全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（8）：1596–1602 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–04–25；修回日期：2012–06–21
基金项目：国家自然科学基金项目（30971804）；国家转基因生物新品种培育重大专项（2010ZX08010-002）；教育部新世纪优秀人才计
划项目（NCET-08-0693）；长春市科技局计划项目（09YJ24）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：hyli99@163.com）
月季 CBF 转录因子基因的克隆及表达分析
翟俊峰 1，王法微 2，王 南 2，宗俊梅 1，李海燕 1,2,*
（1 吉林农业大学生命科学学院，长春 130118；2 吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心，长春
130118）
摘 要：根据 CBF（C-repeat binding factor）AP2/EREBP 保守区设计 1 对简并引物，采用 PCR 方法
对月季‘寒锦 4 号’（Rosa hybrida‘Hanjin 4’）CBF 转录因子基因中间片段进行克隆；再根据中间片段
区域设计了两对特异引物，采用反向 PCR 方法对该基因的 5和 3端的序列进行克隆，将中间片段与反向
PCR 产物拼接得到 CBF 基因全长序列，命名为 RhCBF，GenBank 注册编号为 EF582843；该基因序列长
758 bp，ORF 为 603 bp，编码 200 个氨基酸；同时，根据基因序列设计 1 对特异引物，利用荧光定量 PCR
分析月季 CBF 在不同逆境胁迫下的表达情况。结果显示低温和盐均可以诱导 RhCBF 的表达，而干旱处理
不能诱导其表达。
关键词：月季；CBF 转录因子；基因；克隆；表达
中图分类号：S 685.12 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）08-1596-07

Cloning and Expression Profiling of the Transcription Factor CBF Gene
from Rosa hybrida
ZHAI Jun-feng1，WANG Fa-wei2，WANG Nan2，ZONG Jun-mei1，and LI Hai-yan1,2,*
（1College of Life Sciences，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2Ministry of Education Engineering
Research Center of Bioreactor and Pharmaceutical Development，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）
Abstract：We firstly cloned the partial fragment of CBF from Rosa hybrida‘Hanjin 4’using
homology cloning methods according to AP2/EREBP conserved sequences. Then，two pairs of specific
primers for inverse PCR were designed to clone the 5 and 3 end sequences of CBF gene，respectively. The
resulting 5 and 3 end sequences and the partial fragment were combined to a full length sequence，which
was named RhCBF and submitted to GenBank（Accession number：EF582843）. The full-length of cDNA
is 758 bp and the open reading frame（ORF）is 603 bp，encoding 200 amino acids；According to Real-time
PCR analysis using a pair of specific primers，we found that salt，low temperature stresses could induce the
expression of RhcCBF dramatically，but the mRNA level of RhCBF could hardly induced by drought
treatment. These results show that RhCBF would play a critical role in salt and low temperature stresses.
Key words：rose；transcription factor CBF gene；gene；cloning；expression

低温、干旱和盐碱等环境条件，都可对植物造成渗透胁迫，使植物失水受伤害，有时甚至能够

8 期 翟俊峰等：月季 CBF 转录因子基因的克隆及表达分析 1597

导致死亡（刘祖祺和张石城，1994）。CBF（C-repeat binding factor）是一类与逆境胁迫相关的转录
因子，它能够识别并结合于低温、干旱和高盐胁迫应答有关基因启动子区域中的 CRT/DRE（C-repeat/
dehydration responsive element）顺式作用元件，启动下游抗逆基因的表达，从而在转录水平上调控
多个抗逆基因的表达。CRT/DRE 元件位于受低温或干旱调控的 RD/COR（responsive to dehydration/
cold-regulated）基因的启动子区，通过与 CBF 转录因子结合参与非生物胁迫响应。最新研究结果表
明，在逆境胁迫条件下，信号传导过程中的关键基因，如 CBF 转录因子等能够调控许多功能基因的
表达（张丽丽 等，2008；Morran et al.，2011；Yang et al.，2011）。
Stockinger 等（1997）首次从拟南芥中分离并鉴定了一个新的 cDNA，这个 cDNA 能编码一种
转录激活因子，这种转录激活因子含有 AP2/EREBP DNA 结合域，能识别 COR 基因（Cold Regulated
Gene，冷相关基因）中的 CRT/DRE 元件并与之结合，故命名为 CBF1（CRT/DRE-binding factor 1，
即 CRT/DRE 结合因子）。Thomashow（2010）的研究结果表明 CBF1 过量表达能诱导一组 COR 的
表达，提高植物抗冻性。Huang 等（2012）证明了 ICE-CBF-COR（Inducer of CBF expression，CBF
表达诱导子）信号通路不仅能提高植株抗冻性，而且还能提高抗旱性。月季品种‘寒锦 4 号’是在
中国东北地区能安全越冬的最早的主栽品种，其对低温胁迫具有很强的耐受能力，而关于其耐寒的
机制研究尚未见报道。
本研究中首次从月季（Rosa hybrida）中分离并克隆了 CBF 基因，并分析其在不同逆境胁迫下
的表达情况。根据RhCBF在不同逆境中的差异表达，确定其在月季抗逆分子机制中的作用，为RhCBF
功能的深入研究及通过基因工程改良园艺植物的抗逆性奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试的植物材料为月季（Rosa hybrida）‘寒锦 4 号’组培苗，大肠杆菌菌株为 DH5α 由本实验
室保存，克隆载体 pMD-18 vector 购自大连宝生物公司。
Taq DNA 聚合酶购自上海生工生物工程公司，T4 DNA 连接酶、限制性内切酶及其它工具酶、
IPTG、X-gal 等购自大连宝生物公司。DNA Marker DL2000、DNA 提取试剂盒、切胶回收试剂盒及
清洁试剂盒均购自宝泰克公司。植物基因组 DNA 小量提取试剂盒、DNA 清洁试剂盒购自维特洁公
司。引物见表 1。

表 1 使用到的引物信息
Table 1 The primers used in experiments
引物名称
Primer name

对应序列
Corresponding sequence
MidF 5′-TTYMRDgAgACDMgDCACCC-3′ 中间片段引物
Primers for partial fragment MidR 5′-ARRAgMADNCCYTCNgCCAT-3′
RosaF1 5′-gTATgTCATTgCCggAgTTg-3′
RosaR1 5′-gATTCACCTTTCAgAgCCAg-3′
RosaF2 5′-AgggTATgTggATgAggAgg-3′
反向 PCR 引物
Primers for inverse PCR

RosaR2 5′-CgAgCCAAACACgAgACTTC-3′
荧光定量 PCR 引物 RcbfF 5′-gAACCAgCAgCACCATCT-3′
Primers for RT-PCR RcbfR 5′-CCTCCCAgCTTTCCTCTT-3′
ActinF 5′-AggAAggCTggAAgAggACC-3′
ActinR 5′-CgggAAATTgTgAgggACAT-3′
1598 园 艺 学 报 39 卷

1.2 试验方法
1.2.1 月季 CBF基因中间片段的获得
使用宝泰克基因组 DNA 提取试剂盒提取月季的基因组 DNA，根据 GenBank 上已经发表的几种
植物 CBF 中 AP2/EREBP 结构域高度保守的氨基酸序列设计了一对简并引物 MidF 和 MidR（表 1），
以基因组 DNA 为模板，MidF 和 MidR 为引物进行 PCR 扩增 CBF 中间片段。PCR 反应退火温度为
47 ℃，扩增 35 个循环，PCR 产物用 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。将目的片段进行回收，并连接到克
隆载体上，再将连接产物转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞进行克隆，挑取单菌落进行菌液 PCR 鉴定，
将阳性菌落送交大连宝生物公司进行测序。
1.2.2 反向 PCR扩增月季 CBF两端序列
根据扩增出的 CBF 中间片段序列设计合成两对寡核苷酸引物，分别为 RosaF1、RosaR1 和
RosaF2、RosaR2（表 1），利用反向 PCR 的方法扩增 CBF 基因的两端旁侧序列。首先用限制性内切
酶 XbaⅠ将基因组 DNA 进行酶切，用宝泰克 DNA 清洁试剂盒纯化回收酶切的 DNA 片段。回收产
物用 T4 DNA 连接酶进行环化，环化后的样品作为反向 PCR 扩增的模板。用外侧引物 RosaF1 和
RosaR1 进行第一轮 PCR 反应，反应完毕后，将产物稀释 100 倍作为第二轮 PCR 反应的模板。用内
侧引物 RosaF2 和 RosaR2 进行第二轮 PCR 反应，反应完毕后，取 10 µL PCR 产物用 1%的琼脂糖凝
胶电泳检测，将 PCR 扩增出的特异条带克隆到克隆载体后进行测序。
1.2.3 月季 CBF全长 DNA的拼接及序列分析
将目的基因中间片段与反向 PCR 获得的 RhCBF 旁侧序列相拼接，获得 RhCBF 全长序列。利用
DNAMAN 分析 RhCBF 的氨基酸序列与已知 CBF 家族成员进行同源性比较。再将 CBF 在 http：//ncbi.
nlm. nih. gov 网站上使用 BLAST 工具并进行基因序列相似性分析。
1.2.4 月季 CBF基因在不同逆境胁迫下的表达分析
将月季茎段经升汞脱毒后转入 MS + 6-BA 2 mg · L-1 + NAA 0.2 mg · L-1 的固体培养基中进行芽
的诱导。之后转移至 MS + 6-BA 2.5 mg · L-1 + NAA 0.1 mg · L-1 的固体培养基中进行快繁。将快繁后
的幼苗分别转移至含有 150 mmol · L-1 NaCl 和 15% PEG4000 的培养基中进行胁迫处理。另外，将幼
苗移至 MS 培养基中，置于 4 ℃进行低温处理，处理时间均为 0.25、0.5、1、2、4、8、12、24 和
48 h。分别提取总 RNA 后用于荧光定量 PCR 分析 RhCBF 基因的表达情况。同时，以 Actin 为内参
基因计算 RhCBF 的相对表达量（表 1）。
2 结果与分析
2.1 月季基因组 DNA 的提取
利用宝泰克基因组 DNA 提取试剂盒从月季中提取基因组 DNA，电泳检测结果表明提取的 DNA
质量较高，没有发生降解，可以用于 PCR 反应。
2.2 月季 CBF 的分离与克隆
根据分析已报道的植物 CBF 基因均无内含子，所以以月季基因组 DNA 为模板，利用设计的简
并引物 MidF 和 MidR 进行 PCR 扩增，获得一个 365 bp 大小的 CBF 基因中间片段（图 1），并克隆
到 pMD18-T 载体中。转化大肠杆菌后挑取单菌落培养，提取质粒 DNA 后进行 PCR 鉴定与
HindⅢ/XbaⅠ双酶切鉴定。结果显示，均可以得到一条 365 bp 大小的条带（图 2）。以环化后的产物
8 期 翟俊峰等：月季 CBF 转录因子基因的克隆及表达分析 1599

为模板，利用嵌套引物 RosaF1、RosaR1 和 RosaF2、RosaR2 进行反向 PCR 获得 1 400 bp 的旁侧序
列，将 PCR 产物克隆到克隆载体后鉴定阳性克隆，并对阳性克隆质粒 DNA 进行 BamHⅠ/SacⅠ双
酶切鉴定，电泳检测，结果出现一条 1 400 bp 大小的目的片段和 2 700 bp 大小的载体片段（图 3）。




















图 3 月季 RhCBF 基因反向 PCR 产物的重组质粒酶切鉴定结果
M：DNA marker（DL2000）；1：重组质粒酶切产物；2：反向 PCR 产物。
Fig. 3 Identification of the RhCBF inverse PCR fragment recombinant plasmid by digestion
M：DNA marker（DL2000）；1：Recombinant plasmid was digested by EcoRⅠ/PstⅠ；
2：Product of the inverse PCR of RhCBF.

2.3 月季 CBF 的序列分析
根据反向 PCR 获得的旁侧序列与中间片段序列进行拼接，获得 CBF 的全长序列（图 4）。通过
序列分析发现，月季 CBF 基因编码区由 603 个核苷酸组成，无内含子，编码 200 个氨基酸。不同植
物中 AP2/EREBP 区域内是高度保守的，AP2/EREBP 结构域由 60 个左右氨基酸残基组成，参与植
物在低温、干旱、高盐等胁迫条件下的基因表达调节。而且在 AP2/EREBP 结构域的上游和下游分
别有两段保守序列即 PKK/RPAGRxKFxETRHP 和 DSAW，在预测由拟南芥编码产生的 140 多种
AP2/EREBP 域蛋白中，只有 CBF1、CBF2、CBF3 才具有这两段短多肽序列（Stockinger et al.，1997；
Medina et al.，1999），因而称它们为 CBF 蛋白的特征序列。而在 AP2/EREBP 区域的两侧氨基酸序
列总体上看没有明显的同源性（图 5）。
图 1 月季 CBF 基因中间片段的 PCR 扩增结果
M：DNA marker（DL2000）；1、2、3：PCR 产物；4：阴性对照。
Fig. 1 Amplification products of the partial fragment of
RhCBF by PCR
M： DNA marker（DL2000）；1，2，3：PCR products of the partial
fragment of RhCBF；4：Negative control.
图 2 月季 CBF 基因中间片段重组质粒酶切鉴定结果
M：DNA marker（DL2000）；1：重组质粒酶切产物（HindⅢ和
XbaⅠ）；2：RhCBF 中间片段的 PCR 产物。
Fig. 2 Identification of the RhCBF partial fragment
recombinant plasmid by digestion
M：DNA marker（DL2000）；1：Recombinant plasmid was digested
by HindⅢ and XbaⅠ；2：PCR product of the partial
fragment of RhCBF.
1600 园 艺 学 报 39 卷

TTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTG
GCGGATCCGTTCTGTACCTTTTCCATGCTCATAAATCCCCATGCTCTGCGATGCTTCTGCTTCTTCACT
AATGGCTTATAGAGAGGAACCAGCAGCACCATCTTCTCCAGCTTCGTTGTTAATGAATCTGGGGCAA
ACCCTAACCCACATTCAGAGTGGAGTGATCAAGAAGAGGAAAGCTGGGAGGAAGAAGTTCAAGGA
GACTCGCCACCCGGTGTACAAAGGCGTCAGGCAGAGGAACGGCAAGTGGGTTTGCGAAATGAGGC
AACCGGGTCTCAAGAAGTCTCGTGTTTGGCTCGGTACCTTCACTTGTCCTGAAATGGCTGCTAGGGC
TTATGATGTAGCAGCTCTGGCTCTGAAAGGTGAATCTGCTCAGTTGAACTTTCCGGATGAAGCTAAG
GCGTCTCCTTCTTGGACTTCGAGTATGTCATTGCCGGAGTTGACGAGTATGGTGAACTTGGAGAAGG
TAGAAGTAGGGTCGAGTAAAGGGTATGTGGATGAGGAGGAGTTGTTTAACATGCCAGAGATACTTGA
CAGTATGGCTGAGGGTTTGATTCTAACTCCCCCAGCCCTGAAGAAAGGTTTTAACTGGGATGATTATG
ATCTGGAGAATGCCGTAGAGTTTTCTCTGTGGAGTGATTAACTTTCTTAACTTCCTGACTTGGATTGTT
GACCAGAGCTCGCCAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCG

图 4 月季 RhCBF 全长序列
带有下划线的碱基序列为起始密码子与终止密码子。
Fig. 4 The full length sequence of RhCBF from R. hybrida
The nucleotide sequence with underlined are start codon and stop codon.






























图 5 不同植物 CBF 基因氨基酸序列同源性比较
划线部分为 AP2/EREBP DNA 结合结构域；黑点标记部分为信号肽序列。
Rh：月季 CBF（Rosa hybrida）；At：拟南芥 CBF3（Arabidopsis thaliana）；Ta：小麦 CBF（Triticum aestivum）；
Le：番茄 CBF1（Lycopersicon esculentum）；Os：水稻 CBF3（Oryza satica）。
Fig. 5 The alignment of CBF proteins from different plants
The ERF/AP2 DNA-binding domains are underlined：The NLS sequence is indicated by black circles.
8 期 翟俊峰等：月季 CBF 转录因子基因的克隆及表达分析 1601

2.4 月季 CBF 表达分析
通过定量 PCR 分析发现，低温和盐处理均可以诱导 RhCBF 的表达。其中，低温处理后 RhCBF
表达量随时间推移而不断升高，处理 2 h 后可以检测到表达量的最高值，达到 Actin 表达量的 12.3
倍；随后表达量开始逐渐降低，在 48 h 后表达量降至 Actin 表达量的 6.6 倍（图 6）。盐处理后 RhCBF
的表达模式与低温处理相近，分别在 4 h 时出现峰值，随后表达量逐渐降低。但在干旱诱导下，RhCBF
的表达量没有发生明显的变化（图 6）。















图 6 不同逆境胁迫下 RhCBF 的表达
Fig. 6 The expression of RhCBF under various abiotic stresses

3 讨论
AP2/EREBP 家族的转录因子中包括与调控植物细胞周期、生长发育以及环境胁迫应答反应等有
关的一系列转录因子，家族成员的转录激活区差异很大，但它们都含有由 60 个左右氨基酸残基组成
的非常保守的 DNA 结合区（即 AP2/EREBP 结构域），而且 N–末端都有起核定位作用的碱性氨基
酸序列。本研究中同源克隆的方法克隆了月季 CBF 基因的全长序列，GenBank 登录号为 EF583559。
通过对月季 CBF 基因（RhCBF）编码的氨基酸序列分析表明，RhCBF 含有高度保守的 AP2/EREBP
结构域，该结构域中含有 79 个氨基酸，这与 Joseph 等（2003）和 Yamaguchi 等（1994）所得到拟
南芥与水稻 CBF 的特点一致。与其他 CBF 转录因子类似，RhCBF 具备反式作用因子的典型特征：
即它的 N–末端有一段核定位信号信号序列“PKK/RPAGRxKFxETRHP”，C–末端有一段酸性活化
区域（Walid et al.，2006）。值得注意的是，RhCBF 的 AP2/EREBP 结构域以外的氨基酸序列与其他
植物 CBF 氨基酸序列总体上看没有明显的同源性，这与前人的研究结果相同（Yamaguchi-Shinozaki
& Shinozaki，1994）。另外，RhCBF 的 N–末端区域有富含精氨酸和赖氨酸残基的碱性核定位信号
区，位于第 36 ~ 75 个氨基酸区域内，RhCBF 转录激活因子进入细胞核的过程可能受该区域的控制；
RhCBF 的 C–末端有富含酸性氨基酸的转录激活区，位于第 190 ~ 200 个氨基酸区域内，这一区域
可能在转录激活中起主导作用（Walid et al.，2006）。
在月季 CBF 转录因子的 AP2/EREBP 结构域的上游和下游存在 PKK/RPAGRxKFxETRH 和
DSAW 特征序列，而在拟南芥等 140 多种 AP2/EREBP 域蛋白中，只有 CBF1、CBF2、CBF3 才具有
这两段短多肽序列，因而称他们为 CBF 蛋白的特征序列（Ingram & Bartels，1996；Carlos et al.，2012）。
1602 园 艺 学 报 39 卷

这两个特征序列在进化程度不同的物种中保守存在，说明它们具有重要功能。PKK/RPAGRxKFxETRHP
序列与核运输信号相似，表明它可能与蛋白运输有关（Walid et al.，2006）。与其他 CBF 基因不同的
是，月季 CBF 基因编码区相对较短，全长序列 603 bp。但是水稻的 OsDREB1D 基因全长 642 bp，
马铃薯 LeCBF 基因的全长 630 bp 等都已证明了具有正常 CBF 基因的功能（Joseph et al.，2003；Qin
et al.，2004）。通过荧光定量 PCR 检测结果显示 RhCBF 对低温及盐处理十分敏感，而对干旱处理不
敏感（图 6）。Yang 等（2011）报道 MbDREB 可以被低温、干旱、盐及 ABA 处理所诱导，并且 MbDREB
超表达拟南芥株系具有更强的耐盐、干旱和低温的能力。这说明 RhCBF 可能在月季耐寒及耐盐的
分子机理中起调控作用。另外，多数 CBF 基因的 AP2/EREBP 保守结构域的下游序列为 DSAW（Carlos
et al.，2012），月季 CBF 基因的保守结构域为 DEAK，这两个碱基的差异是否影响 RhCBF 对下游基
因的调控还有待于进一步研究。

References
Carlos F C，Raquel R，Irene R，Teresa S B. 2012. Unraveling the roles of CBF1，CBF4 and dehydrin1 genes in the response of table grapes to high
CO2 levels and low temperature. J Plant Physiol，169 (7)：744–748
Huang G T，Ma S L，Bai L P，Guo Z P. 2012. Signal transduction during cold，salt，and drought stresses in plants. Mol Biol Rep，39 (2)：
969–987.
Ingram J，Bartels D. 1996. The molecular basis of dehydration tolerance in plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，47：377–403.
Joseph G Dubouzet，Yoh Sakuma，Yusuke Ito. 2003. OsDREB genes in rice，Oryza sativa L.，encode transcription activators that function in
drought-，high-salt- and cold-responsive gene expression. Plant J，33：751–763.
Liu Zu-qi，Zhang Shi-cheng. 1994. Plant physiology of resistance. Beijing：China Agriculture Press. (in Chinese)
刘祖祺，张石城. 1994. 植物抗性生理学. 北京：中国农业出版社.
Medina J，Bargues M，Terol J. 1999. The Arabidopsis CBF gene family is composed of three genes encoding AP2 domain-containing proteins whose
expression is regulated by low temperature but not by abscisic acid or dehydration. Plant Physiol，119 (2)：463–470.
Morran S，Eini O，Pyvovarenko T，Parent B，Lopato S. 2011. Improvement of stress tolerance of wheat and barley by modulation of expression of
DREB/CBF factors. Plant Biotechnol J，9 (2)：230–249.
Qin Feng，Sakuma Yoh，Li Jie，Liu Qiang. 2004. Cloning and functional analysis of a novel DREB1/CBF transcription factor involved in
cold-responsive gene expression in Zea mays L. Plant Cell Physiol，45 (8)：1042–1052.
Stockinger E J，Gilmour S J，Thomashow M F. 1997. Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator that
binds to the C-repeat/DRE，a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in responsive to temperature and water deficit.
Proc Natl Acad Sci USA，94：1035–1040.
Thomashow M F. 2010. Molecular basis of plant cold acclimation：Insights gained from studying the CBF cold response pathway. Plant Physiol，154
(2)：571–577.
Walid E K，Marie N，Gilles M，Guylaine K，Chantal T. 2006. Expression profile of CBF-like transcriptional factor genes from Eucalyptus in response
to cold. J Exp Bot，57 (10)：2455–2469.
Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K. 1994. A novel cis-acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought，
low-temperature，or high-salt stress. Plant Cell，6 (2)：251–264.
Yang W，Liu X D，Chi X J，Wu C，Li Y，Li H Y. 2011. Dwarf apple MbDREB1 enhances plant tolerance to low temperature，drought，and salt
stress via both ABA-dependent and ABA-independent pathways. Planta，233：219–229.
Zhang Li-li，Li Jing-fu，Wang Ao-xue. 2008. The role of the transcription factor CBF genes in cold-responsive molecular mechanism. Acta
Horticulturae Sinica，35 (5)：765–771. (in Chinese)
张丽丽，李景富，王傲雪. 2008. 转录激活因子 CBF 基因在植物抗冷分子机制中的作用. 园艺学报，35 (5)：765–771.