全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（6）：1073–1080 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–02–05；修回日期：2012–05–11
基金项目：国家自然科学基金项目（31040006）；国家科技支撑计划项目（2008BAD95B07，2011BAD32B03）；北京市自然科学基金委
和北京市教委联合资助重点项目（KZ200910020001）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：gsfmn@tom.com）
葡萄果实 β–葡萄糖苷酶基因克隆、原核表达及
活性检测
董银行，郭家选*
（北京农学院植物科学技术学院，农业应用新技术北京市重点实验室，北京 102206）
摘 要：以‘玫瑰香’葡萄着色期的果肉为试材，通过反转录技术克隆了 ABA 合成相关酶 β–葡萄
糖苷酶基因 VvBG1 的 1 518 bp 编码区核苷酸序列，其编码 1 个含有 505 氨基酸的多肽。生物信息学分析
表明，VvBG1 含有 1 个跨膜区和糖基水解酶 1 超家族保守域。通过 BamHⅠ和 XhoⅠ限制性内切酶将除
去信号的编码区克隆到原核表达载体 pET28a（+）中，并转化大肠杆菌表达菌株 BL21（DE3），成功诱导
并纯化了 VvBG1 融合蛋白。经过透析复性和超滤浓缩得到了 0.8 mg · mL-1 可溶的融合蛋白。通过纯化蛋
白葡萄果肉均浆液孵育试验和 GC–MS ABA 含量分析证实了葡萄果实中 β–葡萄糖苷酶 VvBG1 具有较
高的生理活性。
关键词：葡萄；果实；β–葡萄糖苷酶 1；脱落酸；基因；克隆；原核表达
中图分类号：S 663.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）06-1073-08

Cloning，Procaryotic Expression and Activity Analysis of Grape Berry
β-glucosidase Gene
DONG Yin-hang and GUO Jia-xuan*
（Beijing Key Laboratory for Agricultural Application and New Technique；College of Plant Science and Technology，
Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China）
Abstract：To explore the activity of β-glucosidase（VvBG1）in grape berries，in the present study，
VvBG1 gene was first cloned through reverse transcription technique from mesocarp during Hamburg
grape berry red-coloring stages. The 1 518 bp sequences encoded a polypeptide with 505 amino acids.
Bioinformatics analysis showed that VvBG1 contains both a putative transmembrane region and a glycosyl
hydrolase1 superfamily domain. The coding sequence after remove of its signal coding region was cloned
into prokaryotic expression vector pET28a（+）and then transformed into E. coli strain BL21（DE3）by
restriction endonucleases BamHⅠand XhoⅠ. The recombinant strains were successfully induced to
express fusion protein and permitted to purify the VvBG1 protein. A 0.8 mg · mL-1 of soluble protein
solution was obtained after dialysis and ultrafiltration. The results gained from a combination of purified
protein incubation experiment using grape berry pulp and abscisic acid（ABA）content analysis by GC-MS
demonstrated that the grape berry β-glucosidase VvBG1 is of high physiological activity.

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Key words：grape；berry；β-glucosidase 1；ABA；gene；cloning；procaryotic expression

葡萄不仅具有重要的经济价值，而且是研究非呼吸跃变型果实理想的材料。脱落酸（abscisic
acid，ABA）被认为在葡萄果实成熟过程中起着关键的作用（Coombe，1992）。ABA 合成研究受到
了广泛的关注并取得了很大的进展。
高等植物 ABA 生物合成路径中的主要步骤合成酶都已经阐明（Qin & Zeevaart，1999；Nambara
& Marion-poll，2005），主要包括玉米黄质环化酶（zeaxanhtin epoxidase，ZEP），9–顺式–环氧类
胡萝卜素双氧合酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED），短链乙醇脱氢酶（a short-chain
dehydrogenase/reductase，ABA2），ABA 醛氧化酶（ABA aldehydeoxidase，AAO3）和钼辅硫化酶
（molybdenum cofactorsulfurase，MCSU），其中 NCED（EC 1.13.11.52）是 ABA 生物合成的限速酶
（任杰 等，2010；朱海生 等，2012）。
近年来研究发现，拟南芥中 β–葡萄糖苷酶 AtBG1（β-glucosidase，EC 3.2.1.21）响应环境和发
育信号促进了活性 ABA 的快速积累，即通过把无活性的结合态 ABA 葡萄糖苷（ABA-GE）直接转
化为有活性游离的 ABA（Lee et al.，2006）。王延书等（2010）以始熟期花后 7 ~ 11 周的玫瑰香葡
萄果肉为试材，利用荧光定量 PCR 分析了 VvNCED1 和 VvBG1 在 5 个时期的表达量，研究发现
VvNCED1 在花后第 7 ~ 8 周表达量很高，随后快速降低至最低值，随着果实着色，表达量略有升高；
VvBG1 基因在果实始熟前表达量较低，随着果实始熟启动和果实着色，表达量基本呈持续升高的趋
势，始熟后 ABA 的积累主要归因于 VvBG1 的高水平表达。当玫瑰香葡萄果实中 ABA 水平达到高
峰时，部分游离 ABA 将以 ABA-GE 形式储藏起来（Sun et al.，2010）。Li 等（2012）研究发现，在
西瓜果实发育的早期，ClBG1 表达水平相对较低，随着果实成熟，表达量快速增加。
综上所述，尽管前人通过基因转录分析揭示了 VvBG1 基因可能在果实成熟期起着重要的作用
（Sun et al.，2010；王延书 等，2010；Li et al.，2012），但果实中 VvBG1 蛋白酶活特点目前还不清
楚。为了检测果实中 β–葡萄糖苷酶的活性，本研究中以玫瑰香葡萄果肉为试材，将 VvBG1 转化大
肠杆菌表达并亲和层析纯化外源表达蛋白，通过葡萄果实匀浆液温育试验检测了 VvBG1 具有较高
的生理活性。该研究为从分子水平操纵葡萄果实成熟奠定研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
以玫瑰香葡萄（Vitis vinifera L.‘Muscat Hamburg’）果实采自在北京农学院葡萄种质资源圃。
2011 年在果实转红期（50%果面着色，于 8 月 5 日花后 70 d）取出果肉，液氮速冻于–80 ℃冰箱保
存备用。
大肠杆菌 DH5α、BL21（DE3）、DNA marker、pEASYTM-T1 Simple Cloning Kit 购自北京全式金
生物技术有限公司；pET28a（+）由本实验室保存；RNA 提取试剂盒购自北京博迈德生物科技有限
公司；限制性内切酶、反转录酶、DNA 酶、T4 DNA 连接酶、LA-Taq 酶均购自 TaKaRa 公司；引物
合成及测序均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 重组原核表达质粒构建及目的蛋白表达
根据本实验室克隆得到的 VvBG1（GenBank 登录号：GU480917）的 CDS 序列（去除信号肽序
列，预测网址 http：//www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/或 http：//genome. cbs. dtu. dk/services/TargetP/）
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设计原核表达基因全长引物（正义引物：5-GGATCCGAAAATATCACCAGAGGAAG-3和反义引物
5-CTCGAGGGGAGAATTCAAGAAGTTC-3，并分别在引物的 5端引入了 BamHⅠ和 XhoⅠ酶切位
点（下划线部分）。以葡萄果肉 cDNA 为模板，通过 PCR 克隆获得目的基因片段，连接 pEASYTM-T1
Simple 克隆载体后与 pET28a（+）载体用 BamHⅠ和 XhoⅠ限制性内切酶同时双酶切，用 T4 DNA
连接酶将 VvBG1 目的片段与 pET28a（+）载体连接形成 pET28a-BG1 重组表达质粒并转化 E. coli
DH5α感受态细胞，经菌落 PCR 筛选及序列测定后转化 E. coli BL21（DE3）表达菌株。挑取阳性转
化子于含有 50 μg · mL-1 硫酸卡那霉素的 LB 液体培养基 37 ℃，220 r · min-1 培养至 OD600 为 0.6 ~ 0.8
时，加入 1 mmol · L-1 IPTG 诱导表达 3 ~ 4 h。收集少量菌体超声破碎后，SDS-PAGE 鉴定蛋白表达。
1.3 融合蛋白纯化与复性
收集菌体于 50 mL 离心管中，按每克菌体鲜样质量加入 30 mL 洗涤缓冲液Ⅰ（50 mmol · L-1
Tris-Cl、2 mmol · L-1 EDTA，100 mmol · L-1 NaCl、0.5% triton X-100），用超声波破碎仪（宁波东芝
JY92-II）冰浴超声破碎（工作时间 5 s，间歇时间 5 s，60 次循环），8 000 r · min-1 离心 5 min 收集包
涵体，用洗涤缓冲液Ⅰ和洗涤缓冲液Ⅱ（50 mmol · L-1 Tris-Cl，100 mmol · L-1 NaCl）各洗涤 2 到 3
次，加入适量 8 mol · L-1 尿素，震荡混匀后 4 ℃溶解过夜。
将溶解后的蛋白于 4 ℃，13 000 × g 离心 30 min，收集上清用 0.45 μm 滤膜过滤后，过镍离子金
属螯合亲和层析柱，用 8 倍柱床体积的 Binding buffer （8 mol · L-1 尿素，20 mmol · L-1 Tris-Cl，pH 7.9，
5 mmol · L-1 咪唑，300 mmol · L-1 NaCl）洗涤，500 μL 依次收集的洗脱蛋白，收集总量为 2.5 mL Elution
buffer（8 mol · L-1 尿素，20 mmol · L-1 Tris-Cl，pH 7.9，300 mmol · L-1 咪唑，300 mmol · L-1 NaCl），
SDS-PAGE 分析依次收集纯化浓度及纯度。
纯化后的目的蛋白用 Elution buffer 稀释至 20 ~ 50 μg · mL-1，加入到截留分子量为 10 kD 的透
析袋中分别于下列透析液中冰浴震荡透析 5 ~ 8 h。透析液Ⅰ：6 mol · L-1 尿素， 50 mmol · L-1 Tris-Cl，
0.5 mmol · L-1 EDTA，50 mmol · L-1 NaCl，5 mmol · L-1 DTT，4 mmol · L-1 GSH，0.5 mmol · L-1 GSSH，
8%甘油，0.2% PEG 4000；透析液Ⅱ：2 mol · L-1 尿素，50 mmol · L-1 Tris-Cl，0.5 mmol · L-1 EDTA，
50 mmol · L-1 NaCl，5 mmol · L-1 DTT，4 mmol · L-1 GSH，0.5 mmol · L-1 GSSH，8%甘油，0.2% PEG
4000；透析液Ⅲ：50 mmol · L-1 Tris-Cl，0.5 mmol · L-1 EDTA，50 mmol · L-1 NaCl。收集透析袋中蛋
白溶液，用截留分子量为 10 kD 的超滤管超滤浓缩，BCA 法测定蛋白含量后，立即使用或加入 20%
甘油冻存于–20 ℃备用。
1.4 VvBG1 活性检测
取着色期葡萄果实（50%果面着色）为材料，去掉果皮和种子后，加入少许石英砂于研钵中研
磨至匀浆，分别称取 0.5 g 匀浆液置于 3 个 10 mL 的玻璃试管中。A 管加入 500 μL 无菌水，B 管加
入 500 μL 透析液Ⅲ，C 管加入 500 μL 复性蛋白液，轻轻吹打混匀，室温中孵育 1 h。分别加入铜试
剂以及适量预冷的 80%甲醇和 D3-ABA，4 ℃冰箱过夜，GC-MS 法测定各管中 ABA 含量（王延书 等，
2010）。
2 结果与分析
2.1 葡萄 β–葡萄糖苷酶基因片段的克隆
根据 GenBank 上已公布的拟南芥 β-glucosidase 基因序列通过 BLAST 比对得到一个类似葡萄
BG1 mRNA 序列，设计特异引物（正向引物：5-ATGGCGTTCGGAAGATTCATCG-3，反向引物：
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5-TTAGGGAGAATTCAAGAAGTTCTTAAACC-3），以玫瑰香葡萄果肉 cDNA 文库为模板，通过
RT-PCR技术克隆得到VvBG1的1 518 bp编码区核苷酸序列，其编码了505个氨基酸的多肽（GenBank
No. GU480917.1，图 1）。



图 1 葡萄果实中 VvBG1 核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
Fig. 1 The nucleotide and its deduced amino sequences of VvBG1 gene in grape berry

2.2 葡萄 β–葡萄糖苷酶基因生物信息学分析
基于 VvBG1 蛋白 NCBI BLAST（http：//blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi，）同源性序列分析表
明，VvBG1 与蓖麻（Ricinus communis，XP_002512097.1）、大豆（Glycine max，XP_003556662.1）、
杨树（Populus trichocarpa，XP_002311330.1）、拟南芥（Arabidopsis thaliana，NP_173978.1）、苜蓿
（Medicago truncatula，XP_003607794.1）、草莓（Fragaria × ananassa，gene04638 in https：//strawberry.
Plant and food. co. nz/index. html）、高粱（Sorghum bicolor，XP_002465651.1）和水稻（Oryza sativa，
AAK92581.1）的同源基因相似性较高，分别为 77%、76%、75%、75%、75%、74%、71%和 71%。
该序列推测蛋白含有一个葡萄糖基水解酶 1 家族保守序列（图 2），表明已成功克隆到了 VvBG1。


图 2 VvBG1 氨基酸保守序列
Fig. 2 The deduced conserved amino acid sequence of VvBG1
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葡萄与上述 8 种植物 BG1 蛋白质序列用 MEGA 4.1 软件采用邻接法（NJ）和 Bootstrap 的 1 000
次重复检测方法进行亲缘关系分析，结果表明在遗传进化上 BG1 主要分为单子叶和双子叶植物两大
类。在双子叶植物中，葡萄首先与蓖麻和杨树聚为一类，然后再与草莓，最后与拟南芥、大豆和苜
蓿聚为一类（图 3）。

图 3 葡萄与其他物种之间 β–葡萄糖苷酶 1 的聚类分析
节点旁数据为 1 000 次 bootstrap 检测后的置信度（%）。
Fig. 3 Phylogenetic analysis of BG1 in grapevine and other species homologues
The numbers at notes represent bootstrap values（%）with 1 000 replicate.

使用网络 DAS 服务器（http：//www. sbc. su. se/~miklos/DAS）对 VvBG1 蛋白序列进行跨膜结
构预测。在 strict cut-off 严格条件限制下，该蛋白分别在 8 ~ 18 氨基酸之间存在 1 个跨膜区域，推
测该序列为信号肽序列（图 4）。

图 4 DAS 服务器对葡萄中 VvBG1 氨基酸序列跨膜区域的预测
Fig. 4 Transmembrane domain of grapevine VvBG1 amino acid sequence predicted by DAS server
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2.3 VvBG1 原核表达载体的构建、表达及融合蛋白的纯化
根据信号肽预测（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）发现 VvBG1 信号肽断裂点位于 24 与
25 氨基酸之间，设计不含信号肽序列的原核表达引物。正义引物：5-GGATCCGAAAATATCA
CCAGAGGAAG-3，反义引物：5-CTCGAGGGGAGAATTCAAGAAGTTC-3，并分别在引物 5端引
入了 BamHⅠ和 XhoⅠ酶切位点（下划线部分）。将 PCR 扩增目的表达基因片段（图 5，A，白色箭
头），通过 BamHⅠ和 XhoⅠ限制性内切酶构建 pET28a-VvBG1 重组表达质粒（图 5，B，白色箭头），
然后转化 E. coli BL21（DE3）进行诱导表达。由图 6，A 中可以看出，随着诱导时间的增加，60 kD
融合蛋白表达量逐渐增加，至 3 ~ 4 h 达到最高值。通过 HIS 标签亲和层析得到融合蛋白含量高达
1.2 mg · mL-1，纯度在 90%以上（图 6，B）。
图 5 pET28a-VvBG1 载体构建
A：VvBG1 PCR 扩增产物（1、2：两个不带信号肽的扩增条带；M：分子量标准，DL2000）；
B：pET28a-VvBG1 酶切鉴定（1、2：两个重组质粒酶切条带；3：重组质粒；M：分子量标准，DL2000）。
Fig. 5 Construction of pET28a-VvBG1 vectors
A：PCR amplified products of VvBG1（1，2：Two PCR amplified bands without signaling peptide；M：Marker，DL2000）；
B：Identification of pET28a-VvBG1 using restriction endonucleases（1，2：Two digested bands；
3：One non-digested band；M：Marker，DL2000）.

图 6 IPTG 诱导蛋白表达及纯化
A：随时间的诱导表达（1. pET28a 空载体；2. 诱导 0 h；3. 诱导 1 h；4. 诱导 2 h；5. 诱导 3 h；6. 诱导 4 h。M：蛋白 Marker）；
B：表达蛋白洗脱纯化（1. 纯化前；2 ~ 6. 纯化 500 μL 依次收集的洗脱蛋白，浓度分别依次为
1.2、0.95、0.46、0.22、0.12、0.09 mg · mL-1。M：蛋白 Marker）。
Fig. 6 IPTG-induced expression and purification
A：Induced expression with time going on（1. Empty pET28a vector；2. 0 h induction；3. 1 h induction；4. 2 h induction；
5. 3 h induction；6. 4 h induction. M：Marker）；B：Expressed protein elution and purification（1. Before purification；
2–6. Collecting elution purified protein one by one with 500 μL and in turn gaining their concentrations
at 1.2，0.95，0.46，0.22，0.12，0.09 mg · mL-1，respectively. M：Marker）.
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2.4 纯化 β–葡萄糖苷酶活性检测
纯化蛋白经过复性和超滤浓缩，获得可溶蛋白浓度在 0.8 mg · mL-1 左右。用 0.5 g 着色期果肉匀
浆液和 500 μL 0.8 mg · mL-1 进行 25 ℃孵育 1 h 酶解反应。GC–MS 分析 ABA 含量。结果如图 7 所
示，水、洗脱缓冲液（Elution buffer）和复性蛋白（VvBG1）各处理管 ABA 含量分别约为 3.6、4.2
和 35 ng · L-1。试验结果表明，葡萄果实中 VvBG1 具有较高的葡萄糖基水解酶活性。

图 7 纯化蛋白葡萄果肉温育试验及 ABA 含量的测定
Fig. 7 Grape pulp-homogeneity-incubation test and ABA content analysis
3 讨论
近年来研究发现，ABA 在果实发育中起着重要的作用（Yu et al.，2006；Zhang et al.，2009；Sun
et al.，2010，2012；Jia et al.，2011）。来自模式植物拟南芥的研究证实，ABA 的水平一方面受生物
合成的决定，另一方面还要受到 ABA 代谢的调控：前者主要受 NCED 调控；后者主要受 ABA 羟基
化反应（形成 7-，8- 和 9-OH ABA）和结合作用（主要形成 ABA 葡萄糖苷 ABA-glucose ester，
ABA-GE）调控（Nambara & Marion-poll，2005）。Xu 等（2002）研究发现，一种受 ABA 诱导的葡
萄糖基转移酶 ABA-GTase（ABA-glucosyltransferase，EC 2.4.1.35）可以把游离的 ABA 转化为
ABA-GE。过去的研究认为，ABA 葡萄糖苷（ABA-GE）是一个没有活性的终产物（Lehmann & Schutte，
1984；Zeevaart，1999）。但是，随着拟南芥上 β–葡萄糖苷酶 AtBG1 首次鉴定，对以上认识发生了
根本地改变：即该酶能把无活性的结合态 ABA 葡萄糖苷直接转化为有活性的游离态 ABA，从而促
进活性 ABA 的快速积累（Lee et al.，2006）。
近年来借鉴模式植物的研究成果，β–葡萄糖苷酶在果实发育中作用已有少量报道（Sun et al.，
2010；王延书 等，2010；Li et al.，2012）。例如，当玫瑰香葡萄果实中 ABA 水平达到高峰时，部
分游离 ABA 将以 ABA-GE 形式储藏起来，说明果实发育后期存在 ABA-GE 库（Sun et al.，2010）。
王延书等（2010）在玫瑰香葡萄果实成熟期检测到了 VvBG1 基因的高水平表达。Li 等（2012）在
西瓜果实发育的后期也发现了 ClBG1 随着果实成熟表达量快速增加。以上研究在转录分析方面揭示
了 BG1 可能在果实成熟期起着重要的作用，但以上研究 BG1 蛋白酶活特点并没有阐述。本研究中
通过玫瑰香葡萄果实匀浆液温育试验检测到了外源表达蛋白 VvBG1 具有较高的生理活性。该结果
进一步证实了王延书等（2010）的推测：VvBG1 与始熟后 ABA 的积累存在密切的关系。
从生化代谢的能量和步骤来看，ABA 从头生物合成涉及了一系列复杂的生化代谢反应（Nambara
& Marion-poll，2005），而 BG 途径可以直接将大量的无活性的结合态 ABA 葡萄糖苷转化为有活性
的游离态 ABA。因此，BG 途径合成 ABA 比 NCED 途径要简单的多，解离途径合成 ABA 不但节省
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了大量的能量，而且更迅速（王延书 等，2010）。因此，如何通过基因工程或生物化学途径操纵果
实中 β–葡萄糖酯酶的活性进而快速调控 ABA 的水平，对于果实成熟调控及果品生产具有重要的意
义。

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