全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（10）：2033–2044 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–05–08；修回日期：2012–07–24
基金项目：国家自然科学基金项目（30972030）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：dongleah@yahoo.com.cn）
牡丹 NCED 基因的克隆和表达分析
王晓庆，张 超，王彦杰，董 丽*
（北京林业大学园林学院，国家花卉工程技术研究中心，北京 100083）
摘 要：通过 RT-PCR 和 RACE 技术克隆得到了牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）中编码 9–顺式–
环氧类胡萝卜素加双氧酶蛋白（NCED）的一条 cDNA 基因全长（暂命名为 Ps-NCED1）。进化树分析显
示 Ps-NCED1 的氨基酸序列与葡萄、马铃薯、胡萝卜等植物中的 NCED 一致性均达到了 70%以上。通过
与拟南芥中 CCD（类胡萝卜素分解加双氧酶）家族氨基酸序列比对后发现，Ps-NCED1 与调控 ABA 合成
的 At-NCED3 一致性最高。对花朵中内源 ABA 的研究发现，ABA 在花朵蕾期及衰老期含量较高，盛开
期时含量较低，表明 ABA 对于植物的开放衰老具有促进作用。相对荧光定量 PCR 分析发现：在花朵完
全开放的牡丹植株中，Ps-NCED1 在根、茎、叶、花托、萼片、花瓣、心皮、雄蕊中的表达量以在根和雄
蕊中较高，在叶和萼片中最低。在外源 ABA 处理的牡丹花瓣中，Ps-NCED1 表达量变化与内源 ABA 含量
变化具有相同的趋势，推测该基因是调控内源 ABA 含量的主要基因。
关键词：牡丹；ABA；NCED；基因；实时定量 PCR
中图分类号：S 685.11 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2012）10-2033-12

Isolation and Expression of 9-cis Epoxycarotenoid Dioxygenase Gene in
Tree Peony
WANG Xiao-qing，ZHANG Chao，WANG Yan-jie，and DONG Li*
（College of Landscape Architecture，Beijing Forestry University，National Flower Engineering Technology Research
Center，Beijing 100083，China）
Abstract：A full-length cDNA（temporarily name it Ps-NCED1）encoding 9-cis-epoxycarotenoid
（NCED）was isolated with the techniques of RT-PCR and RACE from petals of tree peony flower and
characterized. Phylogenetic tree analysis revealed that amino acids sequence of Ps-NCED1 shared more
than 70% identity with the sequence of NCED from plants such as Vitis vinifera，Solanum tuberosum，
Daucus carota and so on. Ps-NCED1 also had the highest amino acids sequence identity with At-NCED3
of CCD（carotenoid cleavage dioxygenase）family in Arabidopsis. Cut flowers during full open stage had
the lowest endogenous ABA levels，to the contrary，flowers during primary and senescent stages had
higher ABA levels. The relative real-time PCR analysis was used to identify the expression of Ps-NCED1
in different parts of tree peony at blooming stage. The expression in root and stamen presented the
highest，while that in leaf and sepal the lowest. The expression of Ps-NCED1 in the petals from ABA
treated flowers during vasing increased with cut flowers opening and senescence，coincided with the ABA

2034 园 艺 学 报 39 卷
content increase，resulted in the assumption that it might be the main member in regulation the ABA
biosynthesis in tree peony responding to the postharvest stress during opening and senescence process.
Key words：tree peony；ABA；NCED；gene；real-time PCR

近年来国内外的大量研究发现脱落酸（ABA）与花朵的开放衰老有密切的关系，如 ABA 可以
促进姜花 Hedychium coronarium（陈建勋 等，2000）、紫罗兰 Matthiola incana（Ferrante et al.，2004）、
喇叭水仙 Narcissus pseudonarcissus（Hunter et al.，2004）、香石竹 Dianthus caryophyllus（Shibuya et
al.，2000；Nukui et al.，2004）、扶桑 Hibiscus rosa-sinensis（Trivellini et al.，2011）等切花的衰老。
ABA 促进植物衰老是通过抑制叶绿素、蛋白和核酸的合成，促进这些物质分解，促进气孔关闭以及
提高膜透性使细胞内一些物质泄漏等生理作用来实现的（杨世杰，2000）。但在不同植物中 ABA
促进衰老的方式并不相同。在香石竹中，ABA 通过增加乙烯的产量促进花朵的衰老（Shibuya et al.，
2000；Hunter et al.，2004）；而对于喇叭水仙加入乙烯抑制剂 1-MCP 后 ABA 仍然可以促进花朵的
衰老，证明 ABA 对于喇叭水仙的作用是通过非乙烯途径来完成的（Hunter et al.，2004）。因此 ABA
对于不同代谢及衰老类型的花朵的作用机制并不相同。
在植物体中，内源 ABA 的合成有直接和间接两种方式，高等植物中以间接合成方式为主。质
体中的丙酮酸（pyruvate）和三磷酸甘油醛（glyceraldehyde-3-phosphate）是合成 ABA 的最初前体物
（Cutler & Krochko，1999）。在这个合成途径中，9–顺式–环氧类胡萝卜素加双氧酶（9-cis-
epoxycarotenoid dioxygenase，以下简写为 NCED）是整个合成反应的限速酶（Schwartz et al.，1997；
Thompson et al.，2000；Qin & Zeevaart，2002；Leng et al.，2009；Hwang et al.，2010）。研究同时
表明，在植物体中 NCED 以基因家族的形式存在，并且其表达量的变化与 ABA 含量的变化有直接
的关系（Yang & Guo，2007；Zhang et al.，2009；Hu et al.，2010；王延书 等，2010；Zhang et al.，
2012；朱海生 等，2012）。因此植物体中 NCED 表达的变化在很大程度上决定着内源 ABA 的变化
规律。
牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）花期很短，导致其商业利用价值难以提升。近年来的研究发
现，乙烯在牡丹衰老过程中起重要作用（Jia et al.，2006；周琳 等，2009；Zhou et al.，2010）。而
ABA 对于牡丹切花开放衰老的作用目前尚未见相关报道。因此研究 ABA 代谢相关基因 NCED 在牡
丹开放衰老过程中的表达情况以及内源 ABA 含量的变化，有助于揭示 ABA 在植物体中的代谢规律
以及与其他激素之间的互作，也为后期牡丹切花的保鲜、抗衰以及转基因技术的研发奠定一定的理
论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
‘洛阳红’牡丹切花取自河南省洛阳市卫坡村大田中。
第一组：采收开花级别为 1 级（郭闻文 等，2004）并且花色、大小一致的花枝（共 60 枝），
每枝带 2 ~ 3 片复叶，花枝长 25 ~ 30 cm。放入盛有冰块的泡沫箱中低温保存，18 h 内运回实验室后
立即插入蒸馏水中将花枝剪至 20 cm 左右，花枝在复水 1 h 后备用。将随机挑选的 30 枝切花置于 100
μmol · L-1 的 ABA 溶液中处理 6 h，之后转入蒸馏水中瓶插；另外 30 枝置于蒸馏水中作为对照。为
防止细菌滋生堵塞导管，每天进行换水。切花的瓶插条件为：室温 20 ~ 23 ℃，相对湿度 50% ~ 60%，
光照强度 40 μmol · m-2 · s-1，光周期为 12 h /12 h。分别对 1 级（处理前）以及 ABA 处理和对照开放
10 期 王晓庆等：牡丹 NCED 基因的克隆和表达分析 2035

至 2 级、3 级、4 级和 5 级（郭闻文 等，2004）切花的中层花瓣进行取样，每 1.0 g 用锡箔纸包好
后液氮速冻，保存于–80 ℃冰箱中，备用于花瓣内源 ABA 含量及 NCED 表达量的测定。
第二组：取自然状态下完全开花植株的根（距根尖 5 cm 处）、茎（当年生茎中段）、叶（花朵
下面第 3 片复叶）和花（开放级别为 5 级），低温下运回实验室后分别用锡箔纸包好（将花分拆成
花托、萼片、花瓣、雄蕊、心皮）后液氮速冻，保存于–80 ℃冰箱中备用于 NCED 表达量的测定。
1.2 NCED cDNA 全长的获得
‘洛阳红’牡丹花瓣中总 RNA 的提取采用 CTAB 法（孟丽 等，2006），并经过一定的改良。
通过 RT-PCR 得到总 cDNA 第一链。根据 GenBank 中已登录的 NCED 的保守区序列设计两对简并
引物 P1、P2（表 1），进行巢式 PCR 扩增得到 NCED 片段。使用 SMARTTM RACE cDNA Amplification
Kit（购自美国 Clontech 公司）在反转出的 cDNA 3′端加入接头引物，根据已知的基因片段序列设计
两条特异性上游引物 TP1、TP2（表 1），下游为试剂盒通用引物，按照说明书进行 PCR 扩增，得到
NCED 3′端 cDNA序列。参照5′-Full RACE Kit[购自宝生物工程（大连）公司]说明书在反转出的 cDNA
5′端加入接头引物，根据已知的基因片段序列设计两条特异性下游引物 FP1、FP2（表 1），其上游引
物为试剂盒通用引物。PCR 扩增得到 NCED 5′端 cDNA 序列。根据已经得到的 5′、3′以及片段 cDNA
序列拼接出完整的 NCED 基因，并分别在 5′及 3′序列的 UTR 处设计特异性引物，命名为 WP（表 1）。
通过 PCR 扩增，对 NCED 的 cDNA 全长序列进行验证。
各目的片段的回收均按照琼脂糖凝胶回收试剂盒（购自天根生化科技有限公司）说明书进行。
回收产物连接到 pMD18-T 载体[购自宝生物工程（大连）公司]上，转化大肠杆菌 E. coli DH5α（购
自天根生化科技有限公司）后，进行蓝白斑筛选，将阳性克隆送至北京奥科生物公司测序。
1.3 NCED 基因分析
将拼接出的 NCED 全长在 GenBank 中进行 Blast 比对分析。使用 DNAMAN 5.2.2 和 NCBI 提供
的 OFR finder 工具分析开放读码框，以及转录后的氨基酸序列。
利用 ExPASy 提供的 ProtParam 在线软件（http：//web. expasy. org/protparam/）预测此蛋白的分
子量、理论等电点以及保守结构域等。
使用 DNAMAN 5.2.2 和 MEGA 4.0 软件进行多序列比对以及系统进化分析。
1.4 NCED 的荧光定量 Real-time PCR 表达分析
提取瓶插切花各个级别以及自然生长状态下盛花期植株根、茎、叶、花托、萼片、花瓣、雄蕊
和心皮组织中的总 RNA，反转录合成 cDNA。反转录反应体系（10 μL）为：总 RNA 4 μL，Oligo dT
primer（100 μmol · L-1）1 μL，dNTP Mix（10 mmol · L-1）1 μL，M-MLV RT 5 × Buffer 2 μL，M-MLV
Reverse Transcriptase（200 U · μL-1）0.5 μL，水（RNase free）1.5 μL。根据 NCED 全长序列，按照
相对荧光定量 RT-PCR 引物设计原则在基因 3′区设计一对特异引物 EP（表 1）。以牡丹 GADPH 和
ubiquitin 为内参各设计一对特异引物 GAP、UBP（表 1，王彦杰 等，2012），分别用于各组织中 NCED
表达及各级别 NCED 表达分析。反应在 BIO-RAD 公司 MINIOPTION 实时定量 PCR 仪上进行，方
法参照《BIO-RAD 公司 CFX96 实验指导》和 TaKaRa 荧光定量试剂盒 SYBR Premix Ex TaqTM 说明
书。荧光定量 PCR 扩增体系为：cDNA 模板 2 μL，SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL，上、下游特异引
物（10 μmol · L-1）各 0.4 μL，加水补足至 20 μL。扩增程序采用两步法：95 ℃预变性 30 s，95 ℃变
性 5 s，60 ℃复性 40 s，共 40 个循环。
每个试验设 3 次重复，利用 CFX Manager 软件以及 Excel 软件进行数据分析。
2036 园 艺 学 报 39 卷
1.5 内源 ABA 含量的测定
采用酶联免疫吸附法测定内源 ABA 含量（Zhao et al.，2006）。

表 1 牡丹 NCED 克隆及表达所用引物
Table 1 Primers for isolation and expression analysis of NCED gene in tree peony
引物名称
Primer name
引物序列
Sequence of primer
用途
Function
P1-F 5′-TT(C/T)GA(C/T)GG(C/G/T/A)GA(C/T)GG(C/G)ATGGT-3′
P1-R 5′-GT(G/A)GA(G/C)ACCTT(G/A)CG(C/A/G)ACCCT-3′
P2-F 5′-G(C/A/T)GA(A/G)CT(C/A/T)CA(C/T)GG(C/A/G/T)CACTC-3′
P2-R 5′-AT(G/A/C/T)GC(G/A)AA(G/A)TC(G/A)TGCATCAT-3′
保守片段扩增
For the conserved fragment
TP1 5′-GCCACTCTGGAATAGCGAGGCTACT-3′
TP2 5′-TCCAGACGTCGAAATTCCTCTAGCT-3′
3′RACE
FP1 5′-ACCGAACCTTGACATCTTACTCTTGT-3′
FP2 5′-CATCGTTGGTTCAGCTAGAGGAATTT -3′
5′RACE
WP-F 5′-TACACTCTCACTGGTGGACTCGCTT-3′
WP-R 5′-AGCATCCCTCTGGTAAATCTCCACT-3′
全长扩增
For the full-length cDNA
GAP-F 5′-GGTTGATCTCACTGTTAGGC-3′
GAP-R 5′-TCAGACTCCTCCCTACAAG-3′
UBP-F 5′-GACCTATACCAAGCCGAAG-3′
UBP-R 5′-CGTTCCAGCACCACAATC-3′
内参扩增
For the internal control
EP-F 5′-TTTTGCTAAGGTGGATTTGT-3′ 检测 Ps-NCED1 表达
EP-R 5′-ATGGAACCCGTATGGAACT-3′ For expression of Ps-NCED1 gene
2 结果与分析
2.1 牡丹 NCED cDNA 全长的获得及序列分析
根据 GenBank 中其它物种 NCED 保守序列设计出的简并引物，以瓶插盛开期牡丹花瓣的 cDNA
为模板进行 PCR 扩增后获得了一条长为 406 bp 的 cDNA 片段（图 1，A）。经过 Protein Blast 分析发
现，该基因片段编码的蛋白与多种植物的 NCED 蛋白高度同源，其中与杂柑（Citrus hybrid cultivar）
NCED 蛋白（Accession number：baf81959.1）和葡萄（Vitis vinifera）NCED 蛋白（Accession number：
aar11193.1）的同源性均达到 88.76%。

图 1 牡丹 Ps-NCED1 扩增电泳图
M：DNA marker；A：NCED 片段扩增产物；B：3′RACE 扩增产物；C：5′RACE 扩增产物；D：cDNA 全长扩增产物。
C 泳道中 700 bp 左右的条带为 5′通用引物的单引物扩增产物。
Fig. 1 Agrose gel electrophoresis analysis of Ps-NCED1 fragments in tree peony
M：D2000 plus DNA ladder；A：Amplification product of Ps-NCED1 fragment；B：Amplification product of 3′ RACE for Ps-NCED1；
C：Amplification product of 5′ RACE for Ps-NCED1；D：Amplification product of Ps-NCED1 full-length cDNA.
The 700 bp band in lane C is single primer amplification product of 5′ universal primer.
10 期 王晓庆等：牡丹 NCED 基因的克隆和表达分析 2037

根据得到的中间片段设计特异性引物，以盛开期牡丹花瓣的 cDNA 为模板，在 5′和 3′端分别扩
增出 1 115 bp 和 1 233 bp 的 cDNA 片段（图 1，C；图 1，B）。将这 3 个片段拼接。再分别在 5′和 3′
端 UTR 处设计特异性引物克隆得出一条长度为 1 805 bp 的 cDNA（图 1，D）。将此序列的 5′及 3′
端的 UTR 补齐后最终获得一条全长为 2 042 bp 的 cDNA。Blast 比对后发现该序列为 NCED 的同源
基因，暂命名为 Ps-NCED1。
利用DNAMAN 5.2.2的Protein translation overview软件对获得的全长序列进行分析发现，Ps-NCED1
包含了一个 1 722 bp 的开放读码框和一个 poly（A）尾巴，5′UTR 长 127 bp，3′UTR 非翻译区长 193
bp。其编码的蛋白质包含 574 个氨基酸（图 2）。



图 2 Ps-NCED1cDNA 全长以及翻译的氨基酸序列分析
ATG 为起始密码子；TAA 为终止密码子；下划线部分为转运肽氨基酸序列（Qin & Zeevaart，1999）；双划线部分为具有两亲性（同时具
有亲水和疏水的部分）的 α–螺旋区（Tan et al.，2003）；Ps-NCED1 发挥功能所依赖的 4 个保守的组氨酸用方框标注
（Kamoda & Saburi，1993；Tan et al.，1997；Rodrigo et al.，2006）。
Fig. 2 Complete nucleotide sequence of Ps-NCED1 cDNA and its deduced amino acid sequence
The start and stop codons are bold；A putative chloroplast-targeting peptide of PsNCED1 is underlined（Qin & Zeevaart，1999）；Aligned sequences
of the amphipathic region in PsNCED1 are double-underlined（Tan et al.，2003）；Four conserved histidines required for activity
are framed（Kamoda & Saburi，1993；Tan et al.，1997；Rodrigo et al.，2006）.
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利用 NCBI 的 ORF finder 分析此 cDNA 序列也得到了相同的结论。另外，使用 ExSAPy 的在线
ProtParam 分析预测出这条基因编码的蛋白分子量为 63.53 kD，理论等电点（pI）为 8.22。
利用 NCBI 的 CCD（Conserved Domain Database）软件分析发现 Ps-NCED1 编码的蛋白质属于
一个名为 RPE65 的超级家族。这个家族包含了有关植物中新黄质分解酶的序列。进一步的氨基酸序
列分析发现，图 2 中下划线标记的 Ps-NCED1 蛋白前 28 个氨基酸序列为转运肽氨基酸序列（Qin &
Zeevaart，1999）。另外，位于序列上游的-LQRAAAMALDAVEGALVS-是一段具有两亲性的 α–螺
旋区（Tan et al.，2003），用双划线标记。用方框标注的 4 个组氨酸是加双氧酶中典型的以非血红
素形式与辅因子铁结合的保守氨基酸，它们在酶活方面起到了关键的作用（Kamoda & Saburi，1993；
Tan et al.，1997；Rodrigo et al.，2006）。这些氨基酸序列均为植物体中 NCED 蛋白的保守序列。
2.2 Ps-NCED1 编码的氨基酸序列的系统进化树分析
利用 DNAMAN 5.2.2 软件以及 NCBI 的 Protein Blast 对牡丹 Ps-NCED1 蛋白与其他物种 NCED
蛋白进行氨基酸序列一致性分析发现，牡丹与葡萄、马铃薯（Solanum tuberosum）等 12 个物种的
NCED 蛋白氨基酸序列一致性（identity）都在 70%以上。
在进一步的进化关系分析中，对包括牡丹在内的 13 个 NCED 蛋白（分属于 12 个属）的氨基酸
序列构建了系统进化树（图 3）。




图 3 牡丹 Ps-NCED1 与其他物种 NCED 氨基酸序列的系统进化树分析
标准尺代表分支长度相当于每个氨基酸残基有 0.02 个发生变化。
Fig. 3 A phylogenetic tree of the Ps-NCED1 in tree peony and NCED proteins from other species
The bar represents the branch length equivalent to 0.02 amino acid changes per residue.

分析表明，Ps-NCED1 的进化基本符合植物分类学的进化规律，并具有明显的种属特征，如同
属的秘鲁番茄（Solanum peruvianum）和马铃薯的 NCED 蛋白（序列号分别为 adq74055.1、aat75151.1）
组成了一个分支，而同属豆科的柠条锦鸡儿（Caragana korshinskii）、花生（Arachis hypogaea）和
柱花草（Stylosanthes guianensis）的 NCED 蛋白（序列号分别为 acu86971.1、cae00459.2、aay98512.2）
也组成了一个分支。同时，结果分析得出，牡丹与葡萄科的亲缘关系最近，其次与茄科、旋花科、
10 期 王晓庆等：牡丹 NCED 基因的克隆和表达分析 2039

伞形科、龙胆科和茜草科的亲缘关系较近，而与芸香科、大戟科和豆科的亲缘关系相对较远，分属
于不同的聚类簇中。
另外，通过与拟南芥（Arabidopsis thaliana）中 CCD 家族的氨基酸序列比对发现，Ps-NCED1
和拟南芥中的几个 NCED 蛋白分聚在了同一聚类簇中（图 4），并且与调控 ABA 合成的 At-NCED3
（Tan et al.，2003）的序列一致性最高，达到了 69.7%。


图 4 牡丹 Ps-NCED1 与拟南芥中 CCD 家族氨基酸序列的系统进化树分析
Fig. 4 A phylogenetic tree of the Ps-NCED1 in tree peony and proteins of CCD family from Arabidopsis

2.3 盛开期牡丹植株各部位 Ps-NCED1 的表达
以牡丹 GADPH 为内参基因，自然条件下完全盛开的牡丹植株各组织中 Ps-NCED1 的表达量检
测结果显示，该基因在雄蕊和根中的表达量最高，在花托、花瓣、心皮和茎中的表达量处于中等水
平，由高到低依次是花托、花瓣、心皮和茎。而在萼片和叶片中最低，叶片中的表达量只是雄蕊表
达量的 2.4%（图 5）。




图 5 盛开状态下不同组织中 Ps-NCED1 的相对表达量
大、小写字母分别表示差异达极显著水平（P < 0.01）和显著水平（P < 0.05）。下同。
Fig. 5 The expression of Ps-NCED1 gene in different tissues at full opening stage
Different capital and small letters indicate significance different at P < 0.01 and P < 0.05 levels，respectively.
The same below.
2040 园 艺 学 报 39 卷
2.4 ABA 处理切花花瓣中内源 ABA 含量及 Ps-NCED1 表达量的变化
在牡丹切花的瓶插过程中，对照切花的内源 ABA 含量呈现先降后升的变化规律，切花处于 1
级水平时含量较高，但随着花朵的开放，呈现下降趋势，并且在 4 级时达到最低值，到达 5 级后花
朵开始转向衰老，花瓣中内源 ABA 含量也明显地上升。经过 6 h ABA 处理后的切花在开放过程中
（2 ~ 5 级）ABA 含量显著高于对照，并且随着开放和衰老进程呈现出整体的上升趋势（图 6，A）。
以牡丹 ubiquitin 为内参基因，采用荧光定量 PCR 法对 Ps-NCED1 的表达量进行分析发现，对照花
朵瓶插状态下，整体呈现上升趋势，5 级花朵中的表达量是处理前（1 级）的 51.7 倍。外源 ABA 处
理的切花中 Ps-NCED1 的表达量明显高于对照并且呈持续上升趋势（图 6，B）。图 6 可以看出 ABA
处理对于内源 ABA 含量和 Ps-NCED1 表达量变化的影响较为一致。



图 6 ABA 处理对花瓣中内源 ABA 含量（A）及 Ps-NCED1 表达量（B）的影响
Fig. 6 Effect of ABA treatment on endogenous ABA content（A）and expression of
Ps-NCED1（B）in petals of tree peony

3 讨论
植物体中的 NCED 是一个多基因家族。在拟南芥中共有 5 个家族成员（Tan et al.，2003）。目前
除拟南芥外，菜豆 Phaseolus vulgaris（Qin & Zeevaart，1999）、鳄梨 Persea americana（Chernys &
Zeevaart，2000）、甜樱桃 Prunus avium（任杰 等，2010）、白桦 Betula platyphylla（Zhang et al.，2012）
等植物的部分 NCED 已经被克隆出来。本研究中使用 RT-PCR 和 RACE 技术从‘洛阳红’牡丹花瓣
中克隆出了 NCED 的一条 cDNA 序列，并通过 Blast 分析发现这条基因编码的氨基酸序列与其他 12
个物种中的 NCED 蛋白氨基酸序列一致性均在 70%以上，进一步确定了编码这个蛋白的 cDNA 基因
10 期 王晓庆等：牡丹 NCED 基因的克隆和表达分析 2041

属于 NCED 家族。通过进化分析发现牡丹与葡萄科、茄科、旋花科等亲缘关系较近，但是与芸香科、
大戟科和豆科的亲缘关系相对较远。另外通过与拟南芥中 CCD 家族的氨基酸序列比对发现，
Ps-NCED1 与 At-NCED3 氨基酸序列的一致性最高，而一些研究已经证实 At-NCED3 是拟南芥在受
到胁迫时被诱导表达合成 ABA 的最主要基因（Iuchi et al.，2001；Tan et al.，2003；Seo & Koshiba，
2011），因此 Ps-NCED1 在牡丹中也可能存在着相同的作用机制，可能在响应环境胁迫诱导 ABA 合
成过程中发挥着重要的作用。
对 PS-NCED1 编码的氨基酸序列进行序列分析后发现，在 N–末端有一段转运肽氨基酸序列
（Qin & Zeevaart，1999）。它的功能是引导这个蛋白进入质体中，在转运过程中，这段序列被切除，
并且这段氨基酸序列中丝氨酸（S）和苏氨酸（T）的含量达到了 25%，是转运到叶绿体中蛋白转运
肽序列的典型特征（Heijne et al.，1989）。这也进一步证明了 NCED 蛋白是在质体中发生作用的（Tan
et al.，2001）。在 Ps-NCED1 蛋白靠近 N–末端的氨基酸序列处有一个 α–螺旋两亲性结构区（Tan
et al.，2003），这个结构可以使蛋白结合到质体膜上。因此，这段包含 18 个氨基酸的区域证明 NCED
蛋白可能结合在质体的类囊体膜上，并且在这个位置与反应底物发生作用（Seo & Koshiba，2002）。
此外，Ps-NCED1 中的 4 个保守组氨酸也是植物中 NCED 蛋白所特有的结构，更进一步证明了本研
究中克隆到的这条 cDNA 序列属于 NCED 家族。
对 Ps-NCED1 相对表达量的研究显示，在盛开的牡丹植株各组织中，该基因在雄蕊和根中的表
达量较高，而在萼片和叶中的表达量最低。这个结果与拟南芥器官中 At-NCED3 的表达类似。在拟
南芥中 At-NCED3 在根中的表达量最高，其次是茎和花，在叶中的表达量则相对较低（Tan et al.，
2003）。此外，Ps-NCED1 在根和叶中表达量的差异与鳄梨根和叶中内源 ABA 的含量差异相似，自
然生长状态下鳄梨根中 ABA 的含量明显高于叶（Gil et al.，2009）。这可能由于根是植物体中合成
ABA 的主要器官，并且 ABA 对于水分等胁迫比较敏感，而根是最早感知这些胁迫的器官。此外，
在对花器官的研究中发现 Ps-NCED1 在雄蕊和心皮等部位表达量较高，而在萼片中的表达量则相对
较低。这与前人的研究结果类似，Peng 等（2006）发现 ABA 最早出现在花原基细胞中，但随着花
朵的发育，ABA 在萼片中的含量急剧下降，而在雄蕊和心皮中并没有下降。出现这种现象的原因是
ABA 与植物的生殖有关：据 Zhu 等（2010）对欧洲油菜（Brassica napus L.）的调查发现，ABA 在
花药发育过程中起到了重要的作用；而拟南芥 ABA 合成突变体较野生型的花序及花朵大小以及开
花时间方面也均有明显的变化（Barrero et al.，2005）；因此，这可能是导致牡丹花器官中与调节
ABA 合成的 Ps-NCED1 在与生殖有关的部位（如雄蕊、心皮）表达量较高，而在萼片中较低的原因。
牡丹切花在瓶插状态下内源 ABA 含量表现为先降后升。ABA 在蕾期（1 级）时含量较高，此
后逐渐降低，完全盛开（4 ~ 5 级）时达到最低值，随着花朵达到 5 级并开始表现出衰老现象，花瓣
中内源 ABA 含量又开始升高。这种现象与月季（Rosa hybrida L.）花瓣中的情况较为类似，内源
ABA 含量在月季开放前含量较高，花朵完全开放时达到最低值，但随后开始升高（Kumar et al.，
2008）。这表明 ABA 促进了花朵的开放，它可能通过调节 FLC、LFY 等与开花相关的基因并且促
进一些生理变化实现了这种作用。切花在后期由于失水或受到了其他一些胁迫的影响内源 ABA 的
含量开始升高，ABA 通过减少细胞内核酸和蛋白质并且促进气孔关闭以及提高膜透性等生理作用导
致了花朵最终的死亡。此外，ABA 处理显著促进了各级别花朵中内源 ABA 的含量，这与在扶桑和
香石竹切花中的研究结果（Onoue et al.，2000；Trivellini et al.，2011）一致。与此相比，对照花朵
中 Ps-NCED1 在开放时的变化与内源 ABA 的变化规律并不相同，该基因随着花朵的开放表现为较
为明显的上升趋势。这表明在 NCED 家族中并不只有 Ps-NCED1 参与了内源 ABA 的合成，ABA 的
合成还受其他家族成员的调控。但值得注意的是，经过 6 h 外源 ABA 处理后花瓣中内源 ABA 的变
化与 Ps-NCED1 表达的变化基本一致，证明外源 ABA 通过促进花瓣中 Ps-NCED1 的表达从而在很
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大程度上促进了内源 ABA 的产生，这也与 At-NCED3 在拟南芥中所起到的作用类似。因此虽然牡丹
花瓣中内源 ABA 的合成受到包括 Ps-NCED1 在内的整个 NCED 家族的调控，但可以肯定 Ps-NCED1
是花朵受到胁迫时调节内源 ABA 合成的最主要基因。
乙烯作为致衰激素受到关注，Wang 等（2004）对月季中乙烯合成基因 ACS 的研究中发现该基
因在叶片中几乎不表达，而在花瓣和子房中表达量较高。Ps-NCED1 在牡丹中的表达情况与之较为
类似，由于 ACS 与 NCED 相似，是合成乙烯的限速酶，因此推测在牡丹花瓣中内源 ABA 和乙烯之
间肯定存在着某种联系。前期研究已经表明‘洛阳红’牡丹属于乙烯敏感型花卉，在瓶插过程中切
花在 2 ~ 3 级时乙烯释放率达到最大值（Jia et al.，2006；周琳 等，2009）；而本研究中发现内源
ABA 的峰值出现在 1 级花朵中，即乙烯峰值之前。结合 ABA 通过促进内源乙烯的产生促进香石竹
切花衰老（Shibuya et al.，2000；Nukui et al.，2004）的结论，推测在乙烯敏感型‘洛阳红’牡丹中，
ABA 可能也通过促进花朵内源乙烯的释放促进了花朵的开放和衰老。
NCED 是 ABA 合成途径中的一个限制酶，而编码这个酶的基因在许多植物中已经被克隆到。
本试验中成功克隆了一条编码 NCED 的 cDNA 基因全长，并且证明这个基因的表达量在花瓣中的变
化明显，在牡丹各器官中的表达量也有很大的差别。这为以后了解牡丹中 ABA 的合成机制甚至进
一步的转基因工作奠定了基础。关于植物体中 ABA 与乙烯之间的互作以及相关基因之间的调控值
得继续研究。

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