全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（3）：571–578 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–12–25；修回日期：2013–02–01
基金项目：浙江省科技厅项目（2008C12018）；浙江省教育厅项目（Y201224104）；宁波市自然科学基金项目（2011A610004）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：luyongqan@126.com）
南方红豆杉 SSR 分布特征分析及分子标记的开
发
易官美 1,2，黎建辉 1，王冬梅 1，童再康 1，卢泳全 1,*
（1 浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江临安 311300；2 宁波城市职业技术学院，浙江奉化
315502）
摘 要：利用基因组勘测序列（GSS 序列）探讨开发南方红豆杉（Taxus wallichiana var. mairei）SSR
标记的可行性。从 1 923 条 GSS 序列中搜寻到 184 个 SSR 位点。其中二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸重
复所占比例分别为 88.6%、10.3%和 1.1%。不同核苷酸在重复序列中的频率分析表明，a 和 t 所出现的频
率远远高于 c 和 g 的频率。对所获得的 184 个 SSR 位点设计引物，开发出 90 个候选 SSR 引物。在所获
得的获选标记中选取 20 对引物在南方红豆杉中进行试验检验，结果 19 对（95%）SSR 引物能够获得清晰
稳定的主带，表明 GSS 序列可以高效地用于开发基因组 SSR 标记，这些标记将为南方红豆杉的相关研究
奠定基础。
关键词：南方红豆杉；GSS 序列；SSR 标记；频率
中图分类号：S 567.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）03-0571-08

SSR Distribution Characteristic Analysis and Molecular Marker Development
in Taxus wallichiana var. mairei
YI Guan-mei1,2，LI Jian-hui1，WANG Dong-mei1，TONG Zai-kang1，and LU Yong-quan1,*
（1The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture，Zhejiang Agricultural and Forestry
University，Lin’an，Zhejiang 311300，China；2Ningbo City College of Vocational Technology，Fenghua，Zhejiang 315502，
China）
Abstract：In order to provide tool of biology research and genetic improvement for Taxus wallichiana
var. mairei，SSR molecular markers were developed with GSS sequence in this study. In total 184 SSR loci
were find from 1 923 GSS sequences. Among those loci，the proportion of two nucleotide repeats，three
nucleotide repeats and four nucleotide repeats are 88.6%，10.3%，1.1%，respectively. The frequency of a
and t are higher than that of c and g in the nucleotide repeats in the T. wallichiana var. mairei genome.
From those 184 SSR loci，90 SSR candidate primers were exploited. In order to verify the validity of
candidate primers，20 primers were selected for further test. PCR result showed that 19 can gain clear
products. Those results showed that GSS data could be employed to exploit SSR marker. Those markers
can be well used in T. wallichiana var. mairei research.
Key words：Taxus wallichiana var. mairei；GSS sequence；SSR；frequency

572 园 艺 学 报 40 卷
南方红豆杉（Taxus wallichiana var. mairei）为裸子植物亚门（Cymmospermai）松杉纲
（Coniferopside）红豆杉目（Taxales）红豆杉科（Taxaceae）红豆杉属（Taxus）植物，为中国特有
的白垩纪孑遗植物和国家一级保护植物。由于其树皮、枝、叶、根中均含有抗癌活性成分——紫杉
醇，因此为珍稀的药用植物（郑万钧 等，1987），主要分布在中国亚热带地区的浙江、广西等 13
个省（自治区），间断分布于山西东南部至台湾中部山地（詹选怀和王江林，2004）。目前对南方红
豆杉的相关研究主要集中在遗传多样性（张蕊 等，2009；李乃伟 等，2011）和抗癌功能分析（舒
琦瑾 等，2011）两个方面。
分子标记是指能够用分子生物学方法检测出来的 DNA 分子水平上的遗传多态性，有很大的应
用价值（方宣钧 等，2001）。迄今在红豆杉科植物中的分子生物学相关研究中所用到的分子标记仍
局限于随机扩增多态 DNA（RAPD）和扩增简单重复序列间区（ISSR）等随机引物标记（Botstein et
al.，1980；Vos et al.，1995）。由于这类随机引物标记稳定性和重现性一直备受质疑，因此目前已较
少使用。特异性分子标记具有重现性好，扩增靶序列在基因组中位置确定等优点，因而倍受研究者
青睐。最常用的特异标记是 SSR（简单序列重复，Simple Sequence Repeat）（Becker et al.，1995）。
然而，SSR 标记的开发难度大，不仅费工费时，而且费用很高。为了开发 SSR 标记，必须在基因
组序列中找出 SSR 位点，而且必须知道 SSR 两侧的序列。这就要求对大量的基因组片段进行测序。
由于研究经费的限制，对于大多数植物而言是难以做到的。因此，在大多数植物中，目前还难以开
发 SSR 标记。近年来，随着基因组研究的快速发展，许多植物中都开展了表达序列标签（EST）的
测序工作，互联网上有关数据库中积累了大量的 EST 序列数据。从这些数据中可以发现，在 EST
序列中也存在 SSR 位点。因此，人们试图利用 EST 序列开发 SSR 标记，称为 EST-SSR 标记（Eujay
et al.，2001）。但研究显示，与非编码序列中的 SSR 相比，EST 中的 SSR 的遗传多态性水平较低，
数量也很少，因而难以满足实际工作的需要。
目前尚未见红豆杉植物中开发 SSR 标记的报道。因此在红豆杉的相关研究中，仍然使用非特异
性的分子标记（张蕊 等，2009；李乃伟 等，2011）。迄今红豆杉植物中尚未见基因测序的报道，
难以大规模开发特异的 SSR 标记。基因组勘测序列（Genome Survey Sequences，GSS）是基因组
DNA 克隆的一次性部分测序得到的序列。包括随机的基因组勘测序列、cosmid/BAC/YAC 末端序列、
通过 Exon trapped 获得基因组序列、通过 Alu PCR 获得的序列、以及转座子标记（transposon-tagged）
序列等。目前互联网上已登录了一些的南方红豆杉 GSS 序列。因此，本研究中尝试利用这些序列开
发红豆杉基因组 SSR 标记。这些标记可以用于南方红豆杉的亲缘关系分析、种源鉴定等研究。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选取浙江农林大学植物园内 10 年生南方红豆杉为材料，于 2012 年 5 月采集新鲜幼嫩叶片，用
CTAB 法（Murray et al.，1980）提取基因组 DNA。
1.2 SSR 位点的扫描
在 Plant Genomics Database （GDB，http：//www. plantgdb. org）下载南方红豆杉 GSS 序列 1 923
条。应用 SSRIT（simple sequence repeat identification tool）软件（http：//www.gramene.Org/db/searches/
ssrtool）在线搜索 SSR。搜索的标准为：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸重复序列，重
复次数大于或等于 5。
3 期 易官美等：南方红豆杉 SSR 分布特征分析及分子标记的开发 573

表 2 单核苷酸在三核苷酸序列中出现的频率
Table 2 Frequency of mononucleotide in trinucleotide
repeats in SSR loci
核苷酸 Nucleotide 位点数 Numbers 频率/% Frequency
a 20 35.1
t 23 40.4
c 7 12.3
g 7 12.3
总数 Total 57 100.0
表 1 SSR位点中二核苷酸重复分布比例
Table 1 Distribution of dinucleotide repeats in SSR loci
序号
No
重复序列
Repeat sequence
位点数
Numbers
百分比/%
Ratio
1 at 42 25.8
2 ac 15 9.2
3 ag 13 8.0
4 ta 30 18.4
5 tc 9 5.5
6 tg 19 11.7
7 ca 21 12.9
8 ct 6 3.7
9 ga 5 3.1
10 gt 3 1.8
总数 Total 163 100.0
1.3 候选引物的设计和候选标记的验证
找到某一 SSR 位点后，在其前后各 100 bp 范围内，用 Primer3（Rozen et al.，2000）设计适宜
的引物，主要参数设置为：GC 含量 40% ~ 60%，退火温度（Tm）56 ~ 63 ℃，引物长 18 ~ 27 bp，
预期扩增产物长度 100 ~ 300 bp。所有引物先在南方红豆杉 GSS 本地数据库中做电子 PCR（ePCR）
（Schuler，1997），要求引物与模板完全匹配。根据 ePCR 结果，剔除扩增区域重叠的引物，只有
当某个引物有且只有一个产物时，才确定其为候选的 SSR 标记，以确保标记的唯一性。以 TWS（Taxus
wallichiana SSR）加数字来命名候选引物，例如 TWS 10。
试验所有引物均在上海生物工程科技有限公司合成。20 μL 预扩增体系包括：1× PCR Buffer，
上、下游 SSR 引物（50 ng · μL-1）各 1 μL，1.6 μL dNTPs（2.5 mmol · L-1），1.2 μL MgCl2（25 mmol · L-1），
0.2 μL Taq DNA polymerase（5 U · μL-1），DNA 模板 50 ng。扩增的程序为 95 ℃预变性 3 min，然后
进行 30 个循环：95 ℃变性 30 s，57.5 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min。循环结束后 72 ℃延伸 7 min。
扩增完成后，取 5 μL 扩增产物和 1 μL Loading Buffer 混合后在 1%琼脂糖胶中电泳检测扩增结果。
每对引物至少扩增 2 次以确保结果的可靠性。
2 结果与分析
2.1 SSR 位点分布特征
从数据库中下载南方红豆杉的 GSS 序列
1 923 条。利用 SSRIT 软件对进行查找，共查得
184 个 SSR 位点。这些位点包括：163 个两碱基
重复，占 SSR 位点总数的 88.6%；19 个三碱基重
复，占 SSR 位点总数的 10.3%；2 个四碱基重复，
占 SSR 位点总数的 1.1%。其中四核苷酸重复只
有 2 种组合，分别是 atta 和 tatg。在所研究的序
列中没有五核苷酸重复。二核苷酸重复理论上应
该有 16 种组合，然而在本研究的 163 个二核苷酸
位点中只有 10 种序列组合（表 1），没有发现 aa、
tt、cc、gg、cg、gc 核苷酸的重复。在其余 10 种
二核苷酸序列中，以 at 重复所占比例最高，为
25.8%；而 gt 重复所占的比例最低，只有 1.8%。
从不同的核苷酸在重复序列中的频率看，a 和 t
远远高于 c 和 g 所出现的频率。
在三核苷酸重复理论上应该有 64 种组合，然
而在本研究的 19 个三核苷酸位点中共有 18 种序
列组合，即只有 1 种三核苷酸组合 atg 在这 19 个
三核苷酸组合中重复出现 1 次，而其它 18 种组合
只出现 1 次。进一步比较 4 种单核苷酸在 19 个
三核苷酸重复中所出现的频率发现，a 和 t 出现的
频率远远高于 c 和 g 出现的频率（表 2），这与
二核苷酸重复中单核苷酸频率分布相似。
574 园 艺 学 报 40 卷
2.2 候选引物的设计
对所获得的 184 个 SSR 位点设计引物，结果位点侧翼序列过短（< 18 bp）无法设计引物的有
13 个。在剩余的 171 个 SSR 位点中，引物的扩增区域有重叠的位点共 40 个。为了保证所设计的引
物是特异性的，将这 40 个位点剔除。在剩余的 131 个 SSR 位点中，有 41 个位点在所给定的引物设
计条件中无法得到适宜的引物。这些设计不出引物的位点主要有以下两种情况：（1）退火温度过高
或过低，不适宜设计成 SSR 引物；（2）虽然能设计出引物，但引物的效率太低，包含有引物二聚
体等特殊结构，不满足 PCR 对引物的要求。最终获得 90 个候选 SSR 引物（表 3）。在这 90 个 SSR
引物中，除 6 个引物（TWS75，TWS76，TWS78，TWS93，TWS97，TWS98）的退火温度为 53 ℃
外，其余引物的退火温度均在 56 ~ 60 ℃之间。

表 3 候选SSR引物序列
Table 3 Sequences of candidate SSR primers
编号
No.
上游引物（5′–3′）
Forward primer（5′–3′）
下游引物（5′–3′）
Reverse primer （5′–3′）
TWS1 AGACGTATCGGCTGACCTTGGA TGGACGCGTAAGCAGCCATCC
TWS2 AGCACCTTGACACCATCATTCCCT ACCACTCCTTTGGCTCGACCATGA
TWS3 ACAGGGATTGACAGGCCATTGGA ACACATGTGAAGTGAGCCAAGAGGA
TWS4 TCGACCTTTCTAAAGAAGCCCCTCC ACAACGGACAGTTCATCGTTTCTGC
TWS5 GCTAGCCTCCCCCAAGCCCAT TCCCCCTTGTGAGGTTGACCTTG
TWS6 CAGATTTGGATCTGGGTCTGTGTCA CCACAAGCTACTCTAGTGCAGGCAG
TWS7 TTCAATGGCAAAATGGGGTGAGACT TCATCTCACGGAGCTCCATCCAC
TWS8 TGGGTGTATGCAGGCGAGAGAGG CCTCGTCCTGCGAGAGGGCA
TWS9 AGGGCATGTGGATGTGGCTA ACCACTCAACAAAAAGGGGCA
TWS10 TGGGGTATAGTCCCTCCCAA CCATCCCCCACCACCTATATAAT
TWS11 CGGAGTTCCCATTGCACACTTATCG TGGCATACAAGAGGCTGACATTTCC
TWS12 TGCTTAGAGAAGAAAGTTTTCCA TGGCATACAAGAGGCTGACA
TWS13 ACAAGTGTGTTTAAGGGAGCTTCT TGTACCTCAAAACATGGTGCTCA
TWS14 TCCACATCTCGTCCCCCGAG ATGACATCATCCCATGGTGCAA
TWS15 TGGCACCCAAGAAAGCGGTTG CCCACTCTTGGCTGACAATAACCCC
TWS16 AGCATAACGAGGGGGATGTAGA TGAGTGTGGGAGAAACAAATGC
TWS17 TCGGAGAATGGAGCCAAGTCC AAAAATGTAACCCTCAACGCAAAAA
TWS18 CGGAGAATGGAGCCAAGTCC AAAATGTAACCCTCAACGCAAAAAT
TWS19 GGCATGTCACGGTGAAAATTCGGC CGTTGTCTCACCGAGTCATTACAGC
TWS20 GAGGGAGAAGAAAGACTACATGTGC TGTGTTGCCTTGAAACTCTCCACC
TWS21 TTCGTAACCACCTGTGTGGG AGTAGCTGGGGCTCGAATCT
TWS22 ATAACCATCACACGTGACTTGC TGAACCCTAGGTGACGACCAT
TWS23 ACGTGATGTCAGGATGAAATCTTGG TGCTGCACACGAGAATTGGAGA
TWS24 TGGTTTACATATTGAAGCGAGCAA GCAGCGAAACATATGTAGCACAA
TWS25 CTGCGTGCCGGCTTTGGTAT CACTGCATGTCAATCAAAACATCGT
TWS26 TCAGTCCTTGTGATCTGCAACAAGC ACGGCTTGTGTCATCCTCAACC
TWS27 TCATGCACAGGTAACCAAACCACA CCCCCTTCTTCCCTTGCTTGC
TWS28 ATCGCTACCCTGGGTGGTCTGTG GGGTGGTGGTCGACAGTTGGC
TWS29 GGACAAGGGTTGGATCACTTCTGT CCAACGGCCACCCGAAGAGT
TWS30 CATTGGCCCCTGAGCCCCAA ACCCCCATTTTCCTTTCTCCTCCA
TWS31 CCATGCACAAGACACAAGTTTCAGC TCACCCCTAGGCCCTTCGCT
TWS32 TGACAACACAACCACACAATGTCCA TCTTGTTTTCTGGGCCTAAAGTGT
TWS33 GCGCTAGTCCTCAGTGGTGCC GCGCCGGGGCCAACTAAACT
TWS34 ATGCAACCAAATTTCTAGTTGTGGG ATTCCGTGCAACCCTTGCCT

3 期 易官美等：南方红豆杉 SSR 分布特征分析及分子标记的开发 575

续表 3
编号
No.
上游引物（5′–3′）
Forward primer（5′–3′）
下游引物（5′–3′）
Reverse primer （5′–3′）
TWS35 ACTCAGGCTACATCATGCAAGCGA AAGGGGGTACTTGGGGGAGGC
TWS36 TGAGCCTCTCAATCTAGGAAGACCG GGGACATGGATCCCATGGTGCAA
TWS37 TCCCTTCCAAGCACAATGATGGA GGATTGATCATCCTTCCCCACA
TWS38 GCACGGAGACCTTGCCACCTT GCTGTCAACTGCTGTCAATTTCCTG
TWS39 CGCTGTGAGGGAAAAGTGATAGTGC CCCGATCGGTGCCAACTGGT
TWS40 TGCTACAACCTACGTGAACCTCCT TAGACCCTCCACGTTGGCCC
TWS41 TGGGGAGAAGGTGTGTGCGA GCTTAGGCTATAGGGTCCACGTACA
TWS42 TCCTTCGGTGGGATCGCGTA AGAAAGGGAAACATGAGTGACAAGA
TWS43 GGTCATCTTCTCTTTTGCAGGTCCA ACCTAGGGTGAAAGTGGGTGTGT
TWS44 ACGTCTCTTAAGCCGATAACTGGTC AGCATGGCCGTGGCCTAACA
TWS45 AGTGCTAAACCATCACTCATCCA AGAGTGCATCATCGGGAAATGGT
TWS46 TCTCCAAGTTGTGGGACTTGCT TCACCACTTTAGTGTAGGCTCTGT
TWS47 AAGAGCCCACTACAAGGGCAT TCTTACAAGTGCTGAGGAGACAA
TWS48 TGCCTCTTGAATGTTTTCCCCCAAT GCACCCAGGCACTACTATCCCCT
TWS49 ACAAGAGAAACCTAGGGCATGA AGCGGCTACAATGGTGGACT
TWS50 TGCAGCACATTGGCCTCACAA CAAGTGGTTGAAGGATGGATCTCAG
TWS51 ACCAATGCGTGCATGGATCTGATA GCCTGTAAACGGCACGTGGCTA
TWS52 GCATTCTGCTCCTGAGTGTGGCA AGTAGTCTATCCTCGTCTCCTCCCA
TWS53 TGCCACAAGCTATTCCAGTGCAGG TCCTTCCCATTGCTCACCTCTCCT
TWS54 TGGGGACCAGAACAACAACATGCC AGGTCATACTGAGAAAGCAAGGTGC
TWS55 ACAACATGCACAAGGGCCAC AACCGTTGTACTACATTTCAGACC
TWS56 TCGAGTTTTCACCCATGAGGTCC AGGAAACTTACACACATTCCCCT
TWS57 TCGGGTACGGTACGCTGTGG TGCTTTGTGGTCTTCTTGTGTTCA
TWS58 TGCCACAAGCTATTCCAGTGCAGG GGGCCTGTGATGCATCTGTCCA
TWS59 TGGCCGGGTATGGAAATTCCTTGT CCAAGCTCAAATCACGCTTGTCCA
TWS60 TCGACGATCGTACCTTTACCGA TGAGATGTCTAGGAGGAGGACG
TWS61 TCGCCGGCACTTAAAATACCACA ACGTTGCTGTAGGGTTCAGTGG
TWS62 GCCACGAGGCCGAAGGAGGTA TGTGGTTGGTCTCCAATCCCCC
TWS63 TGCATCACACTTCATAGGAGGGGA AGCGGACACAATGGTGGACTTACT
TWS64 ACCTAGCCAAAACAGTCCCAGAA GGAGTTGGGATGCATGCCCTTTG
TWS65 CCAATGTGGGCTACATCCACC ATTGTAATAGCATGGATAAGTGCCC
TWS66 TCCCTATTTAGCATTCCGACAACA TCCCTTGGTGAGATCAAACTTCG
TWS67 AGTTTGCATGCTCTTCAACCTAGT AGGCAGAATCGGTGAGTGGTT
TWS68 ACACAAATCCCCTTGGTCACATT GGCCAAAAGGCTGAAGGAGGT
TWS69 GAGGAGAAACCCCTAAAGGGGAAGA CTTCGCAGCCCCATCCCTGC
TWS70 TGTCGCATCGAGGACGATGCTTTC CATGGCGGCGGCAGTTCTTG
TWS71 TCTTCAACTCAGCCACTTGGGC TGAATAGTGCAACCATGTGGTCA
TWS72 AAGTGGGAGTGAGTGGTCACTGT TCTCACGTCTTTGGCACACATGC
TWS73 TCCCCCTCTCCACCTCAAGGA AGTAGCACACGAGGAGGCGAGT
TWS74 ACAAGAGGCTTTACCCAGTGACCA GCTTACCCACCACTAGGTTACAACG
TWS75 AAGGGCACGTCCCCACTACC GTGTGCTCATGAACTAGCAACACA
TWS76 CATGTTACCACCAATTTCACACCCA AGAAGGGCCATCTGGTCCCCA
TWS77 TGAGTGGAAGAAACGGGAGAGAGG AGGAAGCCGACCTTCCTCAGAGA
TWS78 TCACCAAGGAACTGACAAAGTGC GGTCAGTGACTTCGGATTCCATCG
TWS79 TGGCTTACGATGCCAGAGACCCA TGCGTCTCGGGTGAGGGAGA
TWS80 TCGGCAGTCACCCAACAAAGTGA GGGACAAGGGTCTGCATTTTCTGC
TWS81 CAGGGCTCAAATTCGCGGGC CCGCCTGGCGTTTGACAGGA
TWS82 TGATGCGAGGCGGAAGAAAGA AGGATTGCCCTTACACTCTCCA

576 园 艺 学 报 40 卷
续表 3
编号
No.
上游引物（5′–3′）
Forward primer（5′–3′）
下游引物（5′–3′）
Reverse primer （5′–3′）
TWS83 AGGAGCACGGAGGCCATGGAA ACAGGACGCATTCGAGATCTTTGGA
TWS84 TCCCTCTCCTAGGGTTGCTTTC TGTTCTGTTGTGCACGGCCA
TWS85 AGGAACAAGACTGGAGGATGCCA ACCTTGTCACGCAACCAGAGTGC
TWS86 ACAAACACACCACACCAACCA TGGTGCCTCTTGCATTGTTATGT
TWS87 GCCAACTCCATAAGAACTTTTCACA CACAAAGACATCGCCAAGTGTCA
TWS88 GCCAGGGCTATCTTGGAGAACCCA TCAGACAAAGGGATGCCGATGGA
TWS89 ACGCATGGCAATACATCTCCCATTT CGTTGTGCGTAAAGCAGATTGTGGC
TWS90 AGAGGCGTGCAACTTCTGTATAGC AGCCCTAGCTCCACGGCTTGA

2.3 候选 SSR 标记的验证
在所获得的 90个获选标记中依次选取编号为TWS1 ~ 20的引物在南方红豆杉中进行 PCR验证，
结果所有的引物都能获得稳定清晰的条带。其中获得单一条带的有 12 个（60%），见图 1 中泳道 1、
2、5、7、8、9、11、13、14、15、16、17；另外有 7 个（35%），见图中泳道 3、4、6、10、12、
18、20，虽然条带不单一，但能明显区分出主带及杂带，而且杂带只有 1 条，能明显看出是非特异
性扩增的产物；只有 1 个引物（19 号）获得 2 两条扩增产物（5%），其主次带之间区分不明显。由
于本研究在验证这 20 个标记时，所用的 PCR 退火温度都是 57.5 ℃，是同一次 PCR 产物的扩增结
果。而在实际应用中，可以根据试验材料及其他条件适当调节退火温度，从而提高特异扩增性。在
实际应用中，SSR 标记只读主带扩增结果。因此这 20 个引物中 19 个（95%）都可以有效地用于分
子标记相关的研究。据此推测，所开发的 90 个候选 SSR 引物中，理论上应该有大约 86 个引物可以
作为南方红豆杉基因组 SSR 标记。本研究结果表明，利用 GSS 序列可以高效地开发基因组 SSR 标
记。


图 1 候选引物 1 ~ 20 的验证结果
1 ~ 20 对应表 3 中引物 TWS1 ~ 20。
Fig. 1 Results of PCR products yield by candidate primers 1–20
The number 120 as products of TWS1–20 primers in Table 3.
3 讨论
根据检测方法的不同，分子标记可大致分成两类：一类是通过 DNA 分子杂交进行检测，另一
类是通过 DNA 分子扩增（PCR）进行检测。限制性片段长度多态性（RFLP）（Botstein et al.，1980）
3 期 易官美等：南方红豆杉 SSR 分布特征分析及分子标记的开发 577

是最早发展出来的分子标记，是基于分子杂交检测的技术。由于分子杂交在操作上比较复杂，且费
用较高，因此目前已很少使用。随着 PCR 技术的出现和发展，各种基于 PCR 的分子标记技术相继
发展起来。根据扩增产物有无特异性，基于 PCR 的分子标记又可分成特异标记和非特异标记两类。
常用的非特异标记有随机扩增多态 DNA（RAPD）（Williams et al.，1980）、扩增片段长度多态性
（AFLP）（Vos et al.，1995）和扩增简单重复序列间区（ISSR）（Zietkiewicz et al.，1994）。非特异
标记的主要优点是，同一套 PCR 引物可以应用于任何生物，因此对于遗传研究薄弱的植物来说就显
得特别有用。然而，这个优点同时也是缺点。由于非特异标记的扩增产物是不确定、非特异的，因
而用它们构建的遗传图谱往往质量不高，难以在不同作图群体之间进行比较，不能有效地应用于遗
传研究和标记辅助育种。特异标记则有效地克服了这些缺点。所以，对那些已经开发出大量特异标
记的植物（如水稻、玉米等），人们已很少使用非特异标记，而是主要使用特异标记。开发特异标记
已成为分子标记技术发展的主要方向。
由于药用植物的生物信息较少，相关分子生物学研究基础也落后于其他植物。在药用植物现代
化中，迫切需要提升对道地药材的品种化鉴定的不易受外界环境影响的方法。分子标记技术是种子
纯度鉴定的客观可行方法。因此开发高效可靠的分子标记是分子鉴定的前提基础。SSR 标记是一种
稳定可靠的特异性分子标记。然而由于开发 SSR 标记费时费力，目前多局限在具备全基因组数据的
物种中进行大规模开发。对于红豆杉这样缺少基因组数据的物种难以进行大量开发。因此，迄今尚
未见红豆杉植物中开发 SSR 标记的报道。
本研究中首次尝试利用 GSS 序列开发南方红豆杉的 SSR 标记。GSS 序列是 NCBI 的一部分，
已经整合到了 GenBank 中，与 EST 数据库类似。区别在于 GSS 序列是从全基因组序列克隆两端获
得的短的部分序列，而不是从 cDNA 文库中获得的克隆，因此 GSS 数据更能反映所研究生物全基因
组的特征（卢江杰 等，2009；詹少华 等，2010；李婧 等，2011）。由于启动子、调控序列等均位
于基因组中的非翻译区，因此 GSS-SSR 分子标记更能从基因组全局角度反映所研究生物的多态性。
本研究基于 GSS 序列开发了南方红豆杉的候选 SSR 引物。试验验证结果表明，所开发的 SSR 标记
在基因组中的扩增结果多表现为清晰可读的单一主带，表明这些标记在基因组中的位置是特异的，
能够有效地反映基因组的多态性，可以成为种子种苗鉴定及分子生物学等相关研究的有力工具。同
时本研究结果也表明 GSS 数据可以有效地用于 SSR 标记的挖掘。为那些不具备全基因组数据的物
种开发分子标记提供了新途径。

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