全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（10）：1961–1968 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–05–20；修回日期：2013–09–09
基金项目：现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-23）；国家自然科学基金项目（30972403，31370688）；江苏高校优势学
科建设工程项目（XDYY2011）；江苏省科技支撑计划项目（BE2011319，BE2012440，BE2012441）；苏州市现代生态茶业工程技术研究中
心项目（SZGD201067，WNZ100）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：lxh@njau.edu.cn，fangwp@njau.edu.cn；Tel：025-84395182）
茶树低温胁迫转录因子 CsICE 的亚细胞定位及
表达分析
尹 盈，张 玥，胡靖妍，周 琳，王明乐，房婉萍*，黎星辉*
（南京农业大学茶叶科学研究所，南京 210095）
摘 要：以茶树[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze]品种‘迎霜’为试验材料，采用 PCR 技术扩增出与
茶树低温胁迫相关转录因子 CsICE 的开放阅读框，长度 783 bp。采用荧光定量 PCR 分析 CsICE 的表达量，
结果表明 CsICE 在根、茎、叶、花和果中都有表达，在叶中表达量最高，是根、茎、果中表达量的 4 倍；
在 500 μmol · L-1 ABA 处理下，幼叶中 CsICE 表达峰值是对照的 40 倍，在 4 ℃低温处理下，最高值是对
照的 20 倍，在 10%聚乙二醇 6000 处理的干旱条件下表达量最高值只有对照的 5 倍。亚细胞定位结果显
示 CsICE 定位在细胞核上。
关键词：茶；CsICE；亚细胞定位；表达量
中图分类号：S 571.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）10-1961-08

Subcellular Localization and Expression Analysis of CsICE Transcription
Factor Related to Cold Stress in Tea Plant
YIN Ying，ZHANG Yue，HU Jing-yan，ZHOU Lin，WANG Ming-le，FANG Wan-ping*，and LI Xing-hui*
（Tea Research Institute，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）
Abstract：The 783 bp length ORF of transcription factor CsICE，related to the cold stress in tea plant
[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze]，was amplified by PCR，and cultivar‘Yingshuang’was used as the
material. The expression levels of CsICE were analyzed by real time quantitative PCR. The result showed
that CsICE expressed in all the tissues，including roots，stems，leaves，flowers and fruits. Furthermore，
the expression level in leaves was the highest，almost four times higher than that in roots，stems and fruits.
The expression level of CsICE was 40 times under ABA stress（500 μmol · L-1）higher than that in
untreated sample，while under cold treatment at 4 ℃，it was 20 times higher than the control. Under 10%
polyethyleneglycol treatment，the CsICE expression level was only 5 times higher than that in untreated
sample. The localization assays result indicated that CsICE protein localized in the cell nucleus.
Key words：tea plant；CsICE；subcellular localization；expression level


1962 园 艺 学 报 40 卷
低温不仅影响植物的生长发育，而且影响其产量和品质，同时温度也严格限制了物种的分布区
域（Thomashow，1999）。在中国春季茶树遭受低温冷害与冻害已经成为制约茶叶产业发展的重要问
题。预防低温特别是“倒春寒”对茶树生长和茶树生产造成的影响，变得越来越重要，研究茶树的
抗寒机理对提高茶树的抗寒性，以及选育抗寒性新品种都具有重要意义。
植物抗寒分子机理的研究表明，在低温条件下，存在于植物体内的大量转录因子会激活一系列
基因的表达，从而可以增强植物对低温的抵抗能力，有助于植物安全度过低温时期（Fowler &
Thomashow，2002）。植物体内的转录因子根据 DNA 结构域的不同，主要分为 bZip 类转录因子、
AP2/EREBP 类转录因子、zinc-finger 类转录因子、bHLH（basic helix-loop-helix）类转录因子及
MYB/MYC 类转录因子等十几类（刘强 等，2000）。ICE[Inducer of CBF（c-repeat-binding-factor）
expression]属于 MYB/MYC 类转录因子，含有 bHLH 结构域，与 CBF 基因上的 MYBR/MYCR 元件
结合，诱导 CBF 基因的表达（Chinnusamy et al.，2003）。
Gilmour 等（1998）推测植物细胞内存在一种 CBF 表达诱导物，将其命名为 ICE，调控
CBF/DREB1（c-repeat-binding-factor/dehydration-responsive-element-bingding 1）基因的表达。亚里桑
那大学研究人员Chinnusamy等（2003）从拟南芥中分离到第一个 ICE1基因，证实了Gilmour等（1998）
的推测。并指出 ICE1 定位于细胞核中，属于组成型的表达基因，在低温条件下启动 CBF 表达；还
推测当植物处于正常的环境下，ICE 蛋白活性是不活跃的，不能与 CBF 基因启动子有效结合，CBF
基因不能表达；当 ICE 蛋白被低温胁迫所激活，达到活跃的状态，CBF 基因启动子上的顺式作用元
件可以与 ICE 蛋白有效的结合，激活植物体内相关冷反应通路。
Chinnusamy 等（2003）将 ICE1 转入到拟南芥中，得到的 ICE1 过表达转基因植株，比野生型
拟南芥有更强的抗寒性；发生 ICE1 突变的拟南芥植株，CBF3 的表达减少，对 CBF1 和 CBF2 的影
响较小，表明 ICE1 对 CBF3 是正调控。Gilmour 等（1998）还推测 ICE 除了可以调控 CBF 的转录，
可能还调控其它与低温相关基因。本研究中通过对 CsICE（茶树 ICE 基因）的亚细胞定位及表达量
分析，为进一步分析其功能提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
以 3 年生‘迎霜’茶树[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze]盆栽苗和新鲜洋葱表皮为试验材料。
大肠杆菌（Escherichia coli）菌株 DH5α 由南京农业大学茶学研究所实验室保存；亚细胞定位载
体 pJIT166-GFP 由南京农业大学作物遗传与育种国家重点实验室惠赠；r-Taq 酶、Ex-Taq 酶、pMD18-T
simple 载体、dNTPs、DNA Marker、BamHⅠ酶、SacⅠ酶、XbaⅠ酶、荧光定量染料 SYBR GreenⅠ、
T4 DNA 连接酶、M-MLV 反转录酶购自 TaKaRa 公司；DNA 回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自 Axygen
公司；RNA simple Total RNA Kit 购自天根公司。所有引物委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成，
其编号及序列见表 1。
1.2 方法
1.2.1 不同胁迫处理‘迎霜’茶苗
选择 3 年生‘迎霜’茶苗，放入 RXZ 型智能人工气候箱，昼夜温度 25 ℃/20 ℃，光周期 12 h/12
h，光照强度 30 klx，相对湿度 75% ~ 80%。培养两周后对茶苗进行不同胁迫处理，包括 4 ℃低温、
500 μmol · L-1 脱落酸（ABA）和 10%聚乙二醇 6000（PEG6000）处理。分别于处理 0、1、2、4、6、
10 期 尹 盈等：茶树低温胁迫转录因子 CsICE 的亚细胞定位及表达分析 1963

8、12 和 24 h 时取一芽两叶各 0.1 g，将所取材料放入液氮速冻，–70 ℃冰箱保存。
2012 年 4 月取正常生长的‘迎霜’茶苗的根、茎和叶各 0.1 g，同年 10 月份取正常生长的‘迎
霜’茶苗的花和果各 0.1 g，将所取材料放入液氮速冻，–70 ℃冰箱保存。
1.2.2 CsICE开放阅读框的扩增
采用 RNA simple Total RNA Kit（天根公司）提取茶树叶片总 RNA，以 mRNA 为模板，以 P01
为引物，70 ℃反应 5 min，冰上冷却 5 min，合成 cDNA 第一条链。然后再加入 5× M-MLV 缓冲液
5 μL，dNTP 混合物（10 mmol · L-1）1.25 μL，RNase 抑制剂（40 U · μL-1）0.5 μL，RTase M-MLV（RNase
H-）（200 U · μL-1）1 μL，DEPC 处理水（RNase free ddH2O）加至 20 μL。42 ℃反应 1 h，70 ℃反
应 15 min 后，冰上冷却，–20 ℃保存备用。
以 cDNA 为模板，用引物 P02/P03 进行 PCR 扩增，反应体系为 20 μL：引物 P02/P03 各 1 μL，
Ex-Taq 酶 0.20 μL，10× ExPCR buffer（Mg2+ free）2 μL，MgCl2 1.6 μL，dNTP Mixtures 1.6 μL，cDNA
1 μL，ddH2O 加至 20 μL。反应程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，62 ℃退火 30 s，72 ℃
延伸 1 min，35 个循环后，72 ℃继续延伸 10 min，4 ℃下保存。1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，DNA
回收试剂盒回收目的片段后，连接到 pMD18-T-simple 载体并转化至大肠杆菌 DH5α 中，提取质粒经
PCR 鉴定后委托南京金斯瑞生物科技有限公司（http：//www.genscript.com.cn）测序。
1.2.3 CsICE基因的亚细胞定位
（1）亚细胞定位载体的构建
以 CsICE 的 ORF 正确的克隆提取质粒作为模板，用引物 P04/P05 进行 PCR 扩增，选取测序正
确的克隆提取质粒，经 XbaⅠ和 BamHⅠ双酶切，回收目的条带；同时 pJIT166-GFP 载体也用 XbaⅠ
和BamHⅠ双酶切，回收空载体片段；用T4DNA连接酶连接回收到的两个条带，得到pJIT166-GFP/ICE
融合表达载体，将重组表达载体转入 DH5α，选取阳性克隆提取质粒，对重组表达载体进行 PCR 和
双酶切检测，并测序分析。
（2）亚细胞定位方法
参考杨光等（2011）的方法，加以改进。
制备微粒子弹：取浓度为 50 mg · mL-1 金粉悬浮液 20 μL，加入 CaCl2 （2.5 mol · L-1）50 μL，
加入亚精胺（0.1 mol · L-1）20 μL，加入 5 μg 重组表达载体质粒（pJIT166-GFP/ICE），充分混匀（阳
性对照中加入 5 μg pJIT166-GFP 空载体质粒），转速 12 000 r · min-1 离心 1 min，冰浴 15 min，用 70%
乙醇和无水乙醇各洗涤沉淀 1 次，50 μL 无水乙醇重新悬浮沉淀。
基因枪轰击洋葱表皮：选取新鲜的洋葱，将幼嫩的洋葱表皮切成约 1 cm 的小块，将切好的洋葱
表皮摆放在 MS 高渗培养基上，25 ℃黑暗培养 4 h，选用 1 100 psi 的压力膜，在轰击膜中央点上金
粉和重组表达载体质粒（pJIT166-GFP/ICE）混合物，然后在超净工作台中吹干。同时设置阳性对照，
在另一张轰击膜上点上金粉和空载体质粒（pJIT166-GFP）混合物，在超净工作台中吹干。使用
PDS1000/He 型基因枪（Bio-Rad）轰击材料，轰击距离 6 ~ 9 cm，真空度是 25 inHg。经处理后的洋
葱表皮细胞经 25 ℃黑暗培养 16 ~ 24 h 后制片，在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光在细胞中的分
布情况。
1.2.4 荧光定量 PCR检测 CsICE基因的表达量
提取供试材料的总 RNA 并反转录合成 cDNA，根据 CsICE（GQ229032.1）的序列，利用 Primer
Premier 5.0 进行定量引物的设计，引物序列见表 1（P06/P07），分别以 GAPDH 和 β-actin（孙美莲 等，
2010）为内参基因。荧光定量 PCR 反应体系为：2× SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上下游引物各 0.4 μL，
cDNA 1 μL，RNase Free ddH2O 加至 20 μL。PCR 反应条件为：95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性 5 s，
60 ℃退火 30 s，40 个循环；反应结束后分析荧光值变化曲线以及熔解曲线。试验重复 3 次，利用
1964 园 艺 学 报 40 卷
图 1 琼脂糖凝胶电泳检测 CsICE 的开放阅读框条带
M：DNA 标准品（DL 2000）；1：引物 P02/P03 扩增的产物。
Fig. 1 Detectionthe ORF of CsICE by agarose gel electrophoresis
M：DNA marker（DL 2000）；1：PCR product amplified by P02/P03.
图 2 重组表达载体 pJIT166-GFP/ICE 的 PCR 检测（A）
和双酶切检测（B）
Fig. 2 Detection of pJIT166-GFP/ICE recombinant expression
plasmid by PCR（A）and double enzyme digestion（B）
LinRegPCR 软件（Ramakers et al.，2003）和 Excel 软件对试验数据进行分析。

表 1 引物序列及用途
Table 1 Sequence of primers and application
编号 Code 序列（5′–3′）Sequence 用途 Use
P01 GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT 反转录 Reverse transcription
P02 ATGGAAGTGAGTGAAGTGAATGAG
P03 AAGAAACCTACATCATGAAGCCAGC
CsICE 基因的 ORF 扩增 ORF amplification of CsICE gene
P04 GCTCTAGAATGGAAGTGAGTGAAGTGAATGAG
P05 CGGGATCCAAGAAACCTACATCATGAAGCCAGC
亚细胞定位 subcellular localization
P06 ATGTTTTGTAGCCGCAGAC 荧光定量 PCR Real time quantitative PCR
P07 GCTTTGATTTGGTCAGGATG
注：下划线为添加的酶切位点，TCTAGA 为 XbaⅠ酶切位点，GGATCC 为 BamHⅠ酶切位点；双下划线为添加的保护碱基 GC 和 CG。
Note：TCTAGA and GGATCC underlined in primers indicate restriction enzyme sites of XbaⅠand BamHⅠ；GC and CG double underlined in
primers indicate protective bases.
2 结果与分析
2.1 CsICE 基因开放阅读框的扩增
提取茶树叶片 RNA 后，经 1.2%琼脂糖电泳检测其质量，28S 和 18S 条带清晰，用核酸蛋白仪
检测其质量和浓度，RNA 浓度为 563 μg · mL-1，OD260/280 值为 1.81，OD260/230 值为 2.05；样品符合
下一步试验要求。
如图 1 所示，根据 GenBank 数据库中登录的 CsICE 基因序列（GQ229032.1）设计特异性引物
（P02/P03），以茶树叶片 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，获得该基因的开放阅读框（783 bp）。
2.2 CsICE 蛋白的亚细胞定位
将得到的重组表达载体 pJIT166-GFP/ICE 进行 PCR 和双酶切检测（图 2），检测结果表明载体
构建成功，可用于亚细胞定位试验。载体骨架结构为 pJIT166-GFP 载体，携带有 2 × 35S 启动子，
GFP 报告基因，氨苄青霉素（Amp）抗性筛选基因；CsICE 插入 2 × 35S 下游位点，选用 XbaⅠ、
BamHⅠ两个酶切位点。因为 CsICE 蛋白和 GFP 蛋白是融合表达，利用 GFP 蛋白表达会发出绿色荧
这一便于观察的特点，来对 CsICE 蛋白的表达进行定位。


10 期 尹 盈等：茶树低温胁迫转录因子 CsICE 的亚细胞定位及表达分析 1965

图 4 低温处理下 CsICE 基因的表达量
Fig. 4 The expression levels of CsICE under cold stress（4 ℃）
将基因枪轰击过的洋葱表皮在 25 ℃黑暗条件下培养 16 ~ 24 h，然后在激光共聚焦显微镜下观
察绿色荧光在细胞中的分布情况。黑暗培养时间不宜过长，因为 GFP 蛋白的表达是瞬时的，持续时
间不长久。如果黑暗培养时间过长，将观察不到绿色荧光，或荧光强度降低，不适合观察。亚细胞
定位结果见图 3，可以看出，CsICE 蛋白只定位在细胞核中，只在细胞核中观察到绿色荧光；而阳
性对照中，绿色荧光分布在细胞膜、细胞核和细胞质中。说明 CsICE 蛋白只作用于细胞核。定位试
验结果与 softberry（http：//linux1.softberry.comberry.-phtml）网站上预测的一致。分析 CsICE 的序列，
序列中含有核定位信号（NLS）区域，说明 CsICE 蛋白是核定位蛋白。

















图 3 CsICE 蛋白（A）和 GFP 蛋白（B）在洋葱表皮细胞中的定位
Fig. 3 Subcellular localizations of CsICE protein（A）and GFP protein（B）in onion epidermal

2.3 不同胁迫处理下 CsICE 的表达量分析
茶树叶片中 CsICE 基因对低温的响应快，
在 1 h 时明显上调表达，在 2 h 时相对表达量
达到对照的 20 倍（图 4）。CsICE 基因的上调
表达可以启动下游与冷胁迫相关基因的表达，
从而激活整个冷反应通路，提高植物的抗寒能
力。下游基因的上调表达可能对 CsICE 有反馈
调节，使 CsICE 的表达量在上升后又降低并接
近于对照水平（低温处理 4 h、6 h）。随着低温
胁迫的进一步加深（低温处理 12 h），CsICE 的
表达量又得以回升。
CsICE 基因在外源 ABA 作用下，表达量先逐渐上升再下降（图 5）。在 12 h 时相对表达量达到
峰值，是对照的 40 倍，然后由于下游基因的反馈调节作用，表达量又下降。ABA 处理是采用叶面
喷施法，作用效果可能比低温（4 ℃）强，所以表达量显著高于低温处理。
在干旱处理下，CsICE 的表达同低温胁迫下的趋势相近，但是上下调节速率比低温胁迫下快些
（图 6）。CsICE 对干旱的响应也较快，在干旱处理 1 h，表达量显著性上调表达，并达到最高水平。
不过干旱条件下，CsICE 基因表达量不高，最高值只有对照的 5 倍。
1966 园 艺 学 报 40 卷
图 5 外源 ABA 处理下 CsICE 基因的表达量
Fig. 5 The expression levels of CsICE under ABA treatment
（500 μmol · L-1）
图 6 干旱处理下 CsICE 基因的表达量
Fig. 6 The expression levels of CsICE under drought
treatment（10% PEG6000）
图 7 CsICE 基因在茶树不同组织中的表达量
Fig. 7 The expression levels of CsICE


2.4 CsICE 在茶树不同组织中的表达分析
CsICE 在不同组织中的表达量如图 7 所
示，CsICE 在茶树叶中的表达量最高，显著高
于其他组织的表达（P ≤ 0.05），是根、茎、
果中表达量的 4 倍；CsICE 在根、茎、果中的
表达量最低，且无差异（P ≤ 0.05）。说明 CsICE
在茶树中各个组织中都普遍存在，但表达量存
在组织特异性。
3 讨论
近年来，随着植物冷驯化和抗寒分子机理研究的深入，已成功鉴定和证明了抗寒性受几个主效
基因控制，其中主要包括 ICE1、CBF/DREB 基因家族和 COR 基因家族等。同时，随着植物在冷应
答过程中的调控网络逐渐清晰，ICE1-CBF 冷调控途径被认为是提高植物抗寒性的重要信号转导和
基因表达调控途径。ICE1 作为一个重要的抗寒调控转录因子，它所编码的 TF 能特异性地结合到
CBF3 的启动子上，诱导 CBF/DREB1 调控下游基因的转录表达，从而大大提高植物的抗寒性
（Chinnusamy et al.，2003）。由此说明 ICE1 基因在植物的低温应答过程中发挥着显著而重要的作用，
是植物抗寒性提高的关键基因。
本试验中采用 PCR 技术扩增出与茶树低温胁迫相关的 CsICE 转录因子的开放阅读框。为进一
步了解该基因的功能，研究了该基因在细胞中的定位。Chinnusamy 等（2003）指出 AtICE1 是组成
型的表达基因，其编码的蛋白质定位于细胞核中，在冷胁迫下诱导 DREBs 表达。亚细胞定位试验结
果表明 CsICE 定位在细胞核中，这与 AtICE1 的定位结果一致。Bailey 等（2003）的研究，AtICE1
可以编码一种具有 bHLH（basic helix-loop-helix）结构的蛋白，在 bHLH 基因家族中编号为 bHLH116。
通过氨基酸序列比对，茶树 CsICE 中具有 bHLH 结构蛋白，所以推测 CsICE 与 AtICE1 具有相似的
功能。
目前拟南芥中 ICE 转录因子的研究较多，茶树中 ICE 转录因子的功能研究还不够透彻。本研究
通过实时荧光定量 PCR 分析，得到了 CsICE 基因在冷诱导、ABA 处理和干旱胁迫下的表达模式。
在拟南芥中，ICE1 不受环境影响，在植物组织中维持一定的转录水平，但此时转录出的蛋白是没有
10 期 尹 盈等：茶树低温胁迫转录因子 CsICE 的亚细胞定位及表达分析 1967

活性的，只有在受到低温或其他环境的刺激下，ICE1 蛋白才会被进一步修饰成为活性蛋白，从而调
控下游基因的表达（Miura et al.，2007）。所以，推测 CsICE 基因可能和拟南芥的 ICE1 基因类似，
通过低温诱导后可以形成活性蛋白来调控下游基因的表达。
分析 ICE 基因在不同胁迫下的表达量变化，CsICE 基因可以被低温和 ABA 处理所诱导，并呈
显著上调表达；CsICE 基因对干旱胁迫不敏感；本研究结果与陈琳（2011）和向殿军（2012）的研
究结果相似。本研究表明，CsICE 基因受外源 ABA 显著诱导，是因为植物在感受到寒冷信号时，
将会产生内源脱落酸 ABA 等抗寒促进因子，启动植物体内一些抗寒基因的表达。当植物处于逆境
条件下，其体内的 ABA 的含量会增加，与 ABA 结合蛋白（ABA-BP）结合的活性会提高。以往的
研究也表明，外源 ABA 可以引起植物的抗寒性诱导，与低温胁迫有同样的效果，可以启动一些冷
胁迫相关基因的表达，使植物的抗寒性得到提高（Ishitani et al.，1997；Llorente et al.，2000；Li et al.，
2002；Li et al.，2003）。因此 ABA 对 CsICE 表达的显著诱导效果，说明外源 ABA 在提高茶树对非
生物胁迫适应性方面可能具有重要作用。
本研究中，CsICE 基因在茶树根、茎、叶、花和果中均有表达，但表达量不同，在叶中的表达
量最高，其次为花，在根、茎、果中表达量最低，可见 CsICE 基因存在组织表达特异性。其他物种
的 ICE 基因在不同组织中的表达也存在类似的情况，如 BcICE1、LsICE1、RsICE1 基因在大白菜、
莴苣、萝卜的根、叶、茎中也都有表达，在各组织中的表达量不同（向殿军，2012）。VaICE1a 基因
在山葡萄的叶片、休眠芽、花序、卷须以及幼果中都表达，在幼果中的表达量比其他组织高，在叶
片、休眠芽、卷须、花序中的表达量低（王宁，2011）。油菜 BnICE1 在油菜下胚轴、茎和叶中都表
达，下胚轴表达量最高，叶中表达量其次，茎的表达量最弱（张腾国 等，2013）。
本研究结果表明茶树 ICE 可以被低温胁迫显著诱导，可以推测其在茶树适应低温胁迫中发挥重
要作用；同时，外源 ABA 也可显著诱导 CsICE 的表达。在此研究基础上，可望在茶树成熟的再生
体系建立以前，可以利用外源 ABA 驯化茶树；在茶树成熟的再生体系建立之后，将 CsICE 基因转
化到茶树中，以提高茶树的抗逆性。

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