科技攻关项目（132102310428）；国家自然科学基金项目（31270738）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：fudeshang@henu.edu.cn）
桂花 SCoT 标记体系的建立及其在遗传多样性
分析中的应用
袁王俊 1,2，马寅峰 1，董美芳 1，韩远记 1，张维瑞 1，尚富德 1,*
（1 河南大学生命科学学院，河南开封 475004；2 河南大学中药研究所，河南开封 475004）
摘 要：以‘籽银桂’桂花叶片 DNA 为材料，以 2 × Es TaqMasterMix 预混液为基本体系，针对影
响 SCoT-PCR 反应的退火温度、模板 DNA 用量、引物浓度等因素进行优化，建立了适于桂花 SCoT 分子
标记的反应体系。12 μL 反应体系含有 30 ng 模板 DNA，引物浓度为 0.4 μmol · L-1，不同的引物退火温度
分别为 48、49.9、54.3 或 56 ℃。利用该体系对 12 个桂花品种进行分析，扩增条带清晰，扩增产物在 150 ~
2 200 bp 之间。12 条引物共扩增出 244 条带，其中多态性条带 238 条，多态性比率为 97.47%。在相似系
数 0.57 水平处，‘九龙桂’形成第Ⅰ组，其余 11 个品种形成第Ⅱ组。第Ⅱ组中‘柳叶桂’、‘香云’、‘早
籽黄’、‘大花金桂’、‘桂冠籽金桂’、‘鹅黄’、‘籽金桂’和‘醉云’8 个花色不完全相同的品种聚在一起；
‘金桂’、‘早银桂’和‘籽银桂’3 个不同花色的品种聚在一起，说明品种间的亲缘关系与花色不完全相
关，这与其它分子标记结果一致。
关键词：桂花；SCoT 分子标记；退火温度；遗传分析
中图分类号：S 685.13 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）03-0569-07

Establishment and Genetic Diversity Analysis of SCoT Molecular Marker
System for Osmanthus fragrans
YUAN Wang-jun1,2，MA Yin-feng1，DONG Mei-fang1，HAN Yuan-ji1，ZHANG Wei-rui1，and SHANG
Fu-de1,*
（1College of Life Sciences，Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China；2Institute of Chinese Materia Medica，
Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China）
Abstract：In this study，based on the‘Ziyingui’DNA and 2 × Es TaqMasterMix，the SCoT-PCR
amplification system of Osmanthus fragrans was established by optimizing reaction annealing
temperature，the amount of template DNA，primer concentration and other factors. This system contained
30 ng template DNA，0.4 μmol · L-1 primers in 12 μL mixture，and the most suitable annealing temperature
of different primers was 48，49.9，54.3 and 56 respectively. Twelve ℃ Osmanthus fragrans cultivars were
analyzed using this system，and the amplified bands were very clear. The 12 primers generated a total of
244 fragments from 12 Osmanthus fragrans cultivars，and 97.47% of fragments showed polymorphic. At
the level of similarity coefficient 0.57，‘Jiulonggui’was to one group and other cultivars were to another

Yuan Wang-jun，Ma Yin-feng，Dong Mei-fang，Han Yuan-ji，Zhang Wei-rui，Shang Fu-de.
Establishment and genetic diversity analysis of SCoT molecular marker system for Osmanthus fragrans.
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group. In the second group，‘Jingui’，‘Zaoyingui’and‘Ziyingui’were in one subgroup，and the other
eight cultivars were in another subgroup. Our results indicated that genetic relationship between color and
variety was not perfectly correlated，which is consistent with the results of other molecular markers.
Key words：Osmanthus fragrans；SCoT molecular marker；PCR system optimization；genetic
analysis

桂花（Osmanthus fragrans Lour.）观赏和实用兼备，在中国已有 2500 年的栽培历史（向其柏和
刘玉莲，2008；张维瑞 等，2012）。Lee 等（2010）从桂花中筛选出一种能够抑制 β–分泌酶（BACE1）
产生的物质 Secoiridoid glycoside，可用于治疗老年痴呆症。
桂花从种子萌发到开花需要 6 ~ 8 年的时间，育种周期长，而分子标记辅助育种可以缩短育种
年限，提高育种效率（Zhang et al.，2013）。特别是桂花为雄全异株植物（Duan et al.，2013），早期
判定性别对于品种选育非常重要（Hormaza et al.，1994；Alstrom-Rapaport et al.，1998）。
AFLP、RAPD、SSR、ISSR、SRAP 等分子标记已成功用于研究桂花品种间的遗传关系研究，
但这些分子标记具有随机性（Yuan et al.，2011）。而 SCoT（start codon targeted polymorphism）分子
标记是根据植物基因中的 ATG 翻译起始位点侧翼序列的保守性设计单引物并对基因组进行扩增，产
生偏向候选功能基因区显性多态性标记，操作简单，成本低廉，多态性丰富，尤其是能有效地产生
与性状联系的标记，是一种能跟踪性状的新分子标记（Collard & Mackill，2009）。因此，利用 SCoT
这种直接与性状关联的分子标记，对获得的杂交后代和多倍体育种材料进行遗传背景分析，将更有
利于辅助育种（韩国辉 等，2011）。
本试验中拟优化桂花 SCoT-PCR 反应体系，从中筛选出可鉴别桂花性别的引物，为桂花品种亲
缘关系探讨，分子标记辅助育种，尤其是分子遗传图谱构建打下基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料（表 1）均采自河南大学生命科学学院桂花种质资源圃，‘籽银桂’用于优化试验条
件。
表 1 本研究所用试验材料
Table 1 Materials used in this study
编号
Code
品种名称
Cultivar name
花色
Color
性别
Sex of flower
产地
Origin
OS1 九龙桂 Jiulonggui 银白或淡黄白色 Silvery or yellow white 雄花 Male 四川 Sichuan
OS2 柳叶桂 Liuyegui 银白色 Silvery white 雄花 Male 四川 Sichuan
OS3 金桂 Jingui 金黄色 Golden yellow 雄花 Male 上海 Shanghai
OS4 早银桂 Zaoyingui 黄白色 Yellow white 雄花 Male 江苏 Jiangsu
OS5 香云 Xiangyun 黄白色至乳黄色 Yellow white to cream white 雄花 Male 浙江 Zhejiang
OS6 鹅黄 Ehuang 黄白色至乳黄色 Yellow white to cream white 雄花 Male 湖北 Hubei
OS7 籽银桂 Ziyingui 白色至淡黄白色 White to light yellow white 两性花 Bisexual 湖北 Hubei
OS8 籽金桂 Zijingui 金黄色 Golden yellow 两性花 Bisexual 江苏 Jiangsu
OS9 醉云 Zuiyun 金黄色 Golden yellow 两性花 Bisexual 湖北 Hubei
OS10 柱冠籽金桂
Zhuguan Zijingui
黄色 Yellow 两性花 Bisexual 浙江 Zhejiang
OS11 早籽黄 Zaozihuang 浅黄色 Light yellow 两性花 Bisexual 浙江 Zhejiang
OS12 大花金桂 Dahua Jingui 金黄色 Golden yellow 两性花 Bisexual 江苏 Jiangsu
袁王俊，马寅峰，董美芳，韩远记，张维瑞，尚富德.
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2013 年 4 月采摘幼嫩叶片，提取 DNA。36 条 SCoT 引物序列均参照 Collard 和 Mackill（2009）
的报道，由北京三博公司合成；2 × Es Taq MasterMix（由 Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg2+、
dNTPs，以及 PCR 稳定剂和增强剂组成的预混体系）购自北京康为世纪生物科技有限公司；Ezup
柱式植物基因组 DNA 抽提试剂盒来自于上海生工生物工程有限公司；DL2000 marker 购自上海莱枫
生物科技有限公司。
1.2 基因组 DNA 提取与检测
利用 Ezup 柱式植物基因组 DNA 抽提试剂盒提取桂花基因组 DNA，1.0%琼脂糖凝胶电泳初步
判断 DNA 质量后，TE buffer 溶解 DNA，用紫外分光光度计测定 DNA 样品浓度和纯度，并将 DNA
稀释至 50 ng · μL-1。
1.3 SCoT-PCR 扩增及退火温度的筛选
PCR 扩增反应在 S1000 Thermal cycler PCR 仪上进行。设定了 7 个温度梯度：46.6、48、49.9、
52.3、54.3、55.4、56 ℃。扩增程序为：94 ℃预变性 3 min；95 ℃变性 1min，退火 55 s，72 ℃延伸
2 min，35 个循环；最后 72 ℃延伸 5 min。扩增反应结束后加入 2 μL 6× loading buffer，取 6 μL 扩增
产物 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电极缓冲液为 1× TBE，染色后拍照。
1.4 DNA 模板和引物浓度的筛选
为了节省 DNA 和引物，在筛选退火温度基础上，用 10 号引物筛选适宜的 DNA 模板用量和引
物浓度对 PCR 的影响。在 12 μL 体系中分别在 5、10、15、20、25、30、35 和 40 ng 模板条件下进
行 PCR 扩增，筛选合适的模板浓度。随后以 0.2 ~ 0.9 μmol · L-1 引物浓度（0.1 μmol · L-1 为一个梯度）
条件下进行 PCR 扩增，筛选合适的模板浓度。
1.5 筛选引物对 12 个桂花品种的扩增
应用建立并优化好的 SCoT-PCR 反应体系，以 12 个品种的桂花基因组为模板，检验扩增效果。
1.6 数据统计与处理
对扩增清晰且易于辨认的条带采用“0-1”系统记录其位置，在相同迁移位置有带的记为“1”，
无带记为“0”，建立 SCoT 标记的 0、1 矩阵。使用 POPGENE 1.32 软件计算多态位点数、多态性
位点百分率（Yeh et al.，1999）；用 NTSYS-pc2.1 软件按 UPGMA 方法进行聚类分析（Rohlf，2004）。
2 结果与分析
2.1 退火温度的确定
以‘籽银桂’DNA 为模板，根据所设定的退火温度进行 PCR。结果发现，36 对引物中有 12 对
引物（表 2）可以扩增到明显的条带，根据退火温度可以将 12 对引物分为 4 组：4、5、8、11 号引
物适宜退火温度为 48 ℃；2、6、10、24 和 36 号引物为 49.9 ℃；17 号为 54.3 ℃；25 和 31 号为
56 ℃。如图 1，A 所示，当退火温度低于或大于 49.9 ℃时，10 号引物某些区域无条带或扩增条带较
弱，而当温度为 49.9 ℃时条带清晰，最终确定 10 号引物的最佳退火温度为 49.9 ℃。DNA 模板和引
物浓度筛选时均使用 10 号引物。
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表 2 适于 SCoT 分子标记的引物序列和扩增结果
Table 2 The sequences of ScoT primers and amplified results for Osmanthus fragrans
引物编号
Primer ID
退火温度/℃
Annealing
temperature
序列（5′–3′）
Sequences
扩增条带数
Number of
amplified bands
多态性条带数
Number of
polymorphic bands
多态性比率/%
Ratio of polymorphic
alleles
2 49.9 CAACAATGGCTACCACCC 21 20 95.24
4 48 CAACAATGGCTACCACCT 20 18 90.00
5 48 CAACAATGGCTACCACGA 14 14 100.00
6 49.9 CAACAATGGCTACCACGC 22 21 95.46
8 48 CAACAATGGCTACCACGT 21 21 100.00
10 49.9 CAACAATGGCTACCAGCC 18 16 88.89
11 48 AAGCAATGGCTACCACCA 19 19 100.00
17 54.3 ACCATGGCTACCACCGAG 18 18 100.00
24 49.9 CACCATGGCTACCACCAT 22 22 100.00
25 56 ACCATGGCTACCACCGGG 19 19 100.00
31 56 CCATGGCTACCACCGCCT 23 23 100.00
36 49.9 GCAACAATGGCTACCACC 27 27 100.00
平均 Mean 20.33 19.83 97.47
总计 Total 244 238


图 1 退火温度、模板用量和引物浓度对桂花的 SCoT-PCR 反应的影响
Fig. 1 The effects of annealing temperature，different amount of template and different
amount（dosage）of primer on SCoT amplification

2.2 DNA 模板用量和引物浓度的确定
以‘籽银桂’DNA 为模板，在 12 μL 体系中使用 10 号引物，模板用量分别为 5 ~ 40 ng。结果
如图 1，B 所示，模板用量达到 25 ng 以上时均可获得清晰的扩增条带，说明在 12 μL 桂花 SCoT-PCR
体系中 30 ng的DNA用量即能够满足扩展需要，因此最终确定 12 μL体系中DNA 模板用量为 30 ng。
引物浓度分别为 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 和 0.9 μmol · L-1 时，如图 1，C 所示：达到
0.4 μmol · L-1 以上浓度时均可获得清晰的扩增条带，因此最终确定适宜的引物浓度为 0.4 μmol · L-1。
2.3 12 个桂花品种的 SCoT 分析
应用建立的 SCoT 技术体系对 12 个桂花品种（6 个单性花品种和 6 个两性花品种）进行 PCR
扩增和电泳检测（图 2）。结果显示扩增条带清晰，扩增产物在 100 ~ 2 200 bp 之间。表 2 中扩增条
带最少的 5 号引物扩增出 14 条带，36 号引物扩增到最多的 27 条带。12 条引物共扩增出 244 条带，
其中多态性条带 238 条，多态性比率为 97.47%，5、8、11、17、24、25、31、36 号引物均为 100%。
袁王俊，马寅峰，董美芳，韩远记，张维瑞，尚富德.
桂花 SCoT 标记体系的建立及其在遗传多样性分析中的应用.
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图 2 10 号引物对 12 个桂花品种（OS1 ~ OS12）的扩增图谱
Fig. 2 Amplification profiles of 12 cultivars of Osmanthus fragrans（OS1–OS12）by primer 10

分析 12 对引物，结果没有发现与桂花性别相关的分子标记，基于这 36 条引物的 SCoT 分子标
记不能用于桂花的早期性别鉴定。
用 NTSYS-pc2.1 软件计算 12 个品种之间的相似性系数，结果表明，12 个桂花品种之间的遗传
相似性系数范围为 0.475 ~ 0.648 之间。其中相似性系数最高的有 4 对品种，分别为 OS11‘早籽黄’
与 OS12‘大花金桂’；OS11‘早籽黄’与 OS2‘柳叶桂’；OS5‘香云’与 OS10‘柱冠紫金桂’；
OS4‘早银桂’与 OS7‘籽银桂’。相似性系数最低的为 OS3‘金桂’与 OS10‘柱冠籽金桂’，遗传
相似性为 0.492。
聚类结果（图 3）显示，在相似性系数 0.54 处，12 个桂花品种可分为 2 组（Ⅰ和Ⅱ），其中Ⅰ
组只有 OS1‘九龙桂’一个品种，其余都属于Ⅱ组。在相似系数 0.57 水平又可将Ⅱ组分为 2 个亚组
（A 和 B），其中 A 亚组包括 OS2‘柳叶桂’、OS5‘香云’、OS11‘早籽黄’、OS12‘大花金桂’、
OS10‘桂冠籽金桂’、OS6‘鹅黄’、OS8‘籽金桂’和 OS9‘醉云’8 个品种，B 亚组包括 OS3‘金
桂’、OS4‘早银桂’和 OS7‘籽银桂’3 个品种。


图 3 12 份桂花品种材料（OS1 ~ OS12）SCoT 标记聚类图
Fig. 3 Dendrogram of 12 Osmanthus fragrans cultivars（OS1–OS12）based on SCoT marker
3 讨论
本试验从 36 条 SCoT 引物中筛选出可用于桂花 SCoT 分子标记的引物 12 条，适宜的退火温度
分别为 48 ℃（4、5、8、11 号引物）、49.9 ℃（2、6、10、24 和 36 号引物）、54.3 ℃（17 号引物）
和 56 ℃（25 和 31 号引物）。韩国辉等（2011）优化了柑橘 SCoT 分子标记适宜的退火温度，所有
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引物退火温度均为 49 ℃；张维瑞等（2013）用 SCoT 分子标记研究了益母草的遗传多样性，适宜
的退火温度分别为 52 和 58 ℃；赵梦然等（2012）用 SCoT 分子标记研究了中国野生白灵菇遗传多
样性，其所用退火温度均为 55 ℃。各个研究所用的退火温度不一致，可能是由于各自所用的反应
条件和材料不一致所致。因此，进行 SCoT 标记时应先优化退火温度，以达到理想的扩增效果。
用筛选的 12 条引物对 12 个桂花品种进行了扩增，共扩增出 244 条带，多态性条带为 238 条，
多态性比率高达 97.47%，其中 8 条引物的多态性为 100%。陈虎等（2010）用 24 条引物对 24 个龙
眼品种进行 PCR 扩增，共扩增出 211 条带，其中 181 条具有多态性，多态性带比率为 85.8%。赵梦
然等（2012）用 SCoT 分子标记研究了中国野生白灵菇遗传多样性，9 条 SCoT 引物共产生 147 条带，
多态性条带比率为 92.52% 。韩国辉等（2011）用 11 条引物在 4 株沙田柚四倍体及其二倍体亲本中
共扩增出 84 条带，其中多态性条带 46 条，多态性比率为 54.8%。李丕睿等（2013）在研究菊属植
物遗传多样性时，分别采用 1.0%琼脂糖凝胶电泳和 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，
发现聚丙烯酰胺凝胶电泳得到的条带更加丰富。本研究中的扩增条带数、多态性条带数都较高，主
要原因是检测时使用的是分辨率较高的 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，这与张维瑞等（2013）用
10 对引物扩增 66 个益母草个体的扩增结果相似。
从聚类结果可以看出，‘早银桂’（雌蕊败育）与‘籽银桂’（两性花）聚在一起，说明花的性
别与品种间的亲缘关系没有必然联系。‘九龙桂’形成第Ⅰ组，其余品种形成第Ⅱ组。第Ⅱ组中，8
个花色不完全相同的品种聚在一起；3 个不同花色的品种聚在一起，可见品种间的亲缘关系与花色
不完全相关。其他研究者在用 AFLP（韩远记 等，2008）、ISSR（李梅 等，2009）、RAPD（尚富德
等，2004）分子标记研究桂花遗传多样性时也发现不同品种群间的品种聚在一起。本研究中‘金桂’、
‘早银桂’和‘籽银桂’聚在一起，但作者在用 AFLP 研究品种亲缘关系时则发现，这三者分属于
3 个不同的分支，不同的分子标记方法得到的结果不一致，可能是 AFLP 在基因组中是随机扩增的，
而 SCoT 可能得到与目标性状基因距离较近的位点，产生偏向候选功能基因区的标记。分析亲缘关
系与产区的相关性，没有明显的关系。

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