全 文 ：园 艺 学 报 ， （ ）： – 2014 41 12 2481 2488 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–07–22；修回日期：2014–11–02
基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-27）；国家高技术研究发展（‘863’）计划课题（2011AA100205）；重
庆市基础与前沿研究计划项目（cstc2013jcyjA8）；中央高校基本科研业务费专项资金项目（XDJK2013C104，XDJK2014A018）
* Author for correspondence E-mail chenshanchun@cric.cn
应用抑制性消减杂交技术从枳中筛选根特异表
达基因
姚利晓，何永睿，许兰珍，雷天刚，彭爱红，邹修平，陈善春*
（中国农业科学院柑桔研究所，国家柑桔工程技术中心，国家柑桔品种改良中心，重庆 400712）
摘 要：为筛选分离植物根组织特异表达基因，以枳根 RNA 为试验组，叶 RNA 为驱动组，构建了
枳根消减文库。从该消减文库中共获得有效序列 1 177 个，其片段长度主要分布在 200 ~ 500 bp；序列拼
接后得到 455 个非重复序列，其中 245 个与已知基因匹配，具有结合功能、催化活性和转运活性等生物
学功能，可参与植物的代谢、细胞生长、个体发育、应激反应等生物学过程。实时定量 PCR 检测结果显
示这些基因中的主要乳液蛋白、早期结瘤素样蛋白和贝壳杉烯酸氧化酶等基因在根中高表达。
关键词：枳；根特异表达基因；抑制性消减杂交技术；定量 PCR
中图分类号：S 666 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）12-2481-08

Identification of Root-specific Genes with Subtractive Suppression
Hybridization from Poncirus trifoliate
YAO Li-xiao，HE Yong-rui，XU Lan-zhen，LEI Tian-gang，PENG Ai-hong，ZOU Xiu-ping，and CHEN
Shan-chun*
（Citrus Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences；National Citrus Engineering Research Center；
National Citrus Improvement Center，Chongqing 400712，China）
Abstract：A suppression subtractive hybridization（SSH）library of Poncirus trifoliata was successfully
constructed for screening the citrus root-specific genes by using the root RNA as Driver and the leaf one as
Tester. Of 1 362 sequenced clones，1 177 ESTs（expressed sequence tags）in good quality were acquired
from the SSH library and assembled into 455 Unigenes. Among them，245 Unigenes were homologous
with the genes in GenBank database，which have biology function such as catalytic activity，transporter
activity，carrier activity and so on. They play the important roles in biology process such as metabolic
process，cellular process，developmental process，response to stimulus and so on. The 17 genes were
further analyzed by real-time PCR and confirmed that they were highly expressed in the roots，but very
low in the leaves. Bioinformatic analysis indicated that they are the major latex protein gene，the early
nodulin-like protein gene，the ent-kaurenoic acid oxidase gene and etc.
Key words：Poncirus trifoliata；root-specific gene；the suppression subtractive hybridization library；
quantitive PCR

通信作者 （ ： ）
致谢：感谢西南大学赵晓春研究员在论文写作过程中提出的中肯建议。
2482 园 艺 学 报 41 卷
根系是植物获取水分和营养的主要器官，近年来根系特异表达基因的鉴定及其功能分析成为研
究的热点，包括脂转运蛋白基因MtN5（Pii et al.，2009）、葡糖硫苷酶基因CpTGG2（Wang et al.，
2009b）、生物防御基因MIC-3（Buriev et al.，2010）、细胞壁松弛蛋白基因EXPB（Won et al.，2011）
、信号传递蛋白（Wall-associated receptor-like kinases）基因WAKs（Kaur et al.，2013）、细胞壁形成
相关的胼胝质合酶基因GSL8（刘林 等，2013）、植物抗非生物压力交替氧化酶（Alternative oxidase）
基因AOX（Mhadhbi et al.，2013）等。并且根特异性启动子对作物改良具有重要的价值，尤其在植
物抗病虫害、耐盐碱、耐旱，以及提高和改善食根性植物产量、营养成分等方面有突出的应用价值，
一些根特异性表达启动子，如AtPky10（Li et al.，2009）、RCc3（Jeong et al.，2010）、PsPR10（Xu
et al.，2010）、AtMDK4-20（Lilley et al.，2011）、AtNRT21（Kong et al.，2013）等已经被应用于
植物的转基因研究中。但相对于诱导型启动子和其它组织特异性启动子，已经发现和应用的根系特
异性启动子的种类仍然较少（李凤龙 等，2012）。
枳（Poncirus trifoliata）是应用最广泛的柑橘砧木品种之一。目前已从枳中克隆出耐低温相关的
PtCBF（Wang et al.，2009a）、PtrHOS1（Liu et al.，2010）和Ptcorp（Long et al.，2012）等基因，
以及与耐干旱相关的基因PtrABF（Huang et al.，2010）、PtrMAPK（Huang et al.，2011）和PtADC （Wang
et al.，2011）等。然而，从利用根系抗逆性的角度来说，研究根系特异表达基因的种类和功能更有
意义。本研究中以枳根系的RNA为试验组、叶片RNA为驱动组构建了根消减cDNA文库，以期获得
根中特异表达基因的信息，为组织特异表达基因的筛选及根特异性启动子的克隆和应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
于 2011 年秋季采自中国农业科学院柑桔研究所“国家果树种质（重庆）柑橘圃”，种子
用八
按照植物总 RNA（小量）抽提试剂盒（上海华舜生物技术有限公司，
商品
1.2 构建根消减cDNA文库
RNA为模板，应用Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit （Clontech，
Cat.
生工生物工程（上海）股份有限公司测序。去除载体序
列和
枳果实
羟基喹啉处理后，置于湿润的无菌滤纸上发芽，待芽长至 1 cm 时移栽至营养土中。长出 5 ~ 6
片复叶时取出植株，剪取顶端第 3 片叶或幼嫩根，在自来水下冲洗干净，用 DEPC 水处理，无菌滤
纸吸干表面的水后液氮冻存。
称取 100 mg 根或叶组织，
号 W7021）说明书提取枳根 RNA。在第 1 次加入去蛋白液离心后，加入 DNase（RNase-free）
在 37 ℃处理 30 min，再次用去蛋白液处理，以去除样品中的 DNA。所提 RNA 应用紫外分光光度
仪和琼脂糖凝胶电泳检测。
分别以1 μg枳根和叶的总
No. 635000）按照 LD-PCR 方法合成 cDNA，PCR 扩增 24 个循环。以所获得的根 cDNA 为试验
组，叶 cDNA 为驱动组，按照 PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit（Clontech，Cat. No. 637401）试剂
盒说明书进行 RsaⅠ酶切消化、接头连接、杂交、PCR 扩增等操作；采用 ACTIN 基因引物（刘小丰
等，2011），用 PCR 检测杂交效率，分别在 18、23、28、33 个循环取 PCR 产物进行凝胶电泳检测。
利用 DNA 回收试剂盒（北京三博远志）回收第 2 次 PCR 差减产物连接到 pGEM-T easy 载体，转化
感受态大肠杆菌 JM109，挑取白斑测序。
将根消减文库全部 1 362 个白色克隆送
接头序列，将长度大于 150 bp的ESTs利用DNAstar软件进行拼接，获得Unigenes。利用Blast2GO
12 期 姚利晓等：应用抑制性消减杂交技术从枳中筛选根特异表达基因 2483
（版本 V.2.7.0）等软件进行生物学功能注释和分类，并利用 BLASTn 在柑橘功能基因数据库（http：
//bioinfo.ibmcp.upv.es/ genomics/cfgpDB/）中进行同源搜索。
1.3 定量PCR分析
反转录用 PrimeScript® RT Reagent Kit 购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa Code：
DRR
表 1 所用 列
Table 1 Pr eriments
基因 Unigene 引物 Primer 正向序列 向序列 Reverse sequence
037A），定量 PCR 按照 SYBR® Premix Ex TaqTM（TaKaRa Code：DRR420A）说明书操作，所
用引物（表 1）由北京三博远志生物技术有限公司合成。定量 PCR 的反应条件为 95 ℃预变性 90 s；
95 ℃ 10 s，61 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共 40 个循环；反应结束后进行熔解曲线分析产物的特异性。3
次生物学重复，采用∆∆Ct 法分析试验数据，确定各基因在根和叶中的相对表达量。

引物序
imers used in the exp
Forward sequence 反
contig 1 C1F/C1R 5′-TGATCGCAGTTGCGGACGACT -3′ AACCCCA-3′ 5′-AGGGACCCCAATGATGA
contig 8 C8F/C8R 5′-ACGCGGGGAAACCAGAAGCAAA-3′

3′
-3′
-3′
2
′

′

5′-AGTCCAACCCTCCGACCACTCAT-3′
contig 12 C12F/C12R 5′-TGTGATAGCTCATGGGCCAAAT-3′

5′-ATTCTCAGGGGCAGAGTGGG-3′
A-contig 22 C22F/C22R 5′-GCTTTGGGGGATGATGGGCTTCG-3′ 5′-TCAAGCCATTCCGAAGGGTGAAC
contig 28 C28F/C28R 5′-ACTACCAGAGCTGCAGGGCTTCA-3′ 5′-CTTCAAGCCAGCTTCGCAATGGC-3′
contig 38 C38F/C38R 5′-TGCCTGGAGTAGTCTGCGCAC-3′

5′-TCGGTCCCCCTTTTCGTGAACC-3′
Ccontig 54 C54F/C54R 5′-AGCCAGAACCTTCCCATGCCAA-3′ 5′-AGTGAGGTCACCGGATTCACTCTT
contig 56 C56F/C56R 5′-CGCTGAGGAAAGCTAAGGAGGAGC 5′-ACGGTGACAGATTGGTCATGCGT-3′
singleton 5 S52F/S52R 5′-TGCCTACAACAAGGCCCTCCGA-3′

5′-GGCCGCATATGTAATGCGCG-3′
3′ singleton 60 S60F/S60R 5′-CCATGTTGAGGGCGAAGTGTCAC-3′ 5′-CAGGGCCAAGAATTTGTGTGGGC
singleton 73 S73F/S73R 5′-TGAAGGCACAGCAACATGCGT-3′
-3
5′-TCCAAAACTCAACCTTGCAGCCA-3′
singleton 86 S86F/S86R 5′-GATGATGGCAGTTTGGTGCACTGG 5′-GGCCTACGGCTGCTGAGAAAGG -3′
singleton 169 S169F/S169R 5′-TGCGTTCGATTTGGAACCCACC-3′ 5′-TTGCAGCGATGGGATCACCGA-3′
singleton 247 S247F/S247R 5′-CTACCCACCCCATCCGACTGGG-3′ 5′-CTGCTTTGCAAGGTGGCATGCC-3′
singleton 265 C265F/C265R 5′-GCTTGTGGCTTGGACGCCAAAC-3′ 5′-CCCAGTAGGACCACCTCCACCAT-3
singleton 283 S283F/S283R 5′-TTCCACGCCTTTGAAGATGGGGC-3′ 5′-CAGCGGCTTGTTGATGTTGGTGG-3′
singleton 297 S297F/S297R 5′-TGACAGTGCCTGGTTTCCCCCAT-3′ 5′-GTGCTTAGCTGCAGGCCACACC-3′
ACTIN actin1/actin2 5′-CATCCCTCAGCACCTTCC-3′ 5′-CCAACCTTAGCACTTCTCC-3′
2 结果与分析
2.1 cDNA消减文库序列分析结果
的消减效率进行检测，发现消减 cDNA 在 PCR 扩增至 33 个循
环时
行测序，共计 1 362 个。去除载体序列和片段小于 150 bp
的序
体过程、生物
学调
以看家基因 ACTIN 对根消减文库
都未发现目的条带，而未消减的 cDNA 在 23 个循环时即可检测到 ACTIN 的表达（图 1），表明
本次构建的枳根消减文库消减效率较高。
通过蓝白斑筛选，挑取全部白色克隆进
列，获得有效序列 1 177 个，其片段长度主要分布在 200 ~ 500 bp。利用 DNAstar 软件进行序
列拼接，获得 455 个 Unigenes，其中包含 contigs 121 个、singletons 334 个。利用 Blast2GO 软件对
Unigenes 序列进行同源搜索（BLASTx，E ≤ 1.0E-6）和功能注释，有 245 个 Unigenes 可与已知基
因的氨基酸序列匹配，这些基因多来源于柑橘及其近缘属植物，占比对上基因的 87.3%，如克利曼
丁（Citrus clementina）同源基因 206 个、甜橙（C. sinensis）4 个、枳（P. trifoliata）2 个、枸櫞（C.
medica）1 个、酸橙（C. aurantium）1 个；另有 193 个 Unigenes 无任何比对信息。
基因功能归类结果表明，这些基因主要涉及一些代谢过程、细胞过程、单个有机
节、定位、应激反应、细胞成分构成、发育过程、多细胞有机体过程和信号传递等；从生物学

2484 园 艺 学 报 41 卷
功能看，主要涉及一些结合功能、催化活性和转运活性等；这些基因编码蛋白主要存在于细胞和细
胞器结构中，有部分存在于细胞膜和大分子复合体中，少数位于细胞间隙和膜封闭腔内（图 2）。
图 1 根消减文库效率检测
Fig. 1 Reduction of ACTIN abundance by PCR-select subtraction


2.2 定量PCR结果
455 genes 在柑橘功能基因计划（Citrus Functional Genomics Project，CFGP）的 EST 数
搜索，发现有 14 个 Unigenes 与 CFGP 中根来源的 ESTs 匹配较多，将这 14 个
Unig
图 2 枳消减文库特异性表达 Unigenes GO 分类结果
生物学过程：1. 代谢过程，2. 细胞过程，3. 单个有机体过程，4. 生物学调节，5. 定位，6. 应激反应，7. 细胞成分构成，8. 发育过程，
9. 多细胞有机体过程，10. 信号传递，11 ：14. 结合功能，15. 催化活性，
Biologic cess： ation，6. Response
to stimulus，7. Cellular c ignaling，11. Growth，
. 生长过程，12. 繁殖过程，13. 多个有机体过程；分子功能
16. 转运活性，17. 电子传递，18. 转录因子，19. 分子修饰，20. 抗氧化活性，21. 结构分子，22. 受体，23. 酶活调节；
细胞组分：24. 细胞，25. 细胞器，26. 细胞膜，27. 大分子复合体，28. 细胞间隙，29. 膜封闭腔。
Fig. 2 Distribution of differentially expressed Unigenes according to the GO consortium
al pro 1. Metabolic process，2. Cellular process，3. Single-organism process，4. Biological regulation，5. Localiz
omponent organization，8. Developmental process，9. Multicellular organismal process，10. S
12. Reproduction，13. Multi-organism process；Molecular function：14. Binding，15. Catalytic activity，16. Transporter activity，
17. Electron carrier activity，18. Nucleic acid binding transcription factor activity，19. Molecular transducer activity，
20. Antioxidant activity，21. Structural molecule activity，22. Receptor activity，23. Enzyme regulator activity；
Cellular component：24. Cell，25. Organelle，26. Membrane，27. Macromolecular complex，
28. Extracellular region，29. Membrane-enclosed lumen.

将 个 Uni
据库中进行 BLASTn
enes 和另外 3 个随机选择的 Unigenes contig 38、singleton 86 和 singleton 265 进行定量 PCR 分
析，发现其在根中的表达量高于叶中的表达（表 2）。这一研究结果一方面提示 CFGP 中 EST 数据
可作为基因组织表达的初步判断标准，另一方面，contig 38、singleton 86 和 singleton 265 的组织表
12 期 姚利晓等：应用抑制性消减杂交技术从枳中筛选根特异表达基因 2485
达分析结果丰富了 CFGP 的数据。

Table 2
表 2 部分 Unigenes 定量 PCR 结果
The real time PCR result of partial Unigenes
ESTs 数
rent tissues in CFGP
CFGP 中不同组织来源
EST numbers from diffe基因
Unigene
注释
Nr_annotation
ne
果实
Fruit
根中相对表达倍数
（叶为 1）
Relative fold 根 叶 离层
Root Leaf Abscission zo expression in root
contig 1 白 DNA binding protein DNA 结合蛋 16 0 0 1 16.14
contig 8 抗酒石酸酸性磷酸酶
Tartrate-resistant acid phosphatase type 5
otein
contig 22 6 0 0 0 19.81
contig 28
ng protein
3 0 0 0 117.57
contig 38* 0 0 0 0 14.50
ck protein
cid oxidase
singleton 52
ase
1 0 0 0 129.66
singleton 60 e P450 2 0 1 1 2.71
e protein
amily protein
singleton 169 1 0 1 1 2.75
protein
singleton 265* ette 0 0 0 0 4.29
rotein 2
13 1 1 1 3.97
contig 12 衰老相关蛋白
Senesence-associated pr
2 0 0 1 3.22
主要乳液蛋白
Major latex protein
蓝铜结合蛋白
Blue copper-bindi
未知蛋白 Unknown
contig 54 热休克蛋白
Calmodulin-binding heat-sho
1 0 0 0 3.75
contig 56 贝壳杉烯酸氧化酶
ent-kaurenoic a
1 0 0 1 10.77
贝壳杉烯酸氧化酶
ent-kaurenoic acid oxid
细胞色素 P450 Cytochrom
singleton 73 低温诱导蛋白
Low temprature induced-lik
9 4 0 4 2.90
singleton 86* bet v I 家族蛋白
bet v I allergen f
0 0 0 0 16.88
细胞色素 P450 Cytochrome P450
singleton 247 14-3-3 蛋白 14-3-3 4 1 2 0 2.03
ATP 结合盒 ATP-binding cass
singleton 283 甲基转移酶 O-methyltransferase 1 8 1 1 5 72.47
singleton 297 主要乳液蛋白 Major latex p 0 0 1 1 46.37
* 随机选择。
electio
3
通过构建枳根的消减文库，并进一步应用定量 PCR 分析，得到在根中高表达的基因，
要乳液蛋白基因 contig 22、蓝铜结合蛋白基因 contig 28、贝壳衫烯酸氧化酶基因 contig 56 和
singl
植物，如拟南芥、烟草、甜椒、桃、树莓、草莓、甜瓜、黄瓜和大豆中也分离出
主要
* Random s n.
讨论
本研究中
如主
eton 52 等。
主要乳液蛋白最先在罂粟的乳液中发现（Nessler et al.，1985），因是罂粟乳液中的主要蛋白而
得名。随后在其它
乳液蛋白基因。随着植物基因组学的发展，发现植物主要乳液蛋白基因包含不同的家族成员。
有研究显示主要乳液蛋白与植物发育相关，在花、果实或根中特异表达，受顺式肉桂酸、乙烯的诱
导（Aggelis et al.，1997；Kloos et al.，2002；Ruperti et al.，2002；Dowd et al.，2004；Wu et al.，2008；
Guo et al.，2011）。主要乳液蛋白参与植物对生物或非生物逆境的防御反应，在高盐、低温、干旱、
强光和黑暗等非生物逆境下，其表达量在短期内迅速提高（Nam et al.，2003；Hwang et al.，2004；
Kimbrough et al.，2004；Chen & Dai，2010；Sun et al.，2010）；在病原物诱导下主要乳液蛋白基因
的表达增强，与植物的抗病性相关（Chen & Dai，2010）。本研究中在枳根消减文库中筛选出主要乳

2486 园 艺 学 报 41 卷
液蛋白基因，其在根中的表达量是叶中的 46 倍，表明该基因可能在根中特异性高表达。
蓝铜结合蛋白是一种广泛存在于微生物和植物中的古老超蛋白家族，能结合Ⅰ型铜离子。植物
蓝铜结合蛋白超家族由质体兰素和 Phytocyanins（PCs）两个蛋白家族组成，它们间氨基酸序列相
似性
et al.，2001）。贝壳
杉烯
，也可为下一步根特异性启动子的克隆提供参考。
Aggel A，John I，Karvouni Z，Grierson D. 1997. Characterization of two cDNA clones for mRNAs expressed during ripening of melon（Cucumis
. Plant Molecular Biology，33：313–322.
gene family in Upland cotton（Gossypium hirsutum L.）. Theoretical and Applied
Chen
873.
um f. sp. vasinfectum. Molecular Plant-Microbe Interactions，17：654–667.
gene sequence. Plant Molecular Biology，75：
Guo
ular Biology，75：481–495.
较低（小于 20%），但该超家族蛋白均含有 1 个二硫键，能够形成 8 个 β–折叠结构。PCs 蛋白
家族分为 4 个亚家族：漆树蓝蛋白（Stellacyanins）、质体兰素（Plantacyanins）、花青苷（Uclacyanins）
和早期结瘤素样蛋白（early nodulin-like proteins，ENODLs）。目前已从大白菜、水稻等植物的基因
组中分别鉴别出 84 个和 62 个 PCs 编码基因（Ma et al.，2011；Li et al.，2013）。PCs 在植物的抗逆
过程中具有重要作用，参与非生物胁迫，如干旱、盐害、低温、金属离子等的反应过程（Ruan et al.，
2011；Wu et al.，2011）。但蓝铜结合蛋白的功能特别是早期结瘤素样蛋白的功能研究甚少，本研究
中发现的 contig 28 编码早期结瘤素样蛋白，尚未在柑橘中发现相关的报道。
贝壳杉烯酸氧化酶属于细胞色素 P450（CYP450）蛋白家族中的 CYP88A 亚家族，是赤霉素合
成过程中的一个关键酶，催化贝壳衫烯酸到 GA12 的三步反应过程（Helliwell
酸氧化酶的研究多限于突变体，玉米 dwarf3 基因是该亚家族第 1 个被克隆的基因（Winkler &
Helentjaris，1995），随后从拟南芥、大麦和豌豆中也克隆出该基因（Helliwell et al.，2001；Davidson
et al.，2003）。不仅贝壳杉烯酸氧化酶基因核苷酸序列的突变会造成植株的矮化，最近研究发现贝
壳杉烯酸氧化酶表达水平的变化也会对植物的株形造成影响，形成矮化变异株（欧春青 等，2013）
或影响花序的发育（Guo et al.，2012）。贝壳杉烯酸氧化酶基因在植物不同组织和不同发育阶段表
达，目前发现向日葵贝壳杉烯酸氧化酶基因 HaKAO2 主要在根中表达（Fambrini et al.，2011）。本
研究中也发现两个在枳根中高表达的贝壳杉烯酸氧化酶基因 singleton 52 和 contig 56，其在根中的表
达量分别是叶中的 130 和 11 倍，同时在根的消减文库中也发现其它的 P450 蛋白，但其组织表达特
性尚未进行深入研究。
本研究中通过构建枳根的消减文库，发现大量根中高表达基因，这不仅为柑橘基因工程育种丰
富了候选的外源功能基因

References
is
melo L.）fruits
Buriev Z T，Saha S，Abdurakhmonov I Y，Jenkins J N，Abdukarimov A，Scheffler B E，Stelly D M. 2010. Clustering，haplotype diversity and
locations of MIC-3：A unique root-specific defense-related
Genetics，120：587–606.
J Y，Dai X F. 2010. Cloning and characterization of the Gossypium hirsutum major latex protein gene and functional analysis in Arabidopsis
thaliana. Planta，231：861–
Davidson S E，Elliott R C，Helliwell C A，Poole A T，Reid J B. 2003. The pea gene NA encodes ent-kaurenoic acid oxidase. Plant Physiology，
131：335–344.
Dowd C，Wilson L W，McFadden H. 2004. Gene expression profile changes in cotton root and hypocotyl tissues in response to infection with
Fusarium oxyspor
Fambrini M，Mariotti L，Parlanti S，Picciarelli P，Salvini M，Ceccarelli N，Pugliesi C. 2011. The extreme dwarf phenotype of the GA-sensitive mutant
of sunflower，dwarf2，is generated by a deletion in the ent-kaurenoic acid oxidase1（HaKAO1）
431–450.
D，Wong W S，Xu W Z，Sun F F，Qing D J，Li N. 2011. Cis-cinnamic acid-enhanced 1 gene plays a role in regulation of Arabidopsis bolting.
Plant Molec
Guo X P，Li X L，Duan X W，Shen Y Y，Xing Y，Cao Q Q，Qin L. 2012. Characterization of sck1，a novel Castanea mollissima mutant with the
12 期 姚利晓等：应用抑制性消减杂交技术从枳中筛选根特异表达基因 2487
extreme short catkins and decreased gibberellin. PLoS One，7：e43181.
ational Academy of Sciences of the United States of America，98：
Huan
ught tolerance in tobacco via scavenging ROS and modulating expression of stress-responsive genes. BMC Plant Biology，
Huan
hose ectopic expression confers dehydration/drought tolerance in transgenic tobacco. Journal of Experimental Botany，62：5191–
Hwa
rray. Korean Journal of Genetics，26：207–213.
onditions. Plant Physiology，153：185–197.
y，136：2790–2805.
athogen. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，49：477.
Li G . Functional analysis of an Aspergillus ficuum phytase gene in Saccharomyces cerevisiae and its
trifoliata（L.）Raf. Acta Physiologiae Plantarum，32：271–279.
Chinese Bulletin of Botany，38：
学报，38：389–397.
Liu
trifoliata. Journal of Fruit Science，28 (5)：808–813. (in Chinese)
Lon is in leaves of Poncirus
Helliwell C A，Chandler P M，Poole A，Dennis E S，Peacock W J. 2001. The CYP88A cytochrome P450，ent-kaurenoic acid oxidase，catalyzes
three steps of the gibberellin biosynthesis pathway. Proceedings of the N
2065–2070.
g X S，Liu J H，Chen X J. 2010. Overexpression of PtrABF gene，a bZIP transcription factor isolated from Poncirus trifoliata，enhances
dehydration and dro
10：230.
g X S，Luo T，Fu X Z，Fan Q J，Liu J H. 2011. Cloning and molecular characterization of a mitogen-activated protein kinase gene from Poncirus
trifoliata w
5206.
ng E W，Lee H E，Byun M O，Kwon H B. 2004. RNA expression profiles of pepper（Capsicum annum）under StEREBP gene by using cDNA
microa
Jeong J S，Kim Y S，Baek K H，Jung H，Ha S H，Do Choi Y，Kim M，Reuzeau C，Kim J K. 2010. Root-specific expression of OsNAC10 improves
drought tolerance and grain yield in rice under field drought c
Kaur R，Singh K，Singh J. 2013. A root-specific wall-associated kinase gene，HvWAK1，regulates root growth and is highly divergent in barley and
other cereals. Functional & Integrative Genomics，13：167–177.
Kimbrough J M，Salinas-Mondragon R，Boss W E，Brown C S，Sederoff H W. 2004. The fast and transient transcriptional network of gravity and
mechanical stimulation in the Arabidopsis root Apex. Plant Physiolog
Kloos D U，Oltmanns H，Dock C，Stahl D，Hehl R. 2002. Isolation and molecular analysis of six taproot expressed genes from sugar beet. Journal
of Experimental Botany，53：1533–1534.
Kong K，Makabe S，Ntui V，Khan R S，Nakamura I. 2013. Transgenic tomato plants expressing two antifungal protein genes driven by a root-specific
AtNRT2.1 promoter confer resistance against root p
Li Feng-long，Yao Li-xiao，Ma Yuan-yuan，Chen Shan-chun. 2012. Advances in the studies of root-specific promoters. Journal of Anhui Agri Sci，
40 (15)：8417–8421，8446. (in Chinese)
李凤龙，姚利晓，马园园，陈善春. 2012. 植物根特异性启动子研究进展. 安徽农业科学，40 (15)：8417–8421，8446.
，Yang S，Li M，Qiao Y，Wang J. 2009
root-specific，secretory expression in transgenic soybean plants. Biotechnology Letters，31：1295–1301.
Li J，Gao G，Zhang T，Wu X. 2013. The putative phytocyanin genes in Chinese cabbage（Brassica rapa L.）：Genome-wide identification，
classification and expression analysis. Molecular Genetics and Genomics，288：1–20.
Lilley C J，Wang D，Atkinson H J，Urwin P E. 2011. Effective delivery of a nematode-repellent peptide using a root-cap-specific promoter. Plant
Biotechnology Journal，9：151–161.
Liu D C，He L G，Wang H L，Xu M，Sun Z H. 2010. Molecular cloning，characterization and expression analysis of PtrHOS1，a novel gene of cold
responses from trifoliate orange Poncirus
Liu Lin，Quan Xian-qing，Zhao Xiao-mei，Huang Li-hua，Feng Shang-cai，Huang Kun-yan，Zhou Xiao-yan，Su Wen-ting. 2013. Arabidopsis callose
synthase gene GSL8 is required for cell wall formation and establishment and maintenance of quiescent center.
389–397. (in Chinese)
刘 林，全先庆，赵小梅，黄力华，冯尚彩，黄坤艳，周晓燕，粟文婷. 2013. 拟南芥胼胝质合酶基因 GSL8 参与细胞壁形成和根端静
止中心建立与维持. 植物
Xiao-feng，Peng Ai-hong，Xu Lan-zhen，Lei Tian-gang，Yao Li-xiao，He Yong-rui，Chen Shan-chun. 2011. Studies of the integration and
expression of CjFRO2 gene in transgenic Poncirus
刘小丰，彭爱红，许兰珍，雷天刚，姚利晓，何永睿，陈善春. 2011. CjFRO2 在转基因枳中的整合与表达. 果树学报，28 (5)：808–813.
g G Y，Song J Y，Deng Z N，Liu J，Rao L Q. 2012. Ptcorp gene induced by cold stress was identified by proteomic analys
trifoliata（L.）Raf. Molecular Biology Reports，39：5859–5866.
Ma H，Zhao H，Liu Z，Zhao J. 2011. The phytocyanin gene family in rice（Oryza sativa L.）：Genome-wide identification，classification and

2488 园 艺 学 报 41 卷
transcriptional analysis. PLoS One，6：e25184.
Mhadhbi H，Fotopoulos V，Mylona P V，Jebara M，Aouani M E，Polidoros A N. 2013. Alternative oxidase 1（Aox1）gene expression in roots of
Medicago truncatula is a genotype-specific component of salt stress tolerance. Journal of Plant Physiology，170：111–114.
sed sequence tag
Nessl
O1）in pear. Acta Horticulturae Sinica，40 (5)：849–858. (in Chinese)
Pii Y
quired for the symbiotic interaction with Sinorhizobium meliloti. Molecular Plant-Microbe Interactions，22：1577–1587.
，141：
Rupe
MLP）gene down-regulated by ethylene during peach fruitlet abscission. Plant Science，163：265–272.
owth in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany，62：2899–2914.
es and Cells，30：369–376.
etry. Plant Molecular Biology Reporter，26：88–97.
co. Biotechnology Letters，32：1533–1539.
Nam M H，Heo E J，Kim J Y，Kim S I，Kwon K H，Seo J B，Kwon O，Jong S Y，Park Y M. 2003. Proteome analysis of the responses of Panax
ginseng C.A. Meyer leaves to high light：Use of electrospray ionization quadrupole-time of flight mass spectrometry and expres
data. Proteomics，3：2351–2367.
er C L，Allen R D，Galewsky S. 1985. Identification and characterization of latex-specific proteins in opium poppy. Plant Physiology，79：
499–504.
Ou Chun-qing，Jiang Shu-ling，Wang Fei，Wang Zhi-gang，Ma Li，Li Lian-wen. 2013. Cloning and expression analysis of ent-Kaurenoic acid oxidase
gene（PcKA
欧春青，姜淑苓，王 斐，王志刚，马 力，李连文. 2013. 梨贝壳杉烯酸氧化酶基因 PcKAO1 的克隆与表达分析. 园艺学报，40 (5)：
849–858.
，Astegno A，Peroni E，Zaccardelli M，Pandolfini T，Crimi M. 2009. The Medicago truncatula N5 gene encoding a root-specific lipid transfer
protein is re
Ruan X M，Luo F，Li D D，Zhang J，Liu Z H，Xu W L，Huang G Q，Li X B. 2011. Cotton BCP genes encoding putative blue copper-binding proteins
are functionally expressed in fiber development and involved in response to high-salinity and heavy metal stresses. Physiologia Plantarum
71–83.
rti B，Bonghi C，Ziliotto F，Pagni S，Rasori A，Varotto S，Tonutti P，Giovannoni J J，Ramina A. 2002. Characterization of a major latex
protein（
Sun H，Kim M K，Pulla R K，Kim Y J，Yang D C. 2010. Isolation and expression analysis of a novel major latex-like protein（MLP151）gene from
Panax ginseng. Molecular Biology Reports，37：2215–2222.
Wang H L，Tao J J，He L G，Zhao Y J，Xu M，Liu D C，Sun Z H. 2009a. cDNA cloning and expression analysis of a Poncirus trifoliata CBF gene.
Biologia Plantarum，53：625–630.
Wang J，Sun P P，Chen C L，Wang Y，Fu X Z，Liu J H. 2011. An arginine decarboxylase gene PtADC from Poncirus trifoliata confers abiotic stress
tolerance and promotes primary root gr
Wang M，Li D，Sun X，Zhu Y J，Nong H，Zhang J. 2009b. Characterization of a root-specific beta-thioglucoside glucohydrolase gene in Carica
papaya and its recombinant protein expressed in Pichia pastoris. Plant Science，177：716–723.
Winkler R G，Helentjaris T. 1995. The maize dwarf3 gene encodes a cytochrome P450-mediated early step in gibberellin biosynthesis. Plant Cell，7：
1307–1317.
Won S K，Choi S B，Kumari S，Cho M，Lee S H，Cho H T. 2010. Root hair-specific EXPANSIN B genes have been selected for Graminaceae root
hairs. Molecul
Wu F Z，Lu T C，Shen Z，Wang B C，Wang H X. 2008. N-terminal acetylation of two major latex proteins from Arabidopsis thaliana using
electrospray ionization tandem mass spectrom
Wu H，Shen Y，Hu Y，Tan S，Lin Z. 2011. A phytocyanin-related early nodulin-like gene，BcBCP1，cloned from Boea crassifolia enhances osmotic
tolerance in transgenic tobacco. Journal of Plant Physiology，168：935–943.
Xu X，Guo S，Chen K，Song H，Liu J，Guo L，Qian Q，Wang H. 2010. A 796 bp PsPR10 gene promoter fragment increased root-specific expression
of the GUS reporter gene under the abiotic stresses and signal molecules in tobac