全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（2）：253–264 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–09–01；修回日期：2012–01–16
基金项目：国家自然科学基金项目（31071787，30471204）；福建省重大科技平台建设项目（2008N2001）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：Laizx01@163.com）
龙眼 TIR1 和 ABP1 基因的克隆及其在体胚发生
过程中的表达分析
李惠华 1,2，赖钟雄 1,*，苏明华 2，林玉玲 1
（1 福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福州 350002；2 福建省亚热带植物研究所，福建厦门 361006）
摘 要：采用 RT-PCR 结合 RACE 法，分离克隆龙眼（Dimocarpus longan Lour.）胚性愈伤组织生长
素受体基因 TIR1（Transport inhibitor response 1，即 DL-TIR1）和生长素结合蛋白基因 ABP1（Auxin biding
protein 1，即 DL-ABP1），运用生物信息学方法对序列进行分析，并通过实时荧光定量 PCR 法研究其在龙
眼体细胞胚胎（以下简称龙眼体胚）发生过程中的表达。结果表明：DL-TIR1 为 2 328 bp 的 mRNA 全长
序列（GenBank，GQ870264），包含 1 个长为 1 761 bp 的开放阅读框，5′ 非编码区为 118 bp，3′ 非编码区
为 449 bp，推定的氨基酸序列含 586 个氨基酸，与其它植物 TIR1 具有 85% ~ 57%同源性；DL-TIR1 在龙
眼体胚的各阶段均有表达，整个变化趋势呈近似“W”状，在子叶形胚中的表达量最高。DL-ABP1 为 869
bp 的 mRNA 全长序列（GenBank，GQ900592），包含 1 个长为 567 bp 的开放阅读框，5′ 非编码区为 43 bp，
3′ 非编码区为 259 bp；推定的氨基酸序列含 188 个氨基酸，与其它植物 ABP1 具有 87% ~ 72%同源性，
DL-ABP1 在龙眼体胚中整个表达变化趋势也呈现近似“W”状。生长素受体 DL-TIR1 和“可能的”生长
素受体 DL-ABP1 在龙眼体胚中的变化趋势极为相似。
关键词：龙眼；胚性愈伤组织；生长素受体基因；生长素结合蛋白基因；克隆；序列分析；实时荧
光定量 PCR 法
中图分类号：S 667.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）02-0253-12

Cloning of TIR1 and ABP1 Genes from Embryogenic Calli of Longan and
Analysis of Their Expression During Longan Somatic Embryogenesis
LI Hui-hua1,2，LAI Zhong-xiong1,*，SU Ming-hua2，and LIN Yu-ling1
（1Institute of Horticultural Biotechnology，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China；2Fujian
Institute of Subtropical Botany，Xiamen，Fujian 361006，China）
Abstract：The RT-PCR with RACE method was used to clone the complete mRNA sequences of the
transport inhibitor response 1 gene（DL-TIR1） and auxin binding protein 1 gene（DL-ABP1）from
embryogenic calli of longan（Dimocarpus longan Lour.）. And bioinformatics methods were used to
analyze obtained sequences and putative amino acid sequences. Then qRT-PCR（real-time reverse
transcription PCR）method was used to determine the mRNA transcription level of two genes in the
process of somatic embryogenesis in longan. The results were as follows：The full length TIR1（DL-TIR1，

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GenBank，GQ870264） mRNA，about 2 328 bp，consisting of an open reading frame of 1 761 bp ，and
5′ and 3′ untranslated regions of 118 bp and 449 bp，respectively. The putative protein had 586 amino
acids，and the identity with the other polypeptides varied between 85%–57%. DL-TIR1 expressed in 8
different stages during somatic embryogenesis，which showed approximately a“W”curve. The full length
ABP1（DL-ABP1，GenBank，GQ900592）mRNA，about 869 bp，consisting of an open reading frame
of 567 bp，and 5 and 3 untranslated regions of 43 bp and 259 bp，respectively. The putative protein had
188 amino acids，and the identity with the other polypeptides varied between 87%–72%. The expression
of DL-ABP1 in 8 different stages during somatic embryogenesis also showed approximately a“W”curve.
The mRNA transcription level of the auxin receptor gene DL-TIR1 and the potential auxin receptor gene
DL-ABP1 were very similar.
Key words：Dimocarpus longan；embryogenic callus；auxin receptor gene；auxin biding protein 1；
cloning；sequence analysis；qRT-PCR

龙眼（Dimocarpus longan）体胚系统被认为是木本植物体胚发生的模式系统之一（Lai et al.，
2000；赵平娟 等，2009）。研究发现外源和内源生长素在调节植物体胚发育方面扮演着重要的角色
（Carman，1990；崔凯荣 等，2000，2002；邢更妹 等，2000；Boutilier et al.，2002；张启香 等，
2011），特别是 2,4-D 被认为是诱导体胚发生的重要生长调节剂，但其作用机理并无定论（马国华 等，
2000；王清连 等，2004）。关于生长素作用的研究始于一百多年前（Teale et al.，2006），然而直到
近几年才确定了生长素的受体（Dharmasiri et al.，2005a，2005b；Kepinski & Leyser，2005）。TIR1
（transport inhibitor response 1，转运抑制应答因子 1）鉴别自 1997 年拟南芥耐生长素运输抑制剂遗
传检测试验，但研究表明它与生长素运输无关，而与生长素信号转导的作用机制密切相关（Ruegger
et al.，1998；Tan et al.，2007；Mockaitis & Estelle，2008；Spartz & Gray，2008）。TIR1 是泛素化
AUX/IAAs 降解途径 E3 连接酶复合体 SCF 中的 F-box 蛋白，具有一套富亮氨酸重复基序（Maraschin
et al.，2009）。目前 GenBank 上登录的 mRNA 全长序列信息多为拟南芥的，mRNA 全长在 1.7 ~ 3.5
kb 不等，由于其重要性，TIR1 在其它物种中的研究迅速增加（胡应红 等，2007；黄志刚 等，2008）。
另外，生长素受体之一（TIR1）确立之前，生长素受体研究领域最受人关注的是生长素结合蛋白基
因（ABP1），虽至今还没有证据表明它与生长素诱导基因相关，但由于其重要性，科研人员仍在寻
找 ABP1 可能成为生长素受体之一的线索（黄志刚 等，2008）。TIR1 是存在于细胞质中的可溶性蛋
白，有证据表明细胞膜外也存在生长素的受体，有可能是 ABP1（Leblanc et al.，1999）。很多植物
的 ABP1 基因都已被克隆，例如：烟草、苎麻、黄瓜等，ABP1 是单基因编码，mRNA 全长一般在
700 ~ 1 000 bp，基因编码 200 个左右氨基酸（高启祥 等，2001；白吉刚 等，2002；黄妤 等，2008）。
生长素有很多种，对植物体胚的作用各不相同，对龙眼胚性愈伤组织生长素受体基因 TIR1 和“可能
的”生长素受体基因 ABP1 的同时克隆和表达分析，有助于从生长素受体角度入手，更加精确从分
子水平上了解生长素类在龙眼体胚发生过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
试验于 2009—2010 年在福建农林大学园艺植物生物工程研究所（福州）完成。‘红核子’龙眼
胚性愈伤组织由赖钟雄于 1994 年诱导并由福建农林大学园艺植物生物工程研究所长期继代保存（赖
2 期 李惠华等：龙眼 TIR1 和 ABP1 基因的克隆及其在体胚发生过程中的表达分析 255

钟雄 等，1997），选取生长旺盛的松散型胚性愈伤组织作为基因克隆试验材料。
通过在培养基中添加不同浓度 2,4-D 的方法调控获得松散型胚性愈伤组织、胚性愈伤组织Ⅱ、
不完全胚性紧实结构、完全胚性紧实结构、球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶形胚等不同发育阶段
的材料用于 TIR1 和 ABP1 荧光定量 PCR 分析（赖钟雄和陈春玲，2002；方智振和赖钟雄，2009）。
1.2 TIR1 和 ABP1 基因的克隆
采用 Invitrogen 公司的 Trizol Reagent，参照说明书提取 RNA；采用 Fermentas 公司 RevertAid First
Strand cDNA Synthesis Kit，按照说明书进行 cDNA 第一链的合成。
基因克隆采用常规的 RT-PCR 结合 RACE 法，所用引物（表 1）均委托上海博尚生物公司合成。
PCR 反应体系为：2 μL cDNA，1 μL 上游引物（10 μmol · L-1），1 μL 下游引物（10 μmol · L-1），2.5 μL
10 × PCR Buffer（含 Mg2+），2 μL dNTP Mix （2.5 mmol · L-1），0.2 μL EX Taq（5 U · μL-1），补 H2O
至总体积为 25 μL。PCR 扩增程序为：在 94 ℃预变性 2 min，然后 94 ℃变性 1 min，退火 1 min（温
度见表 1），72 ℃延伸（时间见表 1），共 35 个循环；最后 72 ℃ 10 min。PCR 扩增试剂由 TaKaRa
公司出品。扩增各目的片段的具体引物、温度、时间见表 1。

表 1 基因克隆的 PCR 反应条件
Table 1 PCR assays condition in gene cloning
扩增的目的片段
Amplication of fragment
引物
Primer
温度/℃
Tm
时间/s
Time
TIR1保守区
TIR1 conserved region
TIR1-P1：5′ - TTGCGAGAGAGTGAGGTGG -3′
TIR1-P2：5′ - CATTGAGCCTAGGCATCTTCTGA -3′
52.0 60
第一轮TIR1-P3：5′ - GCTGGAGATAGTGATTTGGGAC -3′、AUAP 53.0 60 TIR1的3RACE
TIR1 3RACE The first round of PCR：TIR1-P3、AUAP
第二轮TIR1-P4：5′ - TGAAAGCCTGAGGAAACTGG -3′、AUAP
50.5 60
The second round of PCR：TIR1-P4、AUAP
TIR1的5RACE
TIR1 5RACE
第一轮TIR1-P5：5′ - AGGTAAGCCGAGGCAACATCC -3′、AUAP
The first round of PCR：TIR1-P5、AUAP
第二轮TIR1-P6：5 - AGTGCCCAACTCAACCAACTGG -3、AUAP
The second round of PCR: TIR1-P6、AUAP
54.8

55.0
70
60
TIR1的ORF
TIR1 ORF
TIR1-P7：5′ - ATGTTAAAGAGAATGTCTTACTCGTC -3′、
TIR1-P8：5′ - TCAAGAAAACCTTAATGCAGAATCTTC -3′
52.0 110
ABP1保守区
ABP1 conserved region
ABP1-P1：5′ - ATGAAAGAGGTTGAAGTATGGCT -3′、
ABP1-P2：5′ - TTGAAGGCATTGCTCATCCCAAT -3′
50.0 30
ABP1的3RACE
ABP1 3RACE
第一轮ABP1-P3：5′ - CAAACATTTTCACCAGGATCACGA -3′、AUAP
The first round of PCR：ABP1-P3、AUAP
第二轮ABP1-P4：5′ - CTGGAAAGCCGCTGGAATAC-3′、AUAP
The second round of PCR：ABP1-P4、AUAP
52.0

52.5
60
30
ABP1的5RACE
ABP1 5RACE
第一轮ABP1-P6：5′ -AGACCTGGTGAGCATCGTT-3′、AUAP
The first round of PCR：ABP1-P6、AUAP
50.0

30

第二轮ABP1-P7：5′ - ATTCCAGCGGCTTTCCAGGGTA-3′、AUAP
The second round of PCR：ABP1-P7、AUAP
55.0 30
ABP1的ORF
ABP1 ORF
ABP1-P8：5′ -ATGGAGAGGTGTTGCTTCATTTTC-3′
ABP1-P9：5′ -TCAAAGCTCATCTTTAACAGGTTCTT-3′
51.0 40

以保守区 cDNA 第一链为模板，使用 TIR1-P1 和 TIR1-P2 引物，ABP1-P1 和 ABP1-P2 引物进
行保守区扩增。3′RACE 的 cDNA 第一链的合成逆转录引物采用接头引物 AP（5-GGCCACGCGTCGA
CTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′）。以 3′RACE 的 cDNA 为模板，分别使用 TIR1-P3 和 AUAP
（5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3′），ABP1-P3 和 AUAP 进行 3′RACE 第一次 PCR 扩增，产物
稀释 10 倍作为模板，分别使用 TIR1-P4 和 AUAP，ABP1-P4 和 AUAP 进行 3′RACE 第二次 PCR 扩
增；5′RACE cDNA 第一链的合成特异性引物分别为 TIR1-P5 和 ABP1-P5（5′-TGAAGGCATTGCTCAT
CCC-3′）。以 5′RACE cDNA 第二链为模板，分别使用 TIR1-P5 和 AUAP，ABP1-P6 和 AUAP 组成
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一对引物进行 5′RACE 第一轮 PCR 扩增，产物直接作为第二轮 PCR 扩增的模板，分别使用 TIR1-P6
和 AUAP，ABP1-P7 和 AUAP 进行 5′RACE 第二轮 PCR 扩增；以保守区 cDNA 第一链为模板，分
别使用 TIR1-P7 和 TIR1-P8，ABP1-P8 和 ABP1-P9 引物进行 ORF 扩增。
采用 TaKaRa 公司 DNA 快速纯化回收试剂盒回收，自制 Escherichia coli DH5α 感受态细胞，以
TaKaRa 公司的 pMD-18T 为载体对回收片段转化和克隆，阳性克隆子送上海英骏生物技术公司测序。
1.3 序列分析及生物信息学分析
已有序列的检索使用 GenBank 的 Blast（http：// www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/），引物设计、序
列拼接及分析采用 DNAMAN 软件。获得的全长 cDNA 序列登录 GenBank。序列蛋白的理化性质预
测采用 ExPASy ProtParam（http：// www. expasy. org/tools/protparam.html）；跨膜结构预测与分析采
用 TMHMM2.0（http：// www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM-2.0）；信号肽预测采用 SignaIP 3.0 Server
（http：// www. cbs. dtu. dk/ services/ SignalP/）；亚细胞定位采用 PSORT（http：// psort. nibb. ac. jp/）；
保守结构域采用 NCBI-CDS（http：// www. ncbi. nlm. nih. gov/blastn/）；蛋白质二级结构预测采用 Jpred
程序（http：// www. compbio. dundee. ac. uk/）；蛋白卷曲螺旋结构的预测与分析采用 Coils（http：//
www. ch. embnet. org/software /COILS_form.html）；磷酸化位点预测与分析采用 NetPhos 2.0 程序
（http：// www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos/）；系统进化树使用 MEGA 4.1 软件中的 NJ 法建树。
1.4 龙眼胚性愈伤组织 TIR1 和 ABP1 在龙眼体胚不同发育阶段的表达
龙眼胚性愈伤组织 TIR1 和 ABP1 基因在龙眼体胚发育不同阶段的实时荧光定量 PCR 参考 Lin
和 Lai（2010）的方法，并将其筛选的 EIF4α、EF-1α 和 FSD 作为内参基因。分别提取龙眼体胚不
同发育阶段胚性培养物的总 RNA，使用 TaKaRa 的 SYBR® ExScriptTM试剂盒反转录合成 cDNA 第
一链。采用两步法 qRT-PCR，20 μL 反应体系包括 10 μL 2 × SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）、200
nmol · L-1 的上下游基因特异性引物（表 2）及各个样本的 cDNA 0.5 μL，并补 dH2O 至 20 μL。qRT-PCR
所用仪器为罗氏 LightCycler 1.5，反应程序为：预变性 94 10 s℃ ；94 ℃变性 5 s；退火 15 s（退火
温度见表 2），40 个循环。
表 2 Real-time PCR 反应的参数
Table 2 Parameters for Real-time PCR reaction
基因特异性引物序列
Gene specific primers sequences
退火温度/ ℃
Temperature
产物大小/ bp
Product size
DL-TIR1-F：5′ -TTGGGATGTTGCCTCGGCTT-3′
DL-TIR1-R：5′ -CGCTGTAAATTTGGACACTGGC-3′
57 134
DL-ABP1-F：5′ -TTCACCAGGATCACGAACACC-3′
DL-ABP1-R：5′ -ATTCCAGCGGCTTTCCAGGGTA-3′
57 124
2 结果与分析
2.1 龙眼胚性愈伤组织 TIR1 和 ABP1 的 cDNA 全长序列的获得
基因保守区扩增结果与预期目标片段相符，约 1 110 bp（图 1，B）和 360 bp（图 2，A）的 DNA
片段，产物直接测序确认片段大小分别为 1 028 bp 与 360 bp。这两个序列的核苷酸和氨基酸序列分
别在 GenBank 上经 blast 和 blastn 分析，1 028 bp 的片段与数据库中已有的 TIR1 核苷酸和氨基酸序
列高度同源，其中与蓖麻的同源性分别有 82%和 85%。360 bp 的片段与数据库中已有的 ABP1 核苷
酸和氨基酸序列高度同源，其中与杨树的同源性分别为 85%和 91%。
3′RACE 巢式 PCR 电泳结果：与预期目标片段相符，约 750 bp 的清晰条带（图 1，C）和 500 bp
2 期 李惠华等：龙眼 TIR1 和 ABP1 基因的克隆及其在体胚发生过程中的表达分析 257

的清晰条带（图 2，B），经克隆测序以及结合保守区序列分析，约 750 bp 的片段与龙眼胚性愈伤组
织 TIR1 保守区序列有 201 bp 的重叠区，确认此片段大小为 767 bp，是龙眼胚性愈伤组织 TIR1 的
mRNA 3′端序列，约 500 bp 的片段与龙眼胚性愈伤组织 ABP1 保守区序列有 221 bp 的重叠区，确认
此片段大小为 504 bp，是龙眼胚性愈伤组织 ABP1 的 mRNA 3′端序列。
5′RACE 巢式 PCR 模板电泳结果显示约为 850 bp 和 400 bp 的单一 DNA 片段（图 1，图 2，C）。
经过测序、软件分析，约为 850 bp 的片段与 TIR1 保守区序列有 192 bp 的重叠区，表明此片段为 846
bp 的龙眼胚性愈伤组织 TIR1 的 mRNA 5′端序列。约为 400 bp 的 DNA 片段与 ABP1 保守区序列有
192 bp 的重叠区，表明此片段为 383 bp 的龙眼胚性愈伤组织 ABP1 的 mRNA 5′端序列。
ORF 的扩增结果分别显示为 1 761 bp（图 1，F）和 567 bp（图 2，D）的单一 DNA 条带，经过
克隆测序表明片段与拼接的 mRNA 全长序列的相应部分重叠，是龙眼胚性愈伤组织 TIR1 和 ABP1
的 ORF，也证明了经过保守区，3′RACE 和 5′RACE 共 3 次扩增的序列的正确性。
获得龙眼胚性愈伤组织 TIR1 的 mRNA 全长，命名为 DL-TIR1，全长为 2 328 bp（GenBank，
GQ870264），5′非编码区为 118 bp，3′非编码区为 449 bp，3′poly（A）尾长 16 bp，ORF 为 1 761 bp。
获得龙眼胚性愈伤组织ABP1的mRNA全长，命名为DL-ABP1，全长为869 bp（GenBank，GQ900592），
5′非编码区为 43 bp，3′非编码区为 259 bp，3′poly(A)尾长 19 bp，ORF 为 567 bp。

图 1 DL-TIR1 PCR 扩增的琼脂糖电泳结果
Fig. 1 DL-TIR1 PCR results of agarose gel electrophoresis
M：DNA ladder marker 2 000.


图 2 DL-ABP1 PCR 扩增的琼脂糖电泳结果
Fig. 2 DL-ABP1 PCR results of agarose gel electrophoresis
M：DNA ladder marker 2 000.
2.2 龙眼胚性愈伤组织 TIR1 和 ABP1 序列的生物信息学分析
DL-TIR1 推导的氨基酸序列经预测：分子量 65.7418 kD，等电点 6.39，编码 586 个氨基酸，是
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亲水蛋白。无跨膜区域，不是膜蛋白。不属于分泌蛋白，不具备有信号肽。亚细胞定位在叶绿体中
的可能性最大。此蛋白含有 F-box 结构域（通常是处于蛋白的 N 端，大约有 50 个氨基酸，一般会
有一套富亮氨酸重复基序以及 WD 重复基序，在泛素介导的蛋白质水解过程中具有底物识别特性，
另外参与转录延伸、着丝粒结合、翻译抑制等过程）。α–螺旋是其主要的二级结构。DL-TIR1 不会
形成卷曲螺旋。磷酸化位点有 27 个，且非均匀分布于整条多肽链中。
DL-ABP1 推导的氨基酸序列经预测：分子量为 21.6247 kD，等电点为 5.96，编码 188 个氨基酸，
是亲水蛋白。该蛋白第 1 ~ 19 位氨基酸是跨膜螺旋。N 端前 22 个氨基酸是信号肽。亚细胞定位在
内质网中的可能性最大。DL-ABP1 蛋白属于 Auxin-binding protein 家族（Auxin-binding protein N–
末端一级氨基酸链含有 30 个左右残基疏水先导序列，作用是将此蛋白运输定位在内质网膜的信号；
在 C–末端的内质网滞留信号 Lys-Asp-Glu-Leu，能够阻止内质网腔中的分泌蛋白进入细胞）。无规
则卷曲结构是其主要的二级结构。DL-ABP1 无形成卷曲螺旋的可能。磷酸化位点有 9 个，且非均匀
分布于整条多肽链中。
DL-TIR1 的 mRNA 序列推导的氨基酸序列与蓖麻同源性为 84.64%，与杨树同源性为 81.74%；
与葡萄同源性为 81.74%，与棉花同源性为 81.43%，与烟草同源性为 80.03%，与拟南芥同源性为
79.16%，与番茄同源性为 78.33%，与火炬松同源性为 60.99%，与水稻同源性为 59.05%，与枳同源
性为 58.84%，与玉米同源性为 56.78%。由氨基酸序列建立的系统进化树（图 3）中，12 个氨基酸
序列分为两大类。DL-TIR1 与锦葵科的棉花 TIR1 处于同一分枝，同时与木本火炬松、大戟科的蓖
麻、模式植物拟南芥的进化距离相对较近；与单子叶植物玉米、藤本的葡萄进化距离相对较远；与
单子叶植物水稻、茄科的烟草及番茄、芸香科的枳的进化距离最远。

图 3 DL-TIR1 系统进化树
Fig. 3 Phylogenetic tree for DL-TIR1

DL-ABP1 的 mRNA 序列推导的氨基酸序列与毛白杨、棉花、苎麻的同源性为 87%，与葡萄为
84%，与蓖麻为 80%，与苹果为 79%，与烟草为 78%，与番茄为 76%，与拟南芥、果香菊为 75%，
与杜仲、野芥为 74%，与萝卜为 73%，与母菊、向日葵为 72%。16 条氨基酸序列建成的系统进化树
（图 4）分成两大类群，烟草、番茄、毛白杨处于较小的一个类群，龙眼与其它的 13 个物种处于另
一类群。其中，龙眼与苎麻、母菊、向日葵、葡萄的进化关系很近，与杜仲、果香菊的进化关系最
远，与蓖麻、棉花、苹果的进化距离相对较近，与萝卜、拟南芥、野芥的进化关系相对较远。
如图 5 所示，DL-ABP1 与毛白杨，苎麻，葡萄，拟南芥的氨基酸序列比较，DL-ABP1 具有高
度保守的 Box A（81 ~ 98，HRHSCEEVFVVLKGSGTL）；Box B（138 ~ 151，HEDLQMLVIISRPP）；
Box C（155 ~ 172，FIYDDWFMPHTAAKLKFF）。
2 期 李惠华等：龙眼 TIR1 和 ABP1 基因的克隆及其在体胚发生过程中的表达分析 259

图 4 DL-ABP1 系统进化树
Fig. 4 Phylogenetic tree for DL-ABP1

图 5 DL-ABP1 和其它植物 ABP1 的氨基酸序列比较
Fig. 5 Comparison of the amino acid sequences of DL-ABP1 and other plants
2.3 龙眼体胚不同发育阶段 DL-TIR1 和 DL-ABP1 的表达分析
两个基因的实时荧光定量 PCR 检测结果见图 6。图 6，A 所示从松散型胚性愈伤组织（Stage 1）
到子叶形胚（Stage 8），DL-TIR1 基因整体转录水平的变化趋势呈近似“W”状，松散型胚性愈伤组
织（Stage 1）相对较高；从松散型胚性愈伤组织（Stage 1）发育形成球形胚（Stage 5）的 5 个阶段，
胚性愈伤组织Ⅱ（Stage 2）表达量迅速下降为松散型胚性愈伤组织（Stage 1）的约 35.5%，之后不
完全胚性紧实结构（Stage 3）的表达量回升至松散型胚性愈伤组织（Stage 1）的约 59.9%，完全胚
性紧实结构（Stage 4）和球形胚（Stage 5）的表达量相当，这 5 个阶段虽然在外部形态的变化并不
明显，但基因表达的变化却很明显；球形胚发育到心形胚阶段外部形态的变化比较显著，DL-TIR1
基因的转录也下降明显，心形胚、鱼雷形胚是外源生长素浓度极低的两个发育阶段，心形胚（Stage
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6）到鱼雷形胚（Stage 7）表达量缓慢下降，鱼雷形胚（Stage 7）的表达量在 8 个阶段中最低；子叶
形胚（Stage 8）是去除外源生长素的发育阶段，此时 DL-TIR1 表达量急剧上升至 8 个阶段的最高值。
图 6，B 所示 DL-ABP1 基因整体转录水平的变化趋势与 DL-TIR1 相似，也呈近似“W”状。从
松散型胚性愈伤组织发育形成球形胚的 5 个阶段，胚性愈伤组织Ⅱ（Stage 2）表达量下降为松散型
胚性愈伤组织（Stage 1）的约 71.4%，之后不完全胚性紧实结构（Stage 3）的表达量回升至松散型
胚性愈伤组织（Stage 1）的约 87.8%，后期表达量相对稳定，完全胚性紧实结构（Stage 4）和球形
胚（Stage 5）的表达量相当，这 5 个阶段属于龙眼体胚的早期阶段，外观形态变化虽然很小，但基
因表达的变化比较明显。球形胚（Stage 5）、心形胚（Stage 6）、鱼雷形胚（Stage 7）的表达量相对
稳定，这 3 个阶段在外观形态变化较为显著，但基因表达的变化却比较缓和。体胚的后期阶段的子
叶形胚（Stage 8）DL-ABP1 基因表达量急剧上升至 8 个阶段的最高值。

图 6 龙眼体胚不同发育阶段 DL-TIR1（A）和 DL-ABP1（B）的相对表达水平
1. 松散型胚性愈伤组织；2. 胚性愈伤Ⅱ；3. 不完全胚性紧实结构；4. 完全胚性紧实结构；5. 球形胚；
6. 心形胚；7. 鱼雷形胚；8. 子叶形胚。
Fig. 6 Relative expression of DL-TIR1（A）and DL-ABP1（B）in different stages of longan somatic embryogenesis
1. The friable-embryogenic callus；2. Embryogenic callus Ⅱ；3. Incomplete compact pro-embryogenic cultures；
4. Compact pro-embryogenic cultures；5. Globular embryos；6. Heart embryos；
7. Topedo embryos；8. Cotyledonary embryos.
3 讨论
3.1 基因克隆序列特征分析
DL-TIR1 推导的氨基酸序列与已报道的木本植物、双子叶植物的同源性高于草本植物及单子叶
植物。DL-ABP1 与已报道的典型植物 ABP1 蛋白氨基酸序列在特征区（Box A，Box B 和 Box C）同
源性较高，特征区以外其它部位的序列同源性较低，这与文春描等（2007）的报道相符。
在拟南芥、水稻、大麦和番茄中发现大部分基因以家族形式存在（The Arabidopsis Genome
Initiative，2000）。已有报道表明 DL-TIR1 和 DL-ABP1 均属多基因家族（Badescu & Napier，2006）。
从基因克隆的产物看，产物均为单一的条带，目的片段的 3 个重复 T/A 阳性克隆子测序结果均为一
致的序列，并未在本试验中分离得到除 DL-TIR1 和 DL-ABP1 之外的家族成员。今后，通过基于 EST
库信息，或基于已有 DL-TIR1 和 DL-ABP1 的 cDNA 序列，对体胚进行不同诱导培养可以进一步探
讨分离 DL-TIR1 和 DL-ABP1 其它的家族成员。
3.2 DL-TIR1 时间差异表达及其在龙眼体胚发生过程中的作用
目前普遍认为：体细胞转化为胚性细胞的分子基础是诱导下基因差别表达的结果（Chugh &
2 期 李惠华等：龙眼 TIR1 和 ABP1 基因的克隆及其在体胚发生过程中的表达分析 261

Khurana，2002；Charbit et al.，2004；Casson et al.，2005）。激素被认为是影响体胚发生和发育最重
要的因素（Carman，1990；崔凯荣 等，2000；Boutilier et al.，2002；Yang & Zhang，2010）。植物
体胚发生机制的研究大部分局限于胡萝卜、天仙子、苜蓿等草本模式植物，而植物激素的调控机理
研究在拟南芥和水稻中开展得较为深入，但至今拟南芥体胚系统仍难以持续保存，需要固体—液体
轮替保持，而且难以同步化培养（Miho et al.，2003；Malgorzata，2004）。因而，所得到的信息具有
局限性。龙眼体胚继代培养 10 年以上仍能高频率萌发，并能高度同步化培养（方智振和赖钟雄，
2009），是一个非常优良的木本体胚发生模式试验系统，从分子水平研究龙眼体胚发生过程中激素的
调控机理对于相对难于诱导的木本植物的体胚发生具有一定的启示作用。其中，生长素是诱导体胚
发生的关键，生长素受体的研究是生长素作用机理研究中最为重要的一个环节（Dudits et al.，1991）。
在龙眼体胚发生过程中，DL-TIR1 基因的转录水平变化较为复杂，体胚的早期发育阶段（Stage
1 ~ Stage 5）DL-TIR1 基因的转录水平较高，说明胚性的启动和诱导需要较高水平的生长素，在体胚
的中后期（Stage 6 ~ Stage 7）DL-TIR1 基因的转录水平显著下降，说明龙眼体胚的进一步发育只需
要较低水平的生长素，体胚的末期（Stage 8）DL-TIR1 基因的表达量又急剧上升至体胚 8 个研究阶
段的最高值，说明此时相对高水平的生长素为龙眼体胚的进一步成熟做准备。
同时，龙眼胚性愈伤组织 TIR1 基因 cDNA 全长序列的获得可以为今后在龙眼体胚中深入开展
其功能研究奠定基础。
3.3 龙眼 DL-TIR1 和 DL-ABP1 表达的时间差异性与 2,4-D 以及 IAA 的联系
人工合成生长素类 2,4-D 被认为是诱导胚性愈伤组织的重要生长调节剂（Carman，1990；崔凯
荣 等，2000；马国华 等，2000；邢更妹 等，2000；Boutilier et al.，2002；王清连 等，2004）。龙
眼体胚的诱导和发生发育过程中，2,4-D 同样起了重要的作用。在本试验中，松散型胚性愈伤组织
（培养基中 2,4-D 浓度为 1 mg · L-1）、胚性愈伤组织 II（2,4-D 浓度为 0.8 mg · L-1）、不完全胚性紧实
结构（2,4-D 浓度为 0.5 mg · L-1）、完全胚性紧实结构（2,4-D 浓度为 0.3 mg · L-1）、球形胚（2,4-D
浓度为 0.1 mg · L-1）、心形胚（2,4-D 浓度为 0.07 mg · L-1）、鱼雷形胚（2,4-D 浓度为 0.05 mg · L-1）、
子叶形胚（无激素）共 8 个体胚发生不同阶段的同步化材料，通过在培养基中添加不同浓度的 2,4-D
来调控获得。而在龙眼体胚发生过程中，DL-TIR1 的转录水平变化与外源添加的 2,4-D 并未呈现出
正相关的关系。
拟南芥中的 F-box 蛋白 AFB1、AFB2、AFB3 与 TIR1 氨基酸序列具有高度的同源性，它们之间
具有结构功能的重叠性（Badescu & Napier，2006）。Dharmasiri 等（2005a，2005b）发现 AFB1、AFB2、
AFB3 也可参与生长素反应，TIR1 的突变体对生长素反应与野生型相比差异不大，缺乏这 4 种蛋白
的突变体对生长素不敏感，推测 AFBs 和 TIR1 介导体胚及植株发育中全部的生长素反应。如果龙眼
体胚存在 AFBs 受体家族，本研究中的 TIR1 荧光定量 PCR 引物设计选择在 AFBs 和 TIR1 高度同
源区域，可以反应 TIR1/AFBs 受体家族的表达水平。
在对龙眼体胚发生过程中内源激素变化的研究中（赖钟雄和陈春玲，2002）发现，内源 IAA 的
整个变化趋势呈现出近似“M”状，含量都维持在较高水平，两个峰值出现在愈伤组织Ⅱ和球形胚，
分别是本研究中的 Stage 2 和 Stage 5，最低值出现在子叶形胚，是本研究中的 Stage 8（DL-TIR1 的
表达出现峰值），在球形胚之后内源 IAA 的含量明显下降。而本研究中 DL-TIR1 基因的转录水平大
致呈现出近似“W”状（图 6，A），与内源 IAA 的变化趋势几乎相反，只有在球形胚之后都出现了
明显下降的变化趋势相一致。原因可能是 DL-TIR1 的时空表达所反应的是外源 2,4-D 和内源 IAA 综
合的作用水平，在胚性细胞启动的初期缺乏内源生长素的合成能力，外源生长素与内源生长素起到
相互平衡调节的作用，之后，随着胚性细胞的发育逐渐具备有自身合成生长素的能力，内源生长素
262 园 艺 学 报 39 卷
起主导作用。也有可能内源 IAA 在植物体内并不是全部与生长素受体结合参与生长素的信号途径，
可能有部分与其它物质形成结合态，此时直接从受体入手更能标志生长素反应水平，同时实时荧光
定量 PCR 方法较之前的研究方法更为精准。
3.4 DL-ABP1 和 DL-TIR1 相互联系以及 DL-ABP1 在龙眼体胚发生过程中可能的作用
在TIR1确认为生长素受体之前，在植物生长素受体领域研究得最多的是生长素结合蛋白ABP1。
Chen 等（2001）对烟草叶细胞的研究表明，ABP1 主要介导低浓度（高亲和力）生长素的反应，调
节细胞伸长生长。在拟南芥中成功分离到 ABP1 的首株突变体，且发现 ABP1 为正常细胞分裂和伸
长所必需，参与胚的形态建成（Chen et al.，2001；胡应红 等，2007）。已报道的 ABP1 大多位于内
质网，在质膜、细胞壁及高尔基体、液泡膜也有 ABP1 存在（文春描 等，2007）。ABP1 可能也是
生长素受体成员之一，主要介导迅速反应和定位于质膜区域的反应，或与 TIR1 所介导的泛素化降
解信号途径共同参与生长素反应（Badescu & Napier，2006；康宗利和杨玉红，2006；刘进平，2007）。
在本研究中，同时克隆得到 DL-TIR1 和 DL-ABP1 的 cDNA 全长序列，以相同的材料研究了
DL-TIR1 和 DL-ABP1 在龙眼体胚中的表达，发现作为“可能的”生长素受体之一的 DL-ABP1 整体
转录水平的变化趋势与 DL-TIR1 十分相似，只是在完全胚性紧实结构（Stage 4）和球形胚（Stage 5）
这 2 个阶段的变化有稍许不同，完全胚性紧实结构（Stage 4）和球形胚（Stage 5）两阶段在外形上
十分接近，DL-TIR1、DL-ABP1 的转录水平在这两个阶段的变化都较小，两阶段基因表达量相当，
只不过 DL-TIR1 在球形胚（Stage 5）比完全胚性紧实结构（Stage 4）阶段稍稍高了一些，而 DL-ABP1
恰好相反，在球形胚（Stage 5）比完全胚性紧实结构（Stage 4）阶段稍稍低了一些。此外除了鱼雷
形胚（Stage 7）阶段，DL-TIR1 的表达量是 DL-ABP1 的数倍。
由于抑制蛋白的降解和基因的转录激活需要一定的时间，在龙眼体胚中 DL-TIR1 可能介导生长
素诱发的有一定滞后期（10 ~ 15 min）的反应；而有一些细胞反应的滞后期较短（5 min），它们大
多数发生在质膜区域，并与生长素诱导的离子运输和细胞膨胀有关，这些反应可能是由 DL-ABP1
介导。生物信息学预测表明 DL-ABP1 很有可能是属内质网型。推测作为可能的生长素受体 DL-ABP1
在内质网中富集，然后经过一定的运转机制运输到质膜，通过另一条与 DL-TIR1 所介导的基因调控
相平行的细胞学信号传递途径参与龙眼体胚细胞分裂分化所涉及的生长素诱导的快速反应。
通过 DL-ABP1 与 DL-TIR1 表达情况的相似性得到启示，应进一步深入研究 DL-ABP1 如何在龙
眼体胚中与 DL-TIR1 共同参与生长素的信号途径。由于具有翻译水平上的调节，转录水平上所获取
的基因表达信息不足以揭示其确切功能。今后，应对龙眼体胚发生过程中 DL-TIR1 和 DL-ABP1 在
蛋白水平上的变化做深入分析，或者开展 DL-ABP1 与 DL-TIR1 的启动子、小 RNA 等调控因子的研
究，在龙眼体胚中开展转基因、基因敲除等试验，对基因与生长素的作用功能进行深入了解。

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