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Cloning of Chlorophyll a/b Binding Protein CmLhcb1 and Promoter from Chrysanthemum morifolium and Expression Analysis

菊花叶绿素a/b结合蛋白基因CmLhcb1及其启动子的克隆和表达分析



全 文 :园 艺 学 报 2013,40(6):1119–1128 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期:2013–02–26;修回日期:2013–05–15
基金项目:江苏省农业科技自主创新资金项目[CX(12)2020];江苏省科技支撑计划项目(BE2011325,BE2012350);江苏省自然科
学基金项目(BK2012773,BK2011641);江苏省高校科研成果产业化推进项目(JHB2011-8);国家自然科学基金项目(31071820)
* 通信作者 Author for correspondence(E-mail:chenfd@njau.edu.cn)
菊花叶绿素 a/b 结合蛋白基因 CmLhcb1 及其启
动子的克隆和表达分析
韩 霜 1,2,刘瑞霞 1,张兆和 1,陈素梅 1,蒋甲福 1,房伟民 1,廖 园 1,
陈发棣 1,*
(1 南京农业大学园艺学院,南京 210095;2商丘师范学院生命科学学院,河南商丘 476000)
摘 要:以切花菊品种‘公子’cDNA 为模板克隆出叶绿素 a/b 结合蛋白同源基因 cab,其开放阅读
框为 798 bp,编码 266 个氨基酸。经多物种间比对分析,确认其属于 cab 基因家族的 Lhcb1 类,命名为
CmLhcb1。同源克隆菊花品种‘清露’Lhcb1 基因,氨基酸序列与‘公子’完全相同。CmLhcb1 在叶片中
的表达量比在茎、花和根中高,弱光和 GA3 处理使 CmLhcb1 表达上调,多效唑处理后 CmLhcb1 表达量
受到抑制。CmLhcb1 的表达受昼夜节律调节,白天表达量显著高于夜间。通过 high-efficiency TAIL-PCR
(hiTAIL-PCR)方法克隆到‘公子’切花菊 CmLhcb1 起始密码子上游序列 715 bp 和‘清露’起始密码子
上游序列 716 bp,序列经 PLACE 数据库的比对分析,发现有很多与非生物和生物胁迫相关的元件,主要
与光照、GA、ABA、水分、水杨酸和病毒相关,CmLhcb1 启动子是光诱导型启动子,具有 GT1-box 和
Z-box。
关键词:菊花;叶绿素 a/b 结合蛋白(LHC);启动子;克隆
中图分类号:S 682.1+1 文献标志码:A 文章编号:0513-353X(2013)06-1119-10

Cloning of Chlorophyll a/b Binding Protein CmLhcb1 and Promoter from
Chrysanthemum morifolium and Expression Analysis
HAN Shuang1,2,LIU Rui-xia1,ZHANG Zhao-he1,CHEN Su-mei1,JIANG Jia-fu1,FANG Wei-min1,
LIAO Yuan1,and CHEN Fa-di1,*
(1Department of Horticulture,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China;2College of Life Science,Shangqiu
Normal University,Shangqiu,Henan 476000,China)
Abstract:The cDNA of cut chrysanthemum‘Gongzi’was used to clone homologous gene cab,
which had 798 bp ORF and 266 amino acid. After blast analysis,we confirmed that the gene was ranked as
Lhcb1,and was named as CmLhcb1. Using the cDNA of‘Puma Sunny’chrysanthemum to homologously
clone gene Lhcb1,we got the same amino sequence with that of‘Gongzi’. The expression of CmLhcb1
was the higher in leaf than that in stem,flower and root. Low light and GA3 treatment increased CmLhcb1
expression. Paclobutrazol treatment inhibited CmLhcb1 expression. The circadian clock regulated the

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expression of CmLhcb1. The gene expression in day was enormously higher than that in night. The
promoter sequence 715 bp of‘Gongzi’cut chrysanthemum and 716 bp of‘Puma Sunny’were cloned using
high-efficiency TAIL-PCR(hiTAIL-PCR),and many biologic and abiotic stress responsive elements
related to light,GA,ABA,water,SA and virus were found by PLACE Databank. The promoter was light
responsive,and it had the GT1-box and Z-box element.
Key words:Chrysanthemum morifolium;chlorophyll a/b-binding protein(LHC);promoter;clone

叶绿素 a/b 结合蛋白(LHC)是核基因编码的类囊体蛋白,由定位于核内的 cab 基因编码
(Jansson,1999),绿色植物通过它捕获太阳能同化 CO2。
在高等植物中,大部分的叶绿素分子都结合在光系统Ⅰ(PSⅠ)和光系统Ⅱ(PSⅡ)的天然色
素蛋白复合物上,光系统Ⅱ捕光色素蛋白复合物在类囊体膜上的含量最为丰富,它所结合的叶绿素
约占类囊体膜上色素量的 50%(Peter & Thornber,1991)。光系统Ⅱ捕光色素蛋白复合物除了作为
PSⅡ天线外,还参与类囊体膜的垛叠和调节激发光能在两个光系统间的分配(Labate et al.,2004)。
光系统Ⅰ捕光色素蛋白(LHCⅠ)包括 Lhca1、Lhca2、Lhca3 和 Lhca4 基因编码的蛋白二聚物 LHC
Ⅰ-730 和 LHCⅠ-680,光系统Ⅱ捕光色素蛋白(LHCⅡ)包括 Lhcb1、Lhcb2 和 Lhcb3 基因编码的
三聚体多肽 type1、type2 和 type3,Lhcb4、Lhcb5 和 Lhcb6 编码的蛋白分别为 CP29、CP26 和 CP24
(Jansson,1999)。
基因 Lhcb 在转录水平上受光的调控(Millar & Kay,1996),转录水平的高低与光合活性有关
(Labate et al.,2004)。已有研究认为高等植物的 Lhcb启动子区包含很多与光响应相关的元件如GT-1
sites、I-box 或者 G-boxes(Anderson & Kay,1995;Terzaghi & Cashmore,1995;Cerdán et al.,1997)。
但是光响应基因包括 Lhcb 缺少保守的顺式作用元件(Hahn & Kück,1999)。从水稻中克隆的 cab
基因启动子的顺式作用元件位于–269 ~–170 区域,此元件在玉米和大豆中响应光调节,但在花生
中此区域不响应光调节(Luan & Bogorad,1992)。
本研究中以两个耐弱光性不同的菊花品种‘公子’和‘清露’为试验材料,克隆到 Lhcb1 基因
全长序列和启动子片段,并获得与该基因表达调控相关的顺式作用元件的详细信息,为进一步研究
Lchb1 的功能及其表达调控机制,以及如何通过调控启动子来提高 Lhcb1 的表达水平从而提高菊花
耐弱光性奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
试验于 2012 年 4—12 月在南京农业大学和中国菊花种质资源保存中心完成。供试材料为菊花
(Chrysanthemum morifolium)切花品种‘公子’(耐弱光型)和‘清露’(弱光敏感型)。选择生长
一致的插穗,扦插生根后移栽到口径 12 cm 大小的花盆中,所用基质配方为营养土︰珍珠岩︰蛭石 =
2︰1︰1,不施营养液。
1.2 CmLhcb1 基因及其启动子区克隆
根据 GenBank 中报道的豌豆(AAW31511.1)、黄花蒿(ABQ32304.1)、冰叶日中花(AAB61238.1)、
烟草(BAA25396.1)、红车轴草(AAR10886.1)和鹰嘴豆(CAA10284.1)的 cab 基因编码的蛋白
质序列保守区设计兼并引物 Lhcb1-F1(CCGGCTCCCCCTGGtayggnccnga)、Lhcb1-F2(CCCCGGCGA
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CTACggntgggayac)、Lhcb1-F3(CCACTGCCGGTGGgcnatgytngg)和 Lhcb1-R1(GGTGGTCGGCCA
GGTTYTCNARNGG)、Lhcb1-R2(CGATGGCCTGCACGAARAANCCRAACA)、Lhcb1-R3(GCTG
CTCGGCGAAGGCCTCNGGRTCNTC),通过 RT-PCR 扩增获取目的基因片段并进行测序;再根据
中间已知片段序列设计扩增 3′方向引物 Lhcb1-3-F(CTGTATGGTTCAAAAGGCTGGTGC)和 5′方
向引物 Lhcb1-5-R(CACCAGCCTTGAACCATACAGC),按照 Generacer 试剂盒(Invitrogen)cDNA
快速扩增。将每次所测序列拼接,根据拼接结果设计序列的全长引物,使用高保真酶进行 PCR 扩增
验证。
DNA 提取采用菊花育种实验室改良的 CATB 法。根据 CmLhcb1 基因全长序列,设计特异反向
引物 Lhcb1-p-R1(GGCACCAGCCTTGAACCATACAG),Lhcb1-p-R2(CTCACGGTTCTTGGCGAAT
GTCT)和 Lhcb1-p-R3(TCACGGCTTGTCCAGCGAAAG),应用 high-efficiency TAIL-PCR(hiTAIL-
PCR)方法,扩增基因上游启动子区。
1.3 组织表达分析
分别取‘公子’和‘清露’的根、茎、叶(2012 年 5 月采样)和花(2012 年 10 月、11 月采样)
进行组织表达分析。根为包括根尖长约 2 cm 幼嫩部位,叶片为顶端嫩叶,茎为从上向下数第 4 个节
间。每个样 3 次重复。
1.4 胁迫处理
弱光处理:选择生长一致的盆栽苗,分别放置到两个大棚内。大棚用不同厚度的遮阳网覆盖,
光照强度分别是 55%自然光照(对照)和 15%自然光照(弱光处理)。试验期间昼夜温度、光周期
和空气相对湿度分别是 30 ℃/21 ℃、14 h/10 h 和 75%,常规栽培管理。分别在处理 0、1、2、4、6
和 8 d 取顶端嫩叶备用。
GA3 和多效唑处理:分别用 2 mmol · L-1 GA3 和 50 μmol · L-1 多效唑(paclobutrazol)在 0 和 3 d
的 10:00 各喷施一次,对照同时用 1%乙醇喷施,分别在处理 0、6、12、24、48、96 和 144 h 取样
备用。
1.5 昼夜表达特性分析
以对照大棚内植株为试验材料,分别在 6:00、10:00、14:00、18:00、22:00、翌日 2:00
时取样,进行昼夜表达特性分析。
1.6 荧光定量 PCR
根据 cDNA 序列设计一对特异引物,Lhcb1-r-F(TGATGGGTGCAGTTGAGGGTT)和 Lhcb1-R-F
(GGGACGAAGTTTGTAGCGTAGGA)。以稳定表达的 EF1α 基因为内参,设计引物 EF1α-F
(TTTTGGTATCTGGTCCTGGAG)和 EF1α-R(CCATTCAAGCGACAGACTCA)。
在实时定量 PCR 仪器 Mastercycler ep realplex2(Eppendorf,Germany)上检测基因的表达量,
参照荧光定量 PCR 试剂盒[SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus(QPK-212)]说明书建立 20 μL
反应体系。
数据分析得到各个样品的 CT 值,采用 ΔΔCT 法计算相对定量,目标基因相对定量 = 2-ΔΔCT(Livak
& Schmittgen,2001)。
每处理 3 次重复。
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2 结果与分析
2.1 CmLhcb1 及启动子序列分析
用 BioEdit 将核酸序列翻译成蛋白质序列,提交到 http://www.expasy.org/prosite ScanProsite 选
项进行分析,CmLhcb1 编码的氨基酸中第 22 ~ 25 位为络氨酸激酶(CK1)磷酸化位点(Casein Kinase
I phosphorylation site)。第 33 ~ 35 位为蛋白激酶 C 磷酸化位点(Protein kinase C phosphorylation site)。
第 39 ~ 241 位和 235 ~ 2 237 位为丝氨酸磷酸化位点(Phosphoserine)。蛋白质分子量为 28.15 kD,
等电点为 5.085。
提交 NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi)进行在线比对,将同源性较高的其他物种
的 Lhcb1 序列下载(易瑾 等,2012),用 DNAMAN 比对和聚类分析,发现供试的两个菊花品种对
应的氨基酸完全相同,CmLhcb1 序列与其他 13 个物种相似度很高。
聚类分析结果显示,CmLhcb1 与人参(Panax ginseng)、三叶草(Trifolium pretense)的相关基
因关系最近,而与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、芸薹(Brassica oleracea)的关系最远(图 1)。

图 1 CmLhcb1 与几个已知物种 cab 编码区氨基酸同源序列的聚类分析
Atcab:拟南芥,NP_174286.1;Bocab:芸薹,AAL67432.1;CmLhcb1,菊花;Lrcab:石蒜,ADC35579.1;
Mccab:松叶菊,AAB61236.1;Nscab:烟草,BAA25393.1;Ptcab:富贵草,ABD38707.1;PgLhcb1:
人参,AAB87573.1;PtLhcb1:毛果杨,XP_002316737.1;Rccab:蓖麻,XP_002519724.1;
Slcab-3c:番茄 AAA34148.1;Stcab:马铃薯,AAA80593.1;
Socab:菠菜,CAJ77390.1;
Tpcab:三叶草,AAR10886.1。
Fig. 1 Clustering of CmLhcb1 deduced amino sequence and several other species cab
Atcab:Arabidopsis thaliana,NP_174286.1;Bocab:Brassica oleracea,AAL67432.1;CmLhcb1:Chrysanthemum morifolium;
Lrcab:Lycoris radiate,ADC35579.1;Mccab:Mesembryanthemum crystallinum,AAB61236.1;
Nscab:Nicotiana sylvestris,BAA25393.1;Ptcab:Pachysandra terminalis,ABD38707.1;
PgLhcb1:Panax ginseng,AAB87573.1;Ptcab:Populus trichocarpa,XP_002316737.1;
Rccab:Ricinus communis,XP_002519724.1;Slcab-3c:Solanum lycopersicum,AAA34148.1;
Stcab:Solanum tuberosum,AAA80593.1;Socab:Spinacia oleracea,CAJ77390.1;
Tpcab:Trifolium pretense,AAR10886.1.

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根据 cDNA 序列设计 3 个反向引物,通过 hiTAIL-PCR 方法克隆到‘公子’起始密码子上游序
列 715 bp(图 2),‘清露’起始密码子上游序列 716 bp(图 3)。CmLhcb1 基因启动子序列经 PLACE
数据库比对分析,发现了很多非生物和生物胁迫的相关元件。‘公子’和‘清露’启动子区包括 3
个受光、病毒和水杨酸诱导的 GT1 元件(GAAAAA),‘公子’定位在–300 ~–305 bp,–338 ~
–343 bp 和–598 ~–604 bp;‘清露’定位在–148 ~–143 bp,–251 ~–246 bp 和–439 ~–434 bp
区间。‘公子’有 3 个受冷,ABA 和干旱胁迫的 MYC 位点(CANNTG),定位在–51 ~–56 bp,
–136 ~–141 bp 和–205 ~–210 bp;‘清露’有 2 个 MYC 位点,定位在–107 ~–112 bp 和–176 ~
–181 bp 区间。两个品种均有 5 个受光诱导和 rbcS 合成有关的 GATAA 元件(Ibox),‘公子’定位
在–96 ~–100 bp,–169 ~–173 bp,–147 ~–151 bp,–164 ~–168 bp 和–538 ~–542 bp;‘清露’
定位在–99 ~–104 bp,–173 ~–177 bp,–232 ~–236 bp,–494 ~–498 bp 和–563 ~–567 bp。
另外,还包括 4 个与 cab 基因转录有关的 GATA-box。这些元件的存在暗示了 CmLhcb1 基因可能受
相关逆境的响应。


图 2 ‘公子’切花菊 CmLhcb1 启动子序列及响应元件分析
PLACE 预测的功能元件用下划线表示。下同。
Fig. 2 The promoter sequence of CmLhcb1 of‘Gongzi’cut chrysanthemum and responsive elements analysis
Functional elements as predicted by PLACE are underlined. The same below.
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图 3 ‘清露’切花菊 CmLhcb1 启动子序列及响应元件分析
Fig. 3 The promoter sequence of CmLhcb1 of‘Puma Sunny’cut chrysanthemum and responsive elements analysis


2.2 CmLhcb1 表达特征分析
组织特异性表达分析显示,CmLhcb1 在‘公子’和‘清露’两个品种的根、茎、叶和花中均有
表达,其中在叶片中表达量最高,茎和花中表达量都较低,根中几乎检测不到(图 4,A,B)。基
因启动子元件分析结果表明 CmLhcb1 受光和 GA3 诱导。荧光定量结果显示,在弱光处理和 GA3 处
理条件下,CmLhcb1 均有不同程度的上调。15%弱光照条件下,‘公子’CmLhcb1 表达量在 0 ~ 6 d
时逐步上升,6 ~ 8 d 变化不明显(图 5,A);‘清露’在 0 ~ 4 d 快速上调,4 d 时比 55%对照光照条
件下高 2.19 倍,随后下降(图 5,B)。GA3 处理使两个品种 CmLhcb1 表达量都上升,‘公子’表达
量最高点出现在 96 h,24 ~ 144 h 表达量变化不显著(图 6,A),‘清露’表达量最高点出现在 48 h,
24 ~ 144 h 表达量变化显著(图 6,B)。Paclobutrazol 处理使 CmLhcb1 表达量都下降,6 h 后两个
品种表达量都显著低于对照,24 ~ 144 h 小幅上调,144 h 时与对照相比差异不显著(图 6)。CmLhcb1
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受昼夜节律调节,白天与晚上表达量差异很大,‘公子’CmLhcb1 白天 10:00 比凌晨 2:00 表达量
高 32 倍(图 7,A),‘清露’CmLhcb1 白天 10:00 比凌晨 2:00 表达量高 42 倍(图 7,B)。


图 4 CmLhcb1 在不同组织中的表达
Fig. 4 Expression analysis of CmLhcb1 in various tissues















图 5 CmLhcb1 在不同光照条件下的表达
Fig. 5 Expression analysis of CmLhcb1 in plants under different conditions


















图 6 GA3 和多效唑对 CmLhcb1 表达的影响
Fig. 6 Effect of GA3 and paclobutrazol on expression of CmLhcb1
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图 7 CmLhcb1 在不同时刻的表达
Fig. 7 Expression analysis of CmLhcb1 in different o’clock

3 讨论
cab 家族基因在进化过程中,其 cDNA 序列相当保守(向太和 等,2005;高志民 等,2007,
2009)。CmLhcb1 属于 Lhcb1 类基因,与其他同源基因的氨基酸序列一致性在 85%以上,进一步证
明此基因在进化过程中是保守的。不同组织表达特性分析发现,叶片中表达丰度最高,茎中次之,
花中很低,根中几乎不表达。这种分布与 cab 作为捕光色素结合蛋白基因,其表达是在光合作用的
光反应场所——叶绿体的类囊体中结论相符(Allen & Staehelin,1992)。叶绿素 a/b 结合蛋白表达随
着光照强度的变化而变化,目前普遍认为 Lhc 受光的调节(Escoubas et al.,1995;Hahn & Kück,
1999)。低等生物绿藻在 50 μmol · m-2 · s-1 光照条件下 LhcII-1.1、LhcII-1.3、LhcII-3、LhcII-4、Lhcb-4、
Lhcb-5 表达量比在 200 μmol · m-2 · s-1 光照条件下都高(LaRoche et al.,1991)。在本试验中发现,15%
弱光照条件下‘公子’切花菊 CmLhcb1 表达量在 0 ~ 6 d 时逐渐上升,6 ~ 8 d 变化不明显(图 4,A);
‘清露’切花菊 CmLhcb1 表达量在 0 ~ 4 d 快速上调,4 d 后就开始下降(图 4,B),LHCII 作为
Lhcb1 基因对应的捕光色素蛋白,因此‘公子’比‘清露’更能适应弱光。DELLA 蛋白通过抑制
PIFs 活性调控编码叶绿体蛋白的核基因转录,PIF1 结合到 Lhcb2.2 启动子 G-box 上调控 Lhcb2.2 基
因的转录,PAC 处理抑制其转录(Cheminant et al.,2011)。本试验结果显示 GA3 处理使 CmLhcb1
表达上调,可能是因为 DALLA 对 PIFs 的抑制降低,从而增加了 PIFs 对 Lhcb 基因转录造成的
(Feng et al.,2008)。Lhc 的表达还受昼夜节律调节(Millar & Kay,1991),水稻 cab 的表达在光照
阶段比黑暗阶段高 10 倍(Sugiyama et al.,2001)。本研究中发现:两个菊花品种 CmLhcb1 在 10:00
时表达量比凌晨 2:00 时分别高 32 倍和 42 倍(图 7,A、B),所以 CmLhcb1 表达也具有昼夜节律
性。
在高等植物的发育过程中,光不但直接参与光合作用,而且还作为重要的信号物质调控相关基
因的转录(Lau & Deng,2010)。捕光叶绿素 a/b 蛋白复合体基因(cab)及核酮糖二磷酸羧化酶小
亚基基因(rbcS)是两种典型的光依赖型基因,启动子元件 I-box、G-box、Z-box、GT1-box 对光调
控的转录激活是必须的(Chattopadhyay et al.,1998)。I-box 又称为 GATA 元件,含有 GATTA 序列,
G-box 含有 CACGTG 序列,烟草中 rbcS 基因启动子区 CMA5 包含 I-box 和 G-box 顺式作用因子,
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受光的诱导和 HY5 及 COP/DET 的调控(Martinez et al.,2002)。Z-box 含有 ATACGTGT 序列,拟
南芥中 CAB1 包含 Z-box 顺式作用因子,也受光诱导和光受体及下游调节因子 COP1 和 HY5 的调控
(Yadav et al.,2002)。GT1-box 又称为 II-box,GT1-box 数量不同,驱动基因表达也有差异(张毅 等,
2007)。烟草在黑暗条件下 7 个 GT1-box 驱动 GUS 基因的表达,在光下 2 个 GT1-box 诱导基因表达
(Mazarei et al.,1998)。本研究中发现,‘公子’和‘清露’切花菊 CmLhcb1 启动子区都有 5 个与
光调控有关的位点 GATA 元件(I-box),3 个 GT1-box,但同一个元件在两个品种所处位置不同(图
2、图 3),不同光应答元件之间的相互作用是光调控启动子活性的重要因素(Carranco et al.,1999;
Kasuga & Liu,1999)。CmLhcb1 启动子具有多个光应答元件,这说明 CmLhcb1 属于光诱导型启动
子。这些元件如何调控基因的表达,哪个元件对 CmLhcb1 表达是必须的,具体的调控模式等,有待
进一步研究。

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