全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（1）：43–54 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2010–04–01；修回日期：2010–11–05
基金项目：国家科技支撑计划项目（2008BAD92B02）；林业公益性行业科研专项（200904032）；北京市自然科学基金重点项目（6081001）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：chinabjwyz@sohu.com；Tel：010-82592521）
杏 EST-SSR 标记的开发
上官凌飞 1，李晓颖 1，宁 宁 1,2，王玉柱 2,*，章 镇 1，房经贵 1
（1 南京农业大学园艺学院，南京 210095；2北京市农林科学院林业果树研究所，北京 100093）
摘 要：利用 MISA 软件对 NCBI 上杏的 15 387 条 EST 序列进行 SSR 位点查找，发掘出含有 SSR
位点的序列 1 073 条，共有 1 353 个 SSR 位点，候选 SSR 位点出现的频率为 8.79%。二核苷酸、三核苷酸
和四核苷酸重复是最主要的重复类型，分别占 23.50%、38.80%和 23.43%。设计了 50 对 EST-SSR 引物并
进行 PCR 扩增，发现 40 对引物能扩增出理想的 PCR 产物，其中有 25 对引物能够扩增出多态性带。随
机对 7 对引物的部分杏扩增片段进行了测序分析，发现有 57.1%的片段具有相应的 SSR 位点，对梅 DNA
指纹中部分谱带的测序结果也证明是杏扩增出的相应的 SSR 位点。根据推算，从杏 EST 中开发 SSR 标记
的开发效率为 3.98%。进一步选用 20 对扩增效果最好的引物对 24 个杏品种，16 个花梅品种以及 8 个果
梅品种进行 DNA 指纹构建与遗传多样性分析，结果表明，来源于杏的 EST-SSR 引物在梅中有很高的通用
性，杏和梅是遗传差异明显的两种植物，果梅与花梅在遗传上是不能分为两类的同种植物。
关键词：杏；梅；EST-SSR；遗传差异分析
中图分类号：S 662.2；S 662.4 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）01-0043-12

Development of EST-SSR Markers in Apricot
SHANGGUAN Ling-fei1，LI Xiao-ying1，NING Ning1,2，WANG Yu-zhu2,*，ZHANG Zhen1，and FANG
Jing-gui1
（1College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China；2Institute of Forestry Pomology
Academy of Agricultural and Forestry Sciences，Beijing 100093，China）
Abstract：15 387 ESTs of apricot from NCBI were screened using MISA software. The results
showed that 1 353 SSRs were mined from 1 073 ESTs with a frequency of 8.79%. Di-，tri- and tetra
nucleotide repeats EST-SSRs were dominant，accounting for 23.50%，38.80% and 23.43%，respectively.
Fifty primer pairs were designed for partial EST-SSRs and used for PCR amplification with 40 primer
pairs showing amplifications while 25 were polymorphic. PCR products from 7 EST-SSR primer pairs
were selected for sequence analysis where 57.1% of the fragments contained SSRs. EST-SSR motifs were
conserved between mei and apricot. Accordingly，the proportion of developing efficient EST-SSR primers
from apricot was 3.98%. The best twenty workable EST-SSR primer pairs were chosen to generate DNA
fingerprints of 24 apricot，16 flower-mei and 8 fruit-mei cultivars. Using these EST-SSR primer pairs，mei
and apricot were classified into 2 groups. The EST-SSR primers designed from apricot sequences showed
high polymorphism in mei varieties and exhibited high transferability between mei and apricot cultivars；
Fruit-mei and flower-mei were genetically the same plant.

44 园 艺 学 报 38 卷
Key words：apricot；mei；EST-SSR；analysis of genetic diversity

简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）又称微卫星（microsatellite），是由 1 ~ 6 个核苷
酸为重复单位组成的串联重复序列，如(AT)n，(CG)n，(GGT)n 等重复。SSR 标记具有技术简单、位
点专一性、共显性、多等位性等特点，且含量丰富、遍布整个基因组（Tautz & Schlötterer，1994；
Powell et al.，1996）。因此，SSR 标记被广泛应用于植物鉴定、遗传连锁图谱构建，种质资源多样
性分析，以及比较基因组学等方面的研究。
传统的 SSR 引物开发通常需要经过构建基因组文库、探针杂交、克隆、测序来完成，存在费时，
费力，成本较高，效率较低，同位素污染等问题（Rassmann et al.，1991）。近年来，EST（Expressed
Sequence Tags）序列大致以每周 10 000 个的速度从大量 cDNA 文库中被开发出来（周延清，2005），
EST 数据库中已积累了大量的信息，基于 EST 的 SSR 标记的开发也已成为新型与高效的措施之一。
与传统 SSR 标记相比，EST-SSR 标记不仅具有传统 SSR 标记多态性高、共显性、重复性好等特点，
更重要的是它开发成本较低，节省了大量人力物力，而且由于 EST-SSR 来源于表达的基因组区域
（Varshney et al.，2005），可直接反映相关基因的多样性，同时它在不同物种间有良好的通用性（Gupta
et al.，2003；Yu et al.，2004；Poncet et al.，2006；Jia et al.，2007）。目前，EST-SSR 标记已成为重
要农艺性状定位、基因作图、遗传多样性、比较基因组学研究的新型重要工具（Varshney et al.，2005）。
据一些研究发现，水稻与甘蔗分别有 3%和 2.9%的 ESTs 含有 SSR（Cho et al.，2000；Cordeiro et al.，
2001）位点，桃与扁桃中可设计出 SSR 引物的 ESTs 占 4.1%（Jung et al.，2005）。
杏（Prunus armeniaca L.）是我国栽培历史最久的果树，目前世界各国栽培的杏都起源于中国
（张加延和张钊，2003）。杏的染色体小，组成相对简单（2n = 2x = 16），是果树基因组学研究的重
要对象。近年来，有关杏的分子生物学方面的文章不断发表，AFLP、SSR 等标记被运用于杏遗传分
析方面（Hagen et al.，2002；Hurtado et al.，2002；Decroocp et al.，2003，2004；Zhebentyayeva et al.，
2003；何天明 等，2006；王玉柱 等，2006；蔡胜文 等，2008；苑兆和 等，2008；张淑青 等，2010）。
作者从 NCBI 公布的所有杏 EST 中查找 SSR，分析这些 SSR 位点的特点及规律，利用 4 个杏品种
DNA 对新开发的 50 对引物进行了筛选并随机挑选部分引物的扩增片段进行测序分析，据此推算杏
EST 序列开发 SSR 引物的效率。梅（Prunus mume）是原产于我国且与杏亲缘关系较近的物种，杏
与梅的很多品种间杂交可育（褚孟嫄，1999；王化坤 等，2010）。本研究中首先选用梅进一步验证
了 EST-SSR 引物的通用性问题，并在此基础上对杏与梅以及果梅与花梅的遗传关系进行了初步分
析。
1 材料与方法
1.1 材料及其 DNA 提取
24 份杏品种的叶片取自北京市农林科学院林业果树研究所，16 份花梅品种与 8 份果梅品种的
叶片取自南京农业大学江浦农场，详见表 1。
杏、梅品种的幼叶中提取基因组 DNA 参照 Doyle 和 Doyle（1987）的方法稍加改良。
1.2 EST 的获得与处理
从 NCBI 公共数据库（http：// www. ncbi. nlm. nil. gov/sites/entrez）下载全部的 15 387 条杏 EST
序列（截止到 2009 年 10 月 29 日），利用 Phrap 软件（http：//www. phrap. org）进行 EST 拼接，然
1 期 上官凌飞等：杏 EST-SSR 标记的开发 45

后通过 MISA 软件（http：//pgrc. ikp-gatersleben. de/misa）对拼接后的结果进行 SSR 位点搜索，搜索
参数设置为重复单位为 2 个碱基、3 个碱基、4 个碱基、5 个碱基、6 个碱基，重复次数依次为 6 次、
4 次、3 次、3 次、3 次。

表 1 杏、梅试验材料
Table 1 Varieties of apricot and mei for SSR analysis
编号 品种名称 原产地 编号 品种名称 原产地
No. Cultivar name Place of origin No. Cultivar name Place of origin
1 红杏 Hongxing 甘肃 Gansu，China 25 甲州小梅 Koume 日本 Japan
2 红巴达 Hongbada 山东 Shandong，China 26 早花梅 Zaohuamei 江苏 Jiangsu，China
3 李家峪1号 Lijiayu 1 北京 Beijing，China 27 绿萼 Lü’e 江苏 Jiangsu，China
4 牛角黄 Niujiaohuang 陕西 Shaanxi，China 28 綦江杏梅 Qijiang Xingmei 四川 Sichuan，China
5 桃杏 Taoxing 河北 Hebei，China 29 双套梅 Shuangtaomei 云南 Yunnan，China
6 迎春杏 Yingchunxing 未知 Unknown 30 四川白梅 Sichuan Baimei 四川 Sichuan，China
7 蜜桃杏 Mitaoxing 河北 Hebei，China 31 之枝梅 Zhizhimei 江苏 Jiangsu，China
8 下屯早红早 Xiatunzao hongzao 未知 Unknown 32 高田丰后 Takadau Bungo 日本 Japan
9 大丰 Dafeng 河北 Hebei，China 33 南京照水朱砂 Nanjing Zhaoshuizhusha 江苏 Jiangsu，China
10 木牙格杏 Muyagexing 新疆 Xinjiang，China 34 久观朱砂 Jiuguan Zhusha 江苏 Jiangsu，China
11 冀光 Jiguang 河北 Hebei，China 35 无类绞 Wuleijiao 日本 Japan
12 马串铃 Machuanling 陕西 Shaanxi，China 36 鬼桂花 Guiguihua 日本 Japan
13 小堡香白 Xiaobaoxiangbai 未知 Unknown 37 筋入春日野 Jinruchunriye 日本 Japan
14 大接杏 Dajiexing 甘肃 Gansu，China 38 小绿萼 Xiao Lü’e 江苏 Jiangsu，China
15 早黄 Zaohuang 黑龙江 Heilongjiang，China 39 异味绿萼 Yiwei Lü’e 江苏 Jiangsu，China
16 早红杏 Zaohongxing 未知 Unknown 40 锦叶晚绿 Jinye Wanlü 江苏 Jiangsu，China
17 三强绿杏 Sanqianglüxing 未知 Unknown 41 宇治里 Yuzhili 日本 Japan
18 白杏 Baixing 山东 Shandong，China 42 三轮玉蝶 Sanlun Yudie 江苏 Jiangsu，China
19 沙金红 Shajinhong 山西 Shanxi，China 43 八重野梅 Bachong Yemei 日本 Japan
20 巴斗 Badou 安徽 Anhui，China 44 长蕊早玉蝶 Changrui Zaoyudie 江苏 Jiangsu，China
21 临潼红杏2号 Lintong Hongxing 2 陕西 Shaanxi，China 45 花座轮 Huazuolun 日本 Japan
22 牛角帮子 Niujiaobangzi 陕西 Shaanxi，China 46 新平家 Xinpingjia 日本 Japan
23 临潼红杏 Lintong Hongxing 陕西 Shaanxi，China 47 黄金鹤 Huangjinhe 日本 Japan
24 兰珠红 Lanzhuhong 陕西 Shaanxi，China 48 古今栏 Gujinlan 日本 Japan
注：1 ~ 24：杏；25 ~ 32：果梅；33 ~ 48：花梅。
Note：1–24：Apricot；25–32：Fruit-mei；33–48：Flower-mei.
1.3 EST-SSR 引物设计
引物设计参考陈军方等（2005）和王静毅等（2008）的研究，并将筛选条件稍加改进。选择 SSR
位点的重复单元为 2 个碱基，3 个碱基，4 个碱基，5 个碱基，6 个碱基的重复次数分别为 8 次、6
次、4 次、3 次、3 次，且 SSR 位点距离序列两端大于 50 bp 的序列。用 Primer 3.0 Plus 软件设计 50
对 SSR 引物，引物设计时主要考虑以下几方面因素：引物 GC 含量为 40% ~ 70%，最适值 50%；引
物长度 18 ~ 24 bp；复性温度 50 ~ 65 ℃，上下游引物相差小于 5 ℃；产物片段大小 150 ~ 350 bp。
设计出来的引物利用 Oligo 软件进行引物评估，避免引物二聚体、发夹结构和错配等情况的发生。
1.4 EST-SSR 引物筛选
将随机选择与评估通过的 50 对引物交由上海英骏生物技术公司合成。引物最适退火温度的筛
46 园 艺 学 报 38 卷
选在德国 Eppendorf 公司生产的 Mastercycler ep gradient 普通梯度 PCR 仪上进行。
模板为‘红杏’、‘冀光’、‘马串铃’和‘早红’，PCR 反应体积为 15 μL，其中包括 ddH2O 8.3
μL，10 × Buffer 1.5 μL，25 mmol · L-1 的 Mg2+ 1.2 μL，2.5 mmol · L-1 的 dNTPs 1.8 μL，10 pmol ·μL-1
的引物各 0.6 μL，30 ng · μL-1 的模板 DNA 1 μL，5 U · μL-1 的 DNA polymerase 0.08 μL。反应程序为
94 ℃预变性 5 min，然后进入 35 个循环，每个循环包括 94 ℃变性 40 s，50 ~ 65 ℃复性 40 s，72 ℃
延伸 1 min， 最后 72 ℃延伸 10 min。
PCR反应产物利用5%非变性聚丙烯酰胺凝胶在北京六一仪器厂生产的DYY-Ⅱ型垂直板电泳仪
及 DYC-30 型电泳槽中进行分离。上样完毕后在 200 V，100 mA 电流条件下电泳 90 min。电泳结束
后进行银染，染色参考 Bassam 等（1991）的银染方法。
1.5 片段回收克隆
从 PAGE 胶中割取目标片段，放入 1.5 mL 离心管中，加 100 μL 双蒸水洗涤两次，旋即离心并
吸去双蒸水，加入 1 × PCR Buffer 100 μL，25 mmol · L-1 Mg2+ 8 μL，并用吸头尖将凝胶碾碎，37 ℃
下水浴 5 h。水浴结束后离心，然后以 1 μL 上清液作为模板，进行 PCR 检测，所用引物、反应体系
及反应程序与引物筛选时相同。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳以鉴定扩增条带的特异性。
检测后，将琼脂糖上的特异片段割下，利用 Axygen 公司生产的 AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒
回收特异片段，回收方法参照其说明书。随后进行克隆，克隆步骤参照 Sambrook 等（1989）的方
法进行。克隆后由南京金斯特公司进行测序。
1.6 EST-SSR 多态性检测及数据统计
从扩增结果较好的引物中挑选效果最好的 20 对引物进行杏与梅的 DNA 指纹分析，反应条件及
反应程序同引物筛选部分，不同引物对的最适退火温度见表 4 所示。
根据电泳结果，在相同迁移位置有带的记为 1，无带的记为 0，建立 0、1 矩阵。利用 Popgen32
软件计算样品的遗传相似度（Genetic similarity，GS）和遗传距离（Genetic distance，GD），并以此
进行聚类分析构建聚类树，最终利用 treeview 软件绘制聚类图。
2 结果与分析
2.1 杏 EST-SSRs 分布、频率和特点
从 NCBI 的 EST 数据库下载的 15 387 条 EST，经过拼接、EST 查找后，共得到含有 EST 位点
的序列 1 073 条，占全部 EST 的 6.97%，发现 SSR 位点 1 353 个，SSR 位点的出现频率为 8.79%。
其中，只含有 1 个 SSR 位点的序列为 868 条，含有 1 个以上 SSR 位点的序列有 205 条，说明杏 EST
序列中 SSR 数量较为丰富。
在检测出的 1 353 个 SSR 位点中，二至六核苷酸重复都有出现，各自出现的频率有所不同（表
2 和表 3），二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复单元的位点分别有 318、525、
317、85 和 108 个。在含有二核苷酸重复单元的杏 EST 序列中，AG/CT 基序出现频率最高（71.07%），
三核苷酸重复单元中，AAG/CCT 基序出现频率最高（23.34%），四核苷酸重复单元中，AAAT/ATTT
基序出现频率最高（23.30%）。五核苷酸重复基序共有 40 种，出现频率最高的为 AAAAT/ATTTT，
共出现 20 次；六核苷酸重复基序共有 72 种，出现频率最高的为 AAAAAG/CTTTTT，共出现 9 次，
其余类型出现次数较低。

1 期 上官凌飞等：杏 EST-SSR 标记的开发 47

表 2 杏中 EST-SSR 的数量和频率
Table 2 EST-SSR number and frequency in apricot
重复类型
Repeat types
数量
Number
频率/%
Frequency
二核苷酸 Dinucleotide 318 23.50
三核苷酸 Trinucleotide 525 38.80
四核苷酸 Tetranucleotide 317 23.43
五核苷酸 Pentanucleotide 85 6.28
六核苷酸 Hexanucleotide 108 7.98
总计 Total 1 353 100.00
注：频率 = 重复类型数量/总数。
Note：Frequency = Repeat type numbers/ total numbers.

表 3 杏 EST 中主要重复基元及其频率
Table 3 The major motifs and their frequency in apricot ESTs
重复类型 Repeat types 重复基元 Motifs 数量 Number
各重复类型总数
Total number of each
repeat type
频率/%
Frequency
二核苷酸 Dinucleotide AC/GT 29 9.12
AG/CT 226 71.07
AT/AT 63
318
19.81
三核苷酸 Trinucleotide AAC/GTT 41 7.81
AAG/CTT 151 28.76
AAT/ATT 33 6.29
ACC/GGT 57 10.86
ACG/CTG 45 8.57
ACT/ATG 29 5.52
AGC/CGT 44 8.38
AGG/CCT 55 10.48
AGT/ATC 54 10.29
CCG/CGG 16
525
3.05
四核苷酸 Tetranucleotide AAAC/GTTT 26 317 8.20
AAAG/CTTT 52 16.40
AAAT/ATTT 74 23.34
AACC/GGTT 7 2.21
AACG/CTTG 12 3.79
AAGC/CGTT 5 1.58
AAGG/CCTT 7 2.21
AAGT/ATTC 8 2.52
AATC/AGTT 7 2.21
AATG/ACTT 6 1.89
AATT/AATT 13 4.10
ACAG/CTGT 7 2.21
ACAT/ATGT 15 4.73
ACCC/GGGT 4 1.26
ACCG/CTGG 1 0.32
ACCT/ATGG 6 1.89
ACGG/CCTG 6 1.89
ACGT/ATGC 7 2.21
ACTC/AGTG 7 2.21
ACTG/ACTG 2 0.63
AGAT/ATCT 1 0.32
AGCC/CGGT 1 0.32
AGCG/CGCT 2 0.63
AGCT/ATCG 21 6.62
AGGG/CCCT 9 2.84
AGGT/ATCC 10 3.15
CCCG/CGGG 1 0.32
48 园 艺 学 报 38 卷
2.2 EST-SSR 引物的扩增结果
为检测发掘出的 EST-SSR 标记的可利用性，随机挑选了 50 条符合筛选条件的 EST 序列设计了
50 对引物。利用‘红杏’、‘冀光’、‘马串铃’和‘早红’4 个杏品种的 DNA 为模板进行 PCR 扩增，
筛选出能在杏中成功 PCR 扩增的引物及其最适 PCR 退火温度。40 对引物能产生理想的 PCR 产物，
并且 25 对引物的 DNA 指纹具有多态性。引物有效扩增率为 80%，其中多态性占 62.5%，说明利用
杏 EST 序列开发 EST-SSR 标记是高效与可行的。
2.3 EST-SSR 的 PCR 产物特点
随机从 7 对引物的 PAGE 电泳凝胶上回收了 21 条杏的片段和 4 条梅的片段，并进行了测序。
结果（表 4）发现，同一引物在不同品种中的扩增具有一致性，如 4 号和 5 号片段是引物 EST-SSR10
在‘牛角黄’和‘大丰’上扩增出来的同样大小片段。而同一引物在同一品种上扩增的不同位置的
片段也具有相似性，如 15、16、17 号片段都是引物 EST-SSR36 在‘巴斗’上扩增的不同位置上的
片段，它们仅仅是 SSR 位点重复单元的重复次数不同而已。
表 4 序列片段信息
Table 4 Information of sequence fragments
片 段 编
号
Fragment
No.
引物编号
Primer No.
模板序列重复单元
Form sequence repeat
motif
预测产物大小/bp
Expected product
片段大小/bp
Fragment
Size
片段重复单元
Fragment repeat
motif
来源品种
Original varieties
GenBank 编号
GenBank No.
1 EST-SSR2 (AT)16 263 263 无 No 大接杏 Dajiexing GU233467
2 240 无 No 大接杏 Dajiexing GU233468
3 212 无 No 大接杏 Dajiexing GU233469
4 EST-SSR10 (ATC)7 278 436 无 No 牛角黄 Niujiaohuang GU233470
5 436 无 No 大丰 Dafeng GU233471
6 277 无 No 牛角黄 Niujiaohuang GU233472
7 EST-SSR16 (GAA)8 265 264 (GAA) 红杏 Hongxing GU233473
8 264 (GAA)8 桃杏 Taoxing GU233474
9 248 (GAA)3 红杏 Hongxing GU233475
10 264 (GAA)9 早花梅 Zaohuamei GU233476
11 247 (GAA)3 早花梅 Zaohuamei GU233477
12 EST-SSR21 (CTTT)5 284 363 (CTTT)4 白杏 Baixing GU233478
13 290 (CTTT)3 白杏 Baixing GU233479
14 283 (CTTT)2 白杏 Baixing GU233480
15 EST-SSR36 (CGATC)4 331 331 (CGATC)4 巴斗 Badou GU233481
16 326 (CGATC)3 巴斗 Badou GU233482
17 321 (CGATC)2 巴斗 Badou GU233483
18 EST-SSR42 (TGC)4 212 254 无 No 木牙格杏 Muyagexing GU233484
19 212 无 No 木牙格杏 Muyagexing GU233485
20 146 无 No 木牙格杏 Muyagexing GU233486
21 EST-SSR49 (AGCT)3… 234 234 (CAG)8 马串铃 Machuanling GU233487
22 (CT）6…(CAG)8 228 (CAG)6 马串铃 Machuanling GU233488
23 219 (CAG)3 马串铃 Machuanling GU233489
24 234 (CAG)8 久观朱砂 Jiuguan Zhusha GU233490
25 228 (CAG)6 久观朱砂 Jiuguan Zhusha GU233491

1 期 上官凌飞等：杏 EST-SSR 标记的开发 49

同时，发现在 21 条杏的片段中共有 4 对引物的 12 条片段含有目标 SSR 位点，3 对引物的 9 条
片段不含预期 SSR 位点序列。可以说，所开发的所有 EST-SSR 标记中有部分不属于 SSR 标记。其
中前者对应的所开发的 SSR 引物是可以应用于杏基因组 DNA 指纹分析的理想的引物；后者说明设
计的 SSR 引物的 EST 序列在不同品种间保守性低，不是在不同品种的基因组上普遍存在的 SSR 位
点序列，也可能是由于基因组上的对应序列含有内含子而不具备 SSR 序列的特征。将 9 条不含有
SSR 位点的序列进行了蛋白质翻译后，发现其中有存在多个终止子的现象。在此测序研究结果的基
础上进一步推算杏 EST-SSR 标记的开发效率为 3.98%。而从两对引物的 4 条梅的片段测序结果中发
现，理想 SSR 引物在梅上同样能扩增出相应产物。
2.4 EST-SSR 标记的多态性及其在梅中的转化率
挑选扩增效果最好的 20 对引物（表 5 所示）对 24 个杏品种，16 个花梅和 8 个果梅品种进行
PCR 扩增，图 1 为引物 ETS-SSR21 得到的扩增图谱。在杏中得到扩增产物的 20 对 SSR 引物中，仅
EST-SSR4、EST-SSR10 两对引物在梅中不能有效扩增，引物在梅中的转化率达到 90%，说明其通用
性较高。

表 5 20 对多态引物信息表
Table 5 Information of 20 primers developed from EST of apricot
引物编号
Primer No.
引物序列
Primer sequences(5′→3′)
重复单元
Repeat motif
Tm/℃
预测产物
大小/bp
Expected
product
扩增带数
No. of
bands
多态性带数
Number of
polymorphic
bands
多态率/%
Percentage of
polymorphism
AGCTCGCAAACCCTGTAAAA (AT)16 52.8 263 3 2 66.7 EST-SSR2
GCTGGTCTGAGTTCGAGGAC
ATTTCTCCTCCCGCTACCAT (GA)11…(GTG)4 50.8 267 2 2 100.0 EST-SSR4
ATTGGTAGGCTGTGGTGGTG
TTCGTATCAGATGGCTGCTG (AT)19…(GCT)7 51.7 240 4 4 100.0 EST-SSR6
CAAACCCATGAAACCCAAAC
CTTTGAATCTGGAGGCAAGC (CT)14 51.7 254 3 2 66.7 EST-SSR8
ATAGGGCCTCCACTTCACCT
TCTACCCTCGCAATGCTTCT (ATC)7 50.8 278 3 3 100.0 EST-SSR10
GTGCAACCCCTGCTATGACT
AGAGCGACCACCACCATTAC (GAA)8 54.1 265 4 3 75.0 EST-SSR16
CAGTGGACCTCGATCACCTT
CTCGGAGTCGTCAAAACACA (CTTT)5 51.7 284 3 3 100.0 EST-SSR21
AAGCTCGCAATTTGCAAAGT
TGGTGTCTGGGAAACCTCTC (GAG)8…(TTTAA)4… 50.2 160 3 3 100.0 EST-SSR22
ATACGGCACTGACATGGTCA (TGAG)3
TGCGGCTTTAAGCTTTGATT (AAAAG)5 50.8 229 1 1 100.0 EST-SSR25
CAAGTTCATCAGCAAAGCCA
TCTACAGAGGGCGTTGAACC (CATCA)4 50.0 159 6 4 66.7 EST-SSR26
AAGGTTTCACCACAAGCCAC
TGGTATACGTGGGACGGAAT (GTTCA)4 51.7 318 6 6 100.0 EST-SSR31
ACGATCCCTTGTACGCTTTG
CTTCTGCGGGAAAACAAGAG (CGATC)4 50.8 331 6 6 100.0 EST-SSR36
GAACTTGCCATCACTGCAGA
EST-SSR37 CGAGCAGCAACAAAAACAAA (TC)8…(CTCTCC)3… 51.7 305 1 1 100.0
AGGAGCAGAAGTTCAGCCAA (ACAGCA)4

50 园 艺 学 报 38 卷
续表 5
引物编号
Primer No.
引物序列
Primer sequences(5′→3′)
重复单元
Repeat motif
Tm/℃
预测产物
大小/bp
Expected
product
扩增带数
No. of
bands
多态性带数
Number of
polymorphic
bands
多态率/%
Percentage of
polymorphism
EST-SSR39 TTTCCTCTCTCCCCCTCAAT (GAAATC)4 58.8 258 2 2 100.0
CAACGACGCAGAACTTGTGT
EST-SSR40 GCCACTAGGCCCAGTTCATA (AAT)7…(AGCTTG)5… 56.7 234 5 5 100.0
CAAGTCTGCCACGTGGTCTA (TGC)4
EST-SSR42 GCTCGCTTCCAGGTGACTAC (TGC)4 50.8 212 3 1 33.3
CCTTCTCCTTTGGCTCACTG
EST-SSR46 GGGTCGTCTGAGCAAGTCTC (ATC)4…(TGAG)4… 56.7 256 5 4 80.0
TGTTGCCATTTCTCCTCCTC (GA)7
EST-SSR47 GGCGGTCCAGATACTGAAAA (AAATA)3…(AAAT)3 51.7 220 3 2 66.7
TGGTGACGATGTAGGGGATT
EST-SSR48 CTTGAAAGCAGCCATTGTCA (GA)6…(AG)9… 51.7 221 4 2 50.0
CACGAGGGGATGCAGACTAT (AGCT)3
EST-SSR49 TTACATGCCTTACGCTGCTG (CT)6…(CAG)8 55.4 234 6 6 100.0
CTTCATGGATGCTTTGCTCA
总计 Total 73 62 84.9

同时，随机测序的 4 条梅的 PCR 片段中都含有相应的 SSR 位点，与同样引物扩增的杏的片段
的序列所含有的 SSR 位点相同。进一步说明了杏 EST-SSR 引物能够用于梅基因组 DNA 的扩增，且
扩增出相似的 SSR 位点序列，反映了来源杏的 EST-SSR 引物在梅上的通用性。


图 1 引物 EST-SSR21 在杏（1 ~ 24）和梅（25 ~ 32 果梅，33 ~ 48 花梅）不同品种间的多态性
Fig. 1 Polymorphisms showed in different apricot（1–24）and mei（25–32 fruit-mei，33–48 flower-mei）
cultivars by primer EST-SSR21

2.5 遗传多样性分析
用 20 对引物对 24 个杏品种、8 个果梅品种、16 个花梅品种进行遗传多样性分析。共扩增出 73
条条带，其中多态性条带 62 条，多态率为 84.93%，平均每对引物扩增 3.65 条谱带。
从聚类图（图 2）中可以看出，杏与梅被分成两大亚群，两个树种的遗传差异很明显，说明杏
与梅是完全不同的两个物种。在 24 个杏的品种中，来自甘肃的大接杏和红杏被聚在一起，并与来自
陕西兰珠红、临潼红杏、临潼红杏 2 号、牛角帮子聚成一个小的类群，在一定程度上反映了这些地
理来源杏品种遗传上的亲缘性。根据 24 个梅品种的聚类分析结果发现果梅和花梅并没有形成不同的
两类，而是相互混杂聚类。说明了两者遗传上的一致性，有别于园艺学以及实际应用中进行的果梅
和花梅的划分。
1 期 上官凌飞等：杏 EST-SSR 标记的开发 51

图 2 杏和梅品种基于 SSR 扩增产物的聚类图
1 ~ 48 见表 1。
Fig. 2 Dendrogram of apricot and mei varieties based on the SSR data
1–48 see Table 1.
3 讨论
随着 EST 和 cDNA 大规模测序的进展，NCBI 的 EST 数据库容量正以一个惊人的速度在增长，
人们相继在多种植物中开始进行 EST-SSR 引物的开发与利用研究（Eujayl et al.，2002；Gao et al.，
2003；Gupta et al.，2003；Chen et al.，2005；安泽伟 等，2009）。据报道，Kantety 等（2002）在水
稻中发现的 SSR 频率为 4.7%，忻雅等（2006）在白菜中发现 SSR 频率为 10.34%，水稻与甘蔗分别
有 3%和 2.9%的 ESTs 含有 SSR（Cho et al.，2000；Cordeiro et al.，2001）位点，桃与扁桃中可设计
出SSR引物的ESTs占4.1%（Jung et al.，2005）。作者在研究中发现杏候选SSR位点出现频率为8.79%，
低于白菜 ESTs 中发现 SSR 的频率，高于桃与扁桃。出现这种情况的原因可能是由于采用 SSR 查找
程序所采用的标准、可利用的 EST 数据库中的数据信息量以及 ESTs 品种与组织器官来源等方面的
不同所造成的。随着 EST 数据库的容量不断增大，各个物种间的 SSR 频率比较将有一个统一的标
准。事实上，就单一树种而言，EST-SSR 的开发数量的理想程度是相对于实际研究与利用的需要言
的。而在杏上发掘的 SSR 位点中，尽管二核苷酸（23.50%）、三核苷酸（38.80%）和四核苷酸（23.43%）
重复占主导地位，但是三核苷酸的重复频率最高，这点与国外一些学者的研究结果观点相同（Cardle
52 园 艺 学 报 38 卷
et al.，2000；Kota et al.，2001；Kantety et al.，2002）。而在二核苷酸和三核苷酸重复单元中，出现
频率最高的基序分别为 AG/CT（71.07%）和 AAG/CCT（23.34%）。与 Gupta 等（1996）的研究观点
相似，但与 Powell 等（1996）认为植物中二核苷酸主要重复类型是（AT）n 的观点有所差别。
在设计的 50 对 SSR 引物中，共有 25 对引物的 PCR 能够扩增出理想的产物，占设计的总引物
的 50%。这是由于用于部分引物设计的 EST 序列对应的基因组序列上可能含有内含子而引起引物间
序列过长或引物无法与模板 DNA 互补配对而使 PCR 无法正常扩增。不过，引物的设计质量也可能
是影响因素之一。作者在对随机回收克隆的 21 条杏扩增产物片段分析中发现，在杏中有的扩增条带
存在 SSR 位点，而有的引物扩增出的谱带不存在 SSR 位点，SSR 位点的含有比例为 57.1%。根据测
序的结果推算杏 EST 序列的 SSR 引物开发率为 3.98%。序列不含有 SSR 位点的原因可能是因为设
计的 SSR 引物的 EST 序列在不同品种间保守性低，不是在不同品种的基因组上普遍存在的 SSR 位
点序列，也可能是由于基因组上的对应序列含有内含子而不具备 SSR 序列的特征。对 4 条梅的 PCR
扩增出谱带进行测序的结果发现，理想的 SSR 引物在梅上同样扩增出相应的 PCR 产物。
Scott 等（2000）研究发现开发的葡萄 EST-SSR 引物通用性为 50%，Decroocp 等（2003）研究
发现所开发的葡萄 EST-SSR 在葡萄科不同种属间具有较高通用性而杏 EST-SSR 只适用于与它相近
的李亚科，忻雅等（2005）发现在对白菜 DNA 能扩增出产物的 18 对引物中，对油菜完全可用，通
用率为 100%。本研究中使用的 20 对在杏中都能得到扩增的 EST-SSR 引物在梅中仅有两对引物不能
得到扩增，据此推算杏的 EST-SSR 引物在梅中的转化率为 90%。说明设计的这些杏 EST-SSR 引物
通用性还是比较高的，也符合 EST-SSR 引物通用性较高的报道。
从遗传聚类分析结果发现，杏和梅是遗传差异明显的两种植物，这与 Fang 等（2006）利用 AFLP
标记分析的结果相一致。而果梅与花梅在遗传上是不能分为两类的同一树种，它们仅是同种植物的
不同类型，Kyohei 等（2008）等的研究结果也说明了同样的现象。

References
An Ze-wei，Zhao Yan-hong，Cheng Han，Li Wei-guo，Huang Hua-sun. 2009. Development and application of EST-SSR markers in Hevea brasiliensis
Muell. Arg. Hereditas，31 (3)：311–319. (in Chinese)
安泽伟，赵彦宏，程 汉，李维国，黄华孙. 2009. 橡胶树 EST-SSR 标记的开发与应用. 遗传，31 (3)：311–319.
Bassam B J，Caetano-Anolles G，Gresshoff P M. 1991. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry，
196：80–83.
Cai Sheng-wen，Sun Hao-yuan，Yang Li，Wang Yu-zhu，Lu Bing-she. 2008. Optimization of SSR-PCR reaction system of apricot distant hybrids.
Chinese Agricultural Science Bulletin，24 (7)：50–54. (in Chinese)
蔡胜文，孙浩元，杨 丽，王玉柱，路丙社. 2008. 仁用杏远缘杂交后代 SSR-PCR 反应体系的优化. 中国农学通报，24 (7)：50–54.
Cardle L，Ramsay L，Milbourne D，Macaulay M，Marshall D，Waugh R. 2000. Computational and experimental characterization of physically
clustered simple sequence repeats in plants. Genetics，156：847–854.
Chen H M，Li L Z，Wei X Y，Li S S，Lei T D，Hu H Z，Wang H G，Zhang X S. 2005. Development，chromosome location and genetic mapping
of EST-SSR markers in wheat. Chinese Science Bulletin，50 (20)：2328–2336.
Chen Jun-fang，Ren Zheng-long，Gao Li-feng，Jia Ji-zeng. 2005. Developing new SSR markers from EST of wheat. Acta Agronmica Sinica，31 (2)：
154–158. (in Chinese)
陈军方，任正隆，高丽锋，贾继增. 2005. 从小麦 EST 序列中开发新的 SSR 引物. 作物学报，31 (2)：154–158.
Cho Y G，Ishii T，Temnykh S，Chen X，Lipovich L，McCouch S R，Park W D，Ayres N，Cartinhour S. 2000. Diversity of microsatellites derived
from genomic libraries and GenBank sequences in rice（Oryza sativa L.）. Theoretical and Applied Genetics，100：713–722.
Chu Meng-yuan. 1999. Chinese fruit monograph-mei. Beijing：China Forestry Publishing House. (in Chinese)
1 期 上官凌飞等：杏 EST-SSR 标记的开发 53

褚孟嫄. 1999. 中国果树志 · 梅卷. 北京：中国林业出版社.
Cordeiro G M，Casu R E，McIntyre C L，Manners J M，Henry R J. 2001. Microsatellite markers from sugarcane（Saccharum spp.）ESTs cross
transferable to erianthus and sorghum. Plant Science，160：1115–1123.
Decroocq V，FaveM G，Hagen L，Bordenave L，Decroocq S. 2003. Development and transfer ability of apricot and grape EST microsatellite markers
across taxa. Theoretical and Applied Genetics，106 (5)：912–922.
Decroocq V，Hagen L S，Favé M G，Eyquard J P，Pierronnet A. 2004. Microsatellite markers in the hexaploid Prunus domestica species and
parentage lineage of three European plum cultivars using nuclear and chloroplast simple-sequence repeats. Molecular Breeding，13：135–142.
Doyle J J，Doyle J L. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Photochemical Bulletin，19：11–15.
Eujayl I，Sorrells M E，Baum M，Wolters P，Powell W. 2002. Isolation of EST-derived microsatellite markers for genotyping the A and B genomes
of wheat. Theoretical and Applied Genetics，104：399–407.
Fang J，Tao J，Chao C T. 2006. The genetic diversity of mei，apricot，plum，and peach revealed by AFLP. The Journal of Horticultural Sciences &
Biotechnology，81：898–902.
Gao L F，Tang J F，Li H W，Jia J Z. 2003. Analysis of microsatellites in major crops assessed by computational and experimental approaches.
Molecular Breeding，12：245–261.
Gupta P K，Balyan H S，Sharma P C，Ramesh B. 1996. Microsatellites in plants：A new class of molecular markers. Current Science，70 (1)：
45–54.
Gupta P K，Rustgi S，Sharma S，Singh R，Kumar N，Balyan H S. 2003. Transferable EST-SSR markers for the study of polymorphism and genetic
diversity in bread wheat. Molecular Genetics and Genomics，270：315–323.
Hagen L S，Khadari B，Lambert P，Audergon J M. 2002. Genetic diversity in apricot revealed by AFLP markers：Species and cultivar comparisons.
Theor Appl Genet，105：298–305.
He Tian-ming，Chen Xue-sen，Gao Jiang-sheng，Zhang Da-hai，Xu Lin，Wu Yan. 2006. Using SSR markers to study population genetic structure
of cultivated apricots native to Xinjiang. Acta Horticulturae Sinica，33 (4)：809–812. (in Chinese)
何天明，陈学森，高疆生，张大海，徐 麟，吴 燕. 2006. 新疆栽培杏群体遗传结构的 SSR 分析. 园艺学报，33 (4)：809–812.
Hurtado M A，Westman A，Beck E，Abbott G A，Llácer G，Badenes M L. 2002. Genetic diversity in apricot cultivars based on AFLP markers.
Euphytica，127：297–301.
Jia Xiao-ping，Shi Yun-su，Song Yan-cun，Wang Guo-ying，Wang Tian-yu，Li Yu. 2007. Development of EST-SSR in foxtail millet（Setaria italica）.
Genetic Resources and Crop Evolution，54：233–236.
Jung S，Abbott A，Jesudural C，Tomkins J，Main D. 2005. Frequency，type，distribution and annotation of simple sequence repeats in Rosaceae
ESTs. Functional & Integrative Genomics，5：136–143.
Kantety R V，Rota M L，Matthews D E，Sorrells M E. 2002. Data mining for simple sequence repeats in expressed sequence tags from barley maize，
rice，sorghum and wheat. Plant Molecular Biology，48：501–510.
Kota R，Varshney R K，Thiel T，Dehmer K J，Graner A. 2001. Generation and comparison of EST-derived SSRs and SNPs in berley（Hordeum
vulgare L.）. Hereditas，135 (2–3)：145–151.
Kyohei H，Ko S，Hideaki Y，Masami Y，Hiroyuki I，Toshiya Y. 2008. Genetic diversity in fruiting and flower-ornamental Japanese apricot（Prunus
mume）germplasms assessed by SSR markers. Breeding Science，58：401–410.
Poncet V，Rondeau M，Tranchant C，Cayrel A，Hamon S，Kochko A，Hamon P. 2006. SSR mining in coffee tree EST databases：Potential use of
EST-SSRs as markers for the Coffea genus. Molecular Genetics and Genomics，276：436–449.
Powell W，Machray G C，Provan J. 1996. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trends in Plant Science，1 (7)：215–222 .
Rassmann K，Schlötterer C，Tautz D. 1991. Isolation of simple sequence loci for use in polymerase chain reaction-based DNA fingerprinting.
Electrophoresis，12 (2–3)：113–118.
Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T. 1989. Molecular cloning. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press.
54 园 艺 学 报 38 卷
Scott K D，Eggler P，Seaton G，Rossetto M，Ablett E M，Lee L S，Henry R J. 2000. Analysis of SSRs derived from grape ESTs. Theoretical and
Applied Genetics，(100)：723–726.
Tautz D，Schlötterer C. 1994. Simple sequences. Current Opinion in Genetics & Development，4 (6)：832–837.
Varshney R K，Graner A，Sorrells M E. 2005. Genic microsatellite markers in plants：Features and applications. trends in Biotechnology，23 (1)：
48–55.
Wang Hua-kun，Tao Jian-min，Qu Shen-chun，Fang Jing-gui，Ma Rui-juan，Zhang Zhen，Lou Xiao-ming. 2010. Molecular evolution and phylogeny
of stone fruit trees based on sequences of the internal transcribed spacers（its）of nuclear ribosomal DNA. Acta Horticulturae Sinica，37 (3)：
363–374. (in Chinese)
王化坤，陶建敏，渠慎春，房经贵，马瑞娟，章 镇，娄晓鸣. 2010. 核果类果树 ITS 序列分子进化及系统发育关系研究. 园艺学报，
37 (3)：363–374.
Wang Jing-yi，Chen Ye-yuan，Liu Wei-liang，Wu Yao-ting. 2008. Development and application of EST-derived SSR markers for bananas（Musa nana
Lour.）. Hereditas，30 (7)：933–940. (in Chinese)
王静毅，陈业渊，刘伟良，武耀廷. 2008. 香蕉 EST-SSRs 标记的开发与利用. 遗传，30 (7)：933–940.
Wang Yu-zhu，Sun Hao-yuan，Yang Li，Zhang Kai-chun，Lin Ke. 2006. Study on the phylogenetic relationship among genus armeniaca based on
RAPD markers. Chinese Agricultural Science Bulletin，22 (5)：53–56. (in Chinese)
王玉柱，孙浩元，杨 丽，张开春，林 柯. 2006. 杏属植物种间亲缘关系的 RAPD 分析. 中国农学通报，22 (5)：53–56.
Xin Ya，Cui Hai-rui，Zhang Ming-long，Lim Yong-pyo，Choi Suiyun. 2005. Development of EST（expressed sequence tags）marker in Chinese
cabbage and its transferability to rapeseed. Hereditas，27 (3)：410–416. (in Chinese)
忻 雅，崔海瑞，张明龙，林容杓，崔水莲. 2005. 白菜的 EST 标记及其对油菜的通用性. 遗传，27 (3)：410–416.
Xin Ya，Cui Hai-rui，Lu Mei-zhen，Yao Yan-ling，Jin Ji-qiang，Lim Yong-pyo，Choi Suiyun. 2006. Data mining for SSRs in ESTs and EST-SSR
marker development in Chinese cabbage. Acta Horticulturae Sinica，33 (3)：549–554. (in Chinese)
忻 雅，崔海瑞，卢美贞，姚艳玲，金基强，林容杓，崔水莲. 2006. 白菜 EST-SSR 信息分析与标记的建立. 园艺学报，33 (3)：
549–554.
Yu J K，Rota M L，Kantety R V，Sorrells M E. 2004. EST derived SSR markers for comparative mapping in wheat and rice. Molecular Genetics and
Genomics，271：742–751.
Yuan Zhao-he，Chen Xue-sen，Zhang Chun-yu，He Tian-ming，Feng Jian-rong，Feng Tao. 2008. Population genetic structure in apricot（Armeniaca
Mill.）revealed by fluorescent-AFLP markers. Acta Horticulturae Sinica，35 (3)：319–328. (in Chinese)
苑兆和，陈学森，张春雨，何天明，冯建荣，冯 涛. 2008. 普通杏群体遗传结构的荧光 AFLP 分析. 园艺学报，35 (3)：319–328.
Zhang Jia-yan，Zhang Zhao. 2003. Chinese fruit monograph-apricot. Beijing：China Forestry Publishing House. (in Chinese)
张加延，张 钊. 2003. 中国果树志·杏卷. 北京：中国林业出版社.
Zhang Shu-qing，Liu Dong-cheng，Liu Wei-sheng，Zhang Ai-min，Li Shao-hua. 2010. Analysis of genetic diversities in apricot cultivars（Prunus
armeniaca L.）with simple sequence repeat（SSR）markers. Acta Horticulturae Sinica，37 (1)：23–30. (in Chinese)
张淑青，刘冬成，刘威生，张爱民，李绍华. 2010. 普通杏品种 SSR 遗传多样性分析. 园艺学报，37 (1)：23–30.
Zhebentyayeva T N，Reighard G L，Gorina V M，Abbott A G. 2003. Simple sequence repeat（SSR）analysis for assessment of genetic variability in
apricot germplasm. Theoretical and Applied Genetics，106：435–444.
Zhou Yan-qing. 2005. The application of DNA molecular markers in plant research. Beijing：Chemical Industry Press. (in Chinese)
周延清. 2005. DNA 分子标记技术在植物研究中的应用. 北京：化学工业出版社.