全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（2）：375–380 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–11–01；修回日期：2012–01–03
基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（30900107）；广东省自然科学基金重点项目（9251063101000002）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：wangxj@scnu.edu.cn）
过量表达 tMEK2 基因的大岩桐植株对温度胁迫
的反应
孙姝兰 1，温秋香 1，代建丽 1，邢 惕 2，王小菁 1,*
（1 华南师范大学生命科学学院，广东省植物发育生物工程重点实验室，广州 510631；2 卡尔顿大学生物系，渥太华
K1S5B6，加拿大）
摘 要：构建番茄中 MAPKK 基因 tMEK2 的过量表达载体并转化到大岩桐中，通过 PCR 和 Southern
blot 鉴定出转基因株系并对其进行抗性分析。结果表明，转基因植株与对照相比叶片变小，叶片的叶绿素
含量显著增加，在 4 ℃低温和 40 ℃高温胁迫之后的恢复能力明显比对照增强。
关键词：大岩桐；tMEK2；过量表达；温度胁迫；恢复
中图分类号：S 68 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）02-0375-06

Responses of Sinningia speciosa Overexpressing tMEK2 to
Temperature Stresses
SUN Shu-lan1，WEN Qiu-xiang1，DAI Jian-li1，XING Tim2，and WANG Xiao-jing1,*
（1Guangdong Key Lab of Biotechnology for Plant Development，School of Life Sciences，South China Normal University，
Guangzhou 510631，China；2Department of Biology，Carleton University，Ottawa K1S5B6，Canada）
Abstract：We constructed a MAPKK gene from tomato，tMEK2 overexpressing construct to transform
into Sinningia speciosa. Transgenic plants were identified by PCR and Southern blotting analyses，and
their resistance to cold and high temperatures was analyzed. The results showed that the tMEK2
overexpressing plants had smaller leaves，increased contents of chlorophyll in leaves，and better recoveries
of plant growth after treatments with cold and high temperatures，compared to control of wild type plants.
Key words：Sinningia speciosa；tMEK2；overexpression；temperature stress；recovery of growth

大岩桐（Sinningia speciosa）为苦苣苔科（Gesneriaceae）大岩桐属，其生长需高温湿润环境（杨
鸿祚和陈少琼，1990），因此生产中需要培育耐寒、耐旱性强的新品系。
植物中有许多参与非生物胁迫的信号途径，MAPK 级联信号途径是其中最主要的途径之一
（Sinha et al.，2011）。MAPKs 在植物中参与高盐高渗、干旱、极端温度和各种病原诱导等生物和非
生物胁迫反应（Yu & Tang，2004）。水稻中的 DSM1 是一个 MAPKKK 激酶基因，可以通过活性氧清
除途径来介导干旱胁迫反应（Ning et al.，2010）。通过基因工程的方法，Shou 等（2004）在玉米中
组成型表达一个烟草中的 MAPKKK 基因可以提高转基因玉米对冷冻胁迫的耐受力。在许多植物中

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都发现 MAPK 途径与低温等胁迫的耐受有关。Teige 等（2004）发现拟南芥 AtMKK2 与冷、盐胁迫
相关。ANP1 是拟南芥叶片细胞中激活的一个特异的 MAPKK 基因，转 NPK1（ANP1 类似物）烟草
表现出对多种逆境的耐受力（Kovtun et al.，2000）。水稻 OsMKK6（OsMEKI）能够介导低温胁迫信
号（Wen et al.，2002）。MAPKs 不仅与低温胁迫反应相关，在玉米中 ZmMPK5 还与低温伤害后的恢
复有关（Berberich et al.，1999）。
Xing 等（2001）将番茄中的一个 MAPKK，tMEK2 的核心区丝氨酸和苏氨酸定点诱变，得到永
久活化状态的 tMEK2 突变。将 tMEK2 突变与植物组成型强启动子 tCUP 连接导入番茄原生质体进行
瞬时表达，发现 tMEK2 突变可诱导下游病原相关基因 PR1b1、PR3、Twi1 和伤害诱导基因 ER5 的表
达。另外，Xing 等发现番茄 tMEK2 与植物耐高温有关（个人通信）。
本研究中构建 tMEK2 过量表达载体并转化到大岩桐中，通过鉴定转基因株系并对其进行抗性分
析，期望得到具有耐寒和耐热等品质的抗性株系，为培育新的大岩桐的抗性株系提供一种方法。
1 材料与方法
1.1 供试材料与组织培养条件
供试材料为市售紫色花大岩桐（Sinningia speciosa）重瓣品种‘巨早’，2006—2008 年在华南师
范大学生命科学院生物园盆栽。
组织培养条件：光周期为 16 h 光照/8 h 黑暗，光照强度为 60 μmol · m-2 · s-1，温度为（24 ± 1）
℃，相对湿度为 70% ~ 80%。
诱芽培养基：MS + 2 mg · L-1 6-BA + 0.2 mg · L-1 NAA。继代培养基：MS + 1 mg · L-1 6-BA + 0.1
mg · L-1 NAA。生根培养基：MS + 0.1 mg · L-1 NAA。以上培养基均添加 30 g · L-1 蔗糖，固体培养基
则添加 8 g · L-1 琼脂，pH 5.8。
1.2 载体构建
含 tMEK2 的质粒由加拿大卡尔顿大学 Dr. Tim Xing 惠赠。用如下引物进行 PCR 扩增。5′引物（添
加 XbaⅠ位点）：AGTCTAGAATGAAGAAAGGATCTTTTGCACC；3′引物（添加 SacⅠ位点）：GAGA
GCTCTTATAGCTCAGTAAGTGTTGCCA。产物连接到 pMD T-18 克隆载体上，经 XbaⅠ和 SacⅠ双酶
切之后连接到 pIB1 上，经 EcoRⅠ和 HindⅢ双酶切将 p35S 与 tMEK2 共同连接到表达载体 pBin19 上。
1.3 根癌农杆菌介导 tMEK2 转化大岩桐
取大岩桐幼嫩叶片为外植体，70%酒精消毒 30 s，10% NaClO 消毒 10 min 后，将叶片切成 0.5 cm2
的方块，近轴面朝下接种到诱芽培养基上。培养 50 d 后几乎所有外植体都能分化出不定芽。将叶片
上分化出的幼芽切下，转到继代培养基上，1 周后形成小侧芽，随着培养时间的延长，侧芽逐渐长
大成为无菌苗。
取无菌苗长势良好的叶片，将叶片切成 0.5 cm2 的方块，近轴面朝下接种到诱芽培养基上。预培
养 2 d 后，用培养至 OD600 = 0.5 ~ 0.6 的含 tMEK2 农杆菌 LBA4404 菌株浸染 10 min，用无菌吸水纸
吸去多余菌液。将浸染后的叶片接种在含 100 mol · L-1乙酰丁香酮的诱导培养基中 25 ℃暗培养 4 d。
将共培养后的叶片用无菌水洗 4 次，无菌吸水纸吸干，接种于含有 150 mg · L-1 Kan、200 mg · L-1 Cef
的诱导培养基上进行抗性幼芽的筛选。将分化的抗性幼芽切下，转入含有 10 mg · L-1 Kan、200 mg · L-1
Cef 生根培养基上进行生根得到候选转基因植株。待幼苗长至 4 ~ 5 cm 高时，洗去根上附着的培养
基，移入装有蛭石的营养钵中，用保鲜膜保湿 1 周，用于分子鉴定和表型分析。
2 期 孙姝兰等：过量表达 tMEK2 基因的大岩桐植株对温度胁迫的反应 377

1.4 PCR 检测和 Southern blot 分析
PCR 检测：CTAB 常规方法提取大岩桐基因组 DNA，使用 1.3 中引物进行 PCR。反应条件为：
94 ℃ 5 min； 94 ℃ 1 min；55 ℃ 1 min；72 ℃ 2 min；30 个循环；72 ℃ 10 min。1%琼脂糖凝胶电
泳检测。扩增产物长度为 1.1 kb。
Southern 杂交：以 NPTⅡ的引物 Primer 1（5′-GGTGCCCTGAATGAACTGAC-3′）和 Primer 2
（5′-TAGCCAACGCTATGTCCTGA-3′）进行 PCR 扩增，以已定量 PCR 回收产物作为探针，用 DIG
标记试剂盒进行标记。DNA探针标记的制备、定量与检测方法参照DIG标记试剂盒说明书（DIG High
Prime DNA Labeling and Detection Starter kit Ⅱ）。以 SDS 法大量提取大岩桐基因组 DNA，取 20 g
DNA，用 HindⅢ在 37 ℃下酶切过夜，将酶切产物回收并进行 1%琼脂糖胶电泳 12 h。转移到尼龙膜
上，80 ℃烘 2 h 后进行预杂交，杂交，于暗室中将尼龙膜置于 X-ray 盒中，照相记录结果（Sambrook
et al.，1989）。
1.5 叶片生物量和叶绿素含量的测定
依薛应龙（1985）的方法测量叶面积。将叶片的右半部分用直径为 1.5 cm 的打孔器在相应部位
打孔，得到 6 片叶圆片，分 3 份，称鲜样质量后在烘箱烘干，再称干样质量。
叶片用直径为 1.5 cm 的打孔器打孔，得到 6 片叶圆片，分 3 份，提取叶绿素，用分光光度计分
别在波长 654 nm 和 663 nm 处测定光吸收值（A）（Arnon，1949）。计算叶绿素含量。
1.6 转基因植株抗性分析
对高温的抗性分析：大岩桐生长适宜温度为 25 ~ 35 ℃。将转化 tMEK2 大岩桐植株与对照各 20
株放置于光照培养箱中，40 ℃高温处理 3 d，其它培养条件不变，统计近根部的茎部受伤时间（12 h
统计 1 次），高温处理 3 d 后转移到 25 ℃下恢复，统计恢复率。重复 3 次。
对低温的抗性分析：将转化 tMEK2 大岩桐植株与对照各 20 株放置于光照培养箱中，关闭加湿
器，其它培养条件不变，4 ℃低温处理 3 d。参照文献（Sememuk & Voline，1986；王孝宣 等，1996；
樊治成 等，1999）将大岩桐对低温的敏感性分级。0 级：植株正常；1 级：顶部叶片开始萎蔫；2
级：距离顶部最近的第 2 对叶片开始萎蔫；3 级：基部叶片开始萎蔫。统计至各级所需时间。低温
处理 3 d 后转移到 25 ℃下恢复，统计恢复指标。0 级：受伤面积 ≥ 4/5；1 级：1/2 ≤ 受伤面积 < 4/5，
受伤斑点数 ≥ 3 个；2 级：受伤面积 < 1/2，受伤斑点数 ≥ 3 个；3 级：1/2 ≤ 受伤面积 < 4/5，
受伤斑点数 < 3 个；4 级：受伤面积 < 1/2，受伤斑点数 < 3 个；5 级：叶片基本恢复。重复 3 次。
2 结果与分析
2.1 PCR 和 Southern blot 鉴定结果
以候选转 tMEK2 基因植株的基因组 DNA 为模板，采用双特异性引物进行扩增，1 和 3 泳道的
候选转基因植物得到了约 1.1 kb 的 DNA 片段，与已知的 tMEK2 片段大小相符，表明 tMEK2 已整合
到其基因组中（图 1）。
NPTⅡ和 tMEK2 共同位于 pBin19 载体的 T-DNA 区。农杆菌介导外源基因转化大岩桐时，其载
体的 T-DNA 区整合到被转化植株中。因此，提取具有卡那霉素抗性植株的基因组 DNA，用 HindⅢ
单酶切，以抗性基因 NPTⅡ为探针进行 Southern blot 杂交鉴定。杂交结果表明，对照植株没有杂交
信号，而 tMEK2 候选转基因植株有杂交信号，表明其为转基因植株（图 2）。
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2.2 大岩桐转 tMEK2 基因植株的表型分析
大岩桐转 tMEK2 基因植株与对照相比，其叶片变小，颜色变深，呈深绿色（图 3）。取植株第 2
对叶测定各项指标，发现植株叶面积减小，干质量和鲜质量也明显下降，但是叶片叶绿素含量比对
照高 22.53%（表 1）。

图 3 tMEK2 转基因植株表型
Fig. 3 The phenotype of tMEK2 transgenic plants

表 1 大岩桐转 tMEK2 基因植株叶片生物量和叶绿素含量
Table 1 Biomass and content of chlorophyll in leaves of tMEK2 transgenic plants
植株
Plant
叶片面积/ cm2
Leaf area
叶片总鲜质量/ g
The total leaf fresh
weight
叶片总干质量/ g
The total leaf dry
weight
叶绿素含量/ (mg · g-1)
Chlorophyll content
对照 Control
tMEK2 转基因植株
tMEK2 transgenic plants
190.66 ± 10.38 A
92.95 ± 12.65 B
11.73 ± 2.60 A
5.07 ± 2.96 B
0.63 ± 0.12 A
0.30 ± 0.18 B
0.71 ± 0.024 a
0.87 ± 0.031 b
注：不同大写字母和小写字母分别表示在 0.01 和 0.05 水平上差异显著。
Note：The different capital or small letter indicate significance at P = 0.01 or 0.05 level.
2.3 转 tMEK2 基因大岩桐植株对高温的抗性分析
转 tMEK2 基因植株组培苗经 40 ℃高温处理 3 d 后，与对照相比对高温的抗性并没有增强，相
反，受伤害率（100%）高于对照（75%）（表 2）。然而，将高温处理 3 d 后的对照和转基因植株转
图 1 候选转基因植株的 tMEK2 片段扩增
M：DNA marker（DL2000）；1 ~ 3：候选转基因植株。
4：未转化对照植株。
Fig. 1 PCR amplification of tMEK2 in candidate transgenic plants
M：DNA marker（DL2000）；1–3：Candidate transgenic plants；
4：Untransformed plant（control）.
图 2 候选转基因植株的 NPTⅡ基因 Southern blot 鉴定
+：重组质粒；1 ~ 4：候选转基因植株；
–：未转化对照植株。
Fig. 2 Southern blot of candidate transgenic plants
+：Recombination plasmid；1–4：Candidate transgenic plants；
–：Untransformed plant（control）.
2 期 孙姝兰等：过量表达 tMEK2 基因的大岩桐植株对温度胁迫的反应 379

表 2 转 tMEK2 基因植株受 40 ℃高温受伤害率
Table 2 Percentage of injured plants by 40 ℃ high
temperature of tMEK2 transgenic plants / %
处理时间/ h
Time of treatment
对照
Control
转基因植株
Transgenic plants
0 0 0
24 0 a 10 ± 10 b
48 0 a 10 ± 10 b
72 75 ± 10 a 100 ± 0 b
P = 0.05.
表 3 转 tMEK2 基因植株 4 ℃低温处理下至各级伤害所需时间
Table 3 Time of tMEK2 transgenic plants to different injury
level under 4 ℃ treatment /h
伤害级数
Injury level
对照
Control
转基因植株
Transgenic plants
0 0 0
1 43.2 ± 3.4 a 30.0 ± 7.2 b
2 44.4 ± 5.1 a 32.4 ± 4.8 b
3 45.6 ± 5.6 a 36.0 ± 3.5 b
P = 0.05.
表 4 tMEK2 转基因植株对低温伤害的恢复能力
Table 4 Recovery ability of tMEK2 transgenic plants after
injured by low temperature
对照 Control 转基因植株 Transgenic plants恢复级数
Recovery
level
株数
Plant
number
%
株数
Plant
number
%
0 30 25.00 ± 3.35 a 22 18.33 ± 5.60 b
1 20 16.67 ± 4.23 a 26 21.67 ± 2.28 b
2 35 29.17 ± 6.73 A 10 8.33 ± 2.15 B
3 0 0 a 4 3.33 ± 0.64 b
4 25 20.83 ± 2.67 a 30 25.00 ± 2.25 a
5 10 8.33 ± 1.92 A 28 23.33 ± 3.16 B
注：大写和小写字母分别表示在 0.01 和 0.05 水平上差异显著。
Note：The different capital or small letter indicate significance at P =
0.01 or 0.05 level.
移到 25 ℃下恢复 4 d，恢复率分别为 40%和 50%，说明转 tMEK2 基因植株高温处理后的恢复能力
比对照好。
2.4 转 tMEK2 基因大岩桐植株对低温的抗性
分析
将对照和转 tMEK2 基因植株组培苗移栽
40 d 后在光照培养箱 4 ℃低温下处理 3 d，统计
至各级伤害程度所需的时间。结果表明，转基
因植株对低温更加敏感，达到 1、2 和 3 级伤害
的时间比对照早（表 3）。然而，低温 4 ℃处理
3 d 后，将植株转移到 25 ℃恢复 4 d 统计恢复
率，结果表明 tMEK2 转基因植株恢复能力比对
照强，恢复到 5 级的植株比例比对照高 15%（表
4）。
3 讨论
大岩桐的营养生长阶段过长，为了促进其早开花，Zhang 等（2008）在大岩桐中转入黄瓜的 LEAFY
同源基因 CFL，结果转基因株系在不外施赤霉素的情况下能够促进早开花。目前，无论是农作物还
是花卉植物都需要对生物和非生物胁迫的抗性进行改良。
MAPK 信号转导级联途径是植物中普遍的、重要的信号转导途径，它参与植物生物胁迫、非生
物胁迫等信号的转导（Tena et al.，2001）。本研究中通过在大岩桐中过量表达 tMEK2，发现转基因
植株与对照相比其叶面积减小，叶片的叶绿素含量显著增加，并且当受到低温或高温胁迫时转基因
植株的恢复能力明显比对照增强。这种对逆境胁迫恢复能力的增强推测可能与转基因植株的生理状
态密切相关。Zhang 等（2010）在拟南芥中转入小麦编码蔗糖非酵解相关蛋白激酶的 TaSnRK2.8 基
因后其抗盐、抗低温等能力增强，而且其叶绿素含量也明显增加，推测与更强的光合效率有关。大
岩桐 tMEK2 转基因植株经极端温度处理后其恢复能力的增强可能也与叶绿素含量增加导致的光合
效率增强有关。大岩桐转 tMEK2 基因植株其叶片变小可能也是其抗逆性更强的因素之一。Achard
等（2006）对拟南芥中 GA 信号途径中的抑制因子 5 个 DELLA 基因中 4 个基因的突变体进行杂交得
到 DELLA 基因的 4 个突变体进行分析，结果表明 DELLA 依赖的拟南芥生长抑制与其在逆境环境下
促进生长有关，因此推测大岩桐 tMEK2 转基因植株变小可能与经极端温度处理后其恢复能力的增强
有关系。另外，tMEK2 可以诱导一些抗性基因和伤害诱导基因的表达（Xing et al.，2001），对于一
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些病原菌的生物胁迫或者伤害 tMEK2 是否有作用还需要进一步的研究。

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