全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（6）：1035–1044 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–01–04；修回日期：2012–05–25
基金项目：江苏省自然科学基金项目（BK2011067）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：nnzsl@njau.edu.cn）
桃自交亲和性的分子机制及遗传特性研究
许高歌，吴华清，吴 俊，王 超，齐开杰，张绍铃*
（南京农业大学园艺学院，南京 210095）
摘 要：以油桃（Prunus persica var. necturina）‘中油 5 号’及其自交后代为试材，利用花柱 S-RNase
基因和花粉 SFB 基因的特异性引物进行 PCR 扩增，对扩增片段进行回收、克隆、测序和 Blast 分析，确
定了‘中油 5 号’的自交不亲和基因型为 S1S2(m)。序列分析结果显示，‘中油 5 号’桃 S1-RNase 和 S2(m)-RNase
与多个其他李属 S-RNase 基因氨基酸和核苷酸序列间都具有极高的相似性，SFB1 和 SFB2 基因与多个其他
李属 SFB 基因氨基酸和核苷酸序列间也都具有极高的相似性。进一步对‘中油 5 号’自交后代个体的 S
基因型进行检测，发现后代群体中存在 3 种 S 基因型，分别为 S1S1、S1S2(m)和 S2(m)S2(m)，且分离比为 8︰13︰
7，与预期的比例 1︰2︰1 差异不显著（χ2 = 0.214 < χ20.05,2 = 5.991），说明 S-RNase 基因和 SFB 基因都遵循
两因素的孟德尔遗传规律进行连锁分离。此外，基因型为 S1S1 和 S2(m)S2(m)的纯合体的存在，表明桃花粉
SFB1 和 SFB2基因均不能被自身花柱 S-RNase 所识别，这是由于 SFB1 和 SFB2基因翻译提前终止所造成的，
从而使‘中油 5 号’表现出自交亲和性。
关键词：桃；花柱 S-RNase 基因；花粉 SFB 基因；自交亲和
中图分类号：S 662.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）06-1035-10

Molecular Mechanism and Genetic Characterization of Self-compatibility
in Peach
XU Gao-ge，WU Hua-qing，WU Jun，WANG Chao，QI Kai-jie，and ZHANG Shao-ling*
（College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）
Abstract：PCR were performed with specific primer sets of Prunus S-RNase and SFB alleles using
‘Zhongyou 5’（Prunus persica var. necturina）as the template. The amplification products were
extracted，cloned，sequenced and then Blast analysis，which were used to determine the S-genotype of this
cultivar，S1S2(m). Sequence analysis showed that Prunus persica S1-RNase and S2(m)-RNase alleles have
exceptionally high identities with other Prunus S-RNase alleles，and，SFB1 and SFB2 alleles have
exceptionally high identities with other Prunus SFB alleles，too. The S-genotypes of self-pollinated
progeny of‘Zhongyou 5’were detected，it is obviously that three classes were found in progeny，and the
segregation ratio of S1S1，S1S2(m) and S2(m)S2(m) was 8︰13︰7，which did fit to the expected ratio that was
1︰2︰1（χ2 = 0.214 < χ20.05,2 = 5.991）. This result showed that S-RNase and SFB alleles are tightly
co-segregation according to the Mendel genetic model. Moreover，the existence of S1S1 and S2(m)S2(m)
homozygotes suggested that SFB1 and SFB2 could not be cognized by self S-RNase，due to that the protein

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of these two SFB alleles were premature，which resulted in the‘Zhongyou 5’is self-compatible.
Key words：peach；S-RNase；SFB；self-compatibility

自交不亲和性是被子植物防止近亲繁殖、促进远缘杂交的一种遗传机制（Sijacic et al.，2004）。
蔷薇科大部分果树表现 S-RNase 介导的配子体型自交不亲和，该自交不亲和性是由具有复等位基因
的单一位点即 S 基因座控制，它至少包含一个在花柱中特异性表达的花柱 S 基因和一个在花粉中特
异性表达的花粉 S 基因（McCubbin et al.，2000）。控制花柱自交不亲和性的是一种具有 RNase 活性
的 S 糖蛋白，称为 S-RNase，它能分解来自相同基因的花粉 rRNA 和 mRNA（Kao，1994），从而抑
制离体花粉管生长（Jahnen et al.，1989）。控制花粉自交亲和性的是一种 F-box 蛋白，称为 SFB
（S-haplotype-specific F-box protein）（Ushijima et al.，2003；Yamane et al.，2003a；Sonneveld et al.，
2005）或 SLF（Entani et al.，2003）。相同 S 基因的花柱和花粉 S 基因产物的相互识别会导致自交不
亲和性反应（McCubbin et al.，2000）。
近年来，随着分子生物学技术的不断发展，许多花柱 S-RNase 基因已经从甜樱桃 Prunus avium
（Tao et al.，1999；Sonneveld et al.，2003；Vaughan et al.，2008）、扁桃 P. dulcis（Ma & Oliveira，
2001；Ortega et al.，2006）、杏 P. arminica（Romero et al.，2004；Halász et al.，2005；Vilanova et al.，
2006；Wu et al.，2009）、李 P. salicina（Beppu et al.，2002；Sapir et al.，2004；Halász et al.，2007；
Zhang et al.，2008）和梅 P. mume（Tao et al.，1999；Yaegaki et al.，2001；Heng et al.，2008）等李
属自交不亲和果树中分离出来。花粉 SFB/SLF 基因与花柱 S-RNase 基因紧密连锁（Entani et al.，2003；
Ushijima et al.，2003；Yamane et al.，2003b；Romero et al.，2004；Zhang et al.，2007）。花粉 SFB
基因也已经从甜樱桃（Ikeda et al.，2004；Ushijima et al.，2004；Sonneveld et al.，2005；Vaughan et
al.，2006）、扁桃（Ushijima et al.，2003；郭振宇 等，2006；Šurbanovski et al.，2007）、杏（Vilanova
et al.，2006；Wu et al.，2009；吴俊 等，2010）、李（Zhang et al.，2007）和梅（Entani et al.，2003；
Yamane et al.，2003b）中分离出来。
桃（Prunus persica Lindl.）也属于蔷薇科李属配子体果树，但二倍体桃表现出自交亲和。不同
于其他李属果树，在桃物种中仅发现了两种不同的 S 基因，分别为 S1 和 S2（Hegedüs et al.，2006；
Tao et al.，2007）。Tao 等（2007）对 S1 和 S2 这两个 S 单元型基因序列进行分析时，发现 SFB1 和 SFB2
基因中都有碱基片段的插入，并导致翻译的提前终止。此外，一些桃品种的 S2-RNase 在 C5 区的第
6 个保守的半胱氨酸被酪氨酸替换，从而失去 S-RNase 活性（Tao et al.，2007）。然而，前人对桃自
交亲和性的研究焦点都集中在桃自身品种上，至今还没有关注两个 S 基因的遗传模式。
本研究中以含有两个不同 S 单元型的油桃品种‘中油 5 号’为试材，通过对自交后代种子 S 基
因型的鉴定，以期明确桃自交亲和性机制。
1 材料与方法
1.1 材料
材料采自南京农业大学江浦农场园艺站桃品种园，品种为‘中油 5 号’（Prunus persica var.
necturina），系中国农业科学院郑州果树研究所以‘瑞光 3 号’油桃为母本、‘五月红’桃为父本杂
交育成。于 2011 年春季采集幼嫩叶片，经液氮速冻后保存于–20 ℃冰箱中。
2011 年夏季采集到 28 粒‘中油 5 号’的自交后代种子，去掉种皮，经液氮速冻后保存于–20 ℃
冰箱中备用。
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ExTaq、pMDl9-T Vector 和 DNA 回收试剂盒购自 TaKaRa 公司，其他药品购自上海生工生物技
术服务有限公司。
1.2 基因组 DNA 提取
采用本实验室改良的 CTAB 法（张妤艳 等，2006）提取各试材基因组 DNA，80 V 电压下取
3 μL 基因组 DNA 在 1%琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下检测 DNA 的纯度和完整性，并于–20 ℃保
存备用。
1.3 S-RNase 的 PCR 扩增
依据蔷薇科的 S-RNase 基因上的 5 个保守区（Cl、C2、C3、RC4 和 C5），并结合 Tao 等（1999）
的引物设计，形成引物组合 PSF-C1/PSR-C5，由上海英骏生物技术公司合成。引物序列分别为：PSF-
C1：5′-TATTTTCAATTTGTGCAACAATGG-3′；PSR-C5：5′-TACCACTTCAT GTAACAACTGAG- 3′。
PCR 反应体系：25 μL，包括 2.5 μL 10 × buffer，DNA 模板 100 ng；0.2 mmol · L-1 dNTP，0.1
μmol · L-1 正、反向引物，2.0 mmol · L-1 MgCl2，1 U 的 Taq 酶。反应条件：94 ℃预变性 3 min；94 ℃
变性 30 s，53 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min，35 个循环；72 ℃延伸 10 min。PCR 反应所用 TaqDNA
聚合酶购自宝生物工程（大连）有限公司。应用 PTC-200 扩增仪进行扩增。取 PCR 产物 5 μL，1.2%
琼糖胶电泳检测 PCR 产物。
1.4 SFB 的 PCR 扩增
参照 Zhang 等（2007）的引物设计，使用可获得 95% SFB 基因序列的引物组合：PsSFB-F
5-GAAATCGTAATCGACATCCTCGTAAG-3；PsSFB-R 5-CACGAATTCGATTTCGTCATATTTC-3。
PCR 反应体系：DNA 模板 100 ng；0.2 mmol · L-1dNTP，0.1 μmol · L-1 正、反向引物，1.5 mmol · L-1
MgCl2，1 U 的 Taq 酶。反应条件：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延
伸 1 min 45 s，35 个循环；72 ℃延伸 10 min。使用 1.2%琼糖凝胶电泳检测 PCR 产物。
1.5 PCR 扩增产物的回收、测序与序列分析
利用 UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒回收经 2%琼脂糖凝胶电泳后的 PCR 扩增片段。将
S-RNase 基因和 SFB 基因目的片段与 PMD19-T 载体 16 ℃条件下连接 2 h，连接产物转化大肠杆菌
DH5α 感受态细胞。DNA 序列由北京六合华大基因科技股份有限公司测定，测序结果在 NCBI 中利
用 BLAST 与 GenBank + EMBL + DDBJ + PDB 等数据库已知序列比较，再应用 DNAMAN 对 DNA
序列进行分析，进而确定其 S 基因型。
2 结果与分析
2.1 桃 S-RNase 的克隆与序列分析
以‘中油 5 号’基因组 DNA 为模板，用引物组合 PSF-C1/ PSF-C5 进行 PCR 扩增，得到大小约
为 1 600 bp 和 800 bp 的两个不同的扩增产物（图 1）。
将这两个扩增产物经琼脂糖凝胶电泳并回收后，进行克隆和测序。测序结果在 GenBank 中进行
BLAST 比较，发现大小约为 1 600 bp 的片段与桃 S1-RNase（GenBank 登录号：AB252415）序列完
全一致，大小约为 800 bp 的片段与桃 S2-RNase（AB252417）以及 S2m-RNase（AB597186）序列也
完全一致，从而确定‘中油 5 号’的 S 基因型为 S1S2(m)。
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图 1 油桃‘中油 5 号’S-RNase 和 SFB 等位特异 PCR 扩增产物的电泳图
Fig. 1 Electrophoresis pattern of PCR amplification of genomic DNA with S-RNase gene and SFB gene
allelic-specific primers on ‘Zhongyou 5’nectarine

本研究中所克隆获得的 S1-RNase 含有一个大小为 1 075 bp 的内含子序列和 513 bp 的外显子序
列，可编码 171 个氨基酸残基；S2-RNase 含有一个大小为 341 bp 的内含子序列和 510 bp 的外显子
序列，可编码 170 个氨基酸残基。这些得到的氨基酸序列含有 5 个保守区域 C1、C2、C3、RC4 和
C5，一个活跃位点 RHV（图 2）。
BLAST 比较发现桃 S1-RNase 与扁桃 Sk-RNase（AB252409）的氨基酸序列完全相同，编码核苷
酸序列同源性可达到 99.61%，第 2 内含子序列同源性 97.69%；与紫叶李 S3-RNase（AM746943）氨
基酸序列同源性为 98.82%，编码核苷酸序列同源性为 99.02%。桃 S2-RNase 与李 Sa-RNase（AB252411）
的氨基酸序列同源性为 98.82%，编码核苷酸序列同源性也为 98.82%，内含子序列同源性为 83.87%；
与甜樱桃 S30-RNase（DQ266442）的氨基酸序列同源性为 98.17%，编码核苷酸序列同源性也为
97.77%，内含子序列同源性为 95.01%。



图 2 ‘中油5号’S-RNase与桃S-RNase的氨基酸序列比对结果
方框内为蔷薇科李属 S-RNase 结构的 5 个保守区（C1 ~ C3，RC4，C5）和 1 个高变区（RHV）。Pp：桃 Prunus persica；
PpS1-RNase：‘中油 5 号’S1-RNase；PpS2-RNase：‘中油 5 号’S2(m)-RNase。
Fig. 2 Alignment of the deduced amino-acid sequences of S-RNase from‘Zhongyou 5’and peach
Five conserved domains of Rosaceous S-RNase（C1–C3，RC4，C5）and one Rosaceous hypervariable region（RHV）are boxed.
Pp：P. persica；PpS1-RNase：S1-RNase gene of‘Zhongyou 5’；PpS2-RNase：S2(m)-RNase gene of‘Zhongyou 5’.

2.2 桃 SFB 的克隆与序列分析
以‘中油 5 号’及其自交后代的基因组 DNA 为模板，用引物组合 PsSFB-F/PsSFB-R 进行 PCR
扩增，得到大小分别为 1 211 bp 和 1 064 bp 的两个不同的产物（图 1），经琼脂糖凝胶电泳并回收后，
进行测序分析。测序结果在 GenBank 中进行 BLAST 比较，大小为 1 211 bp 的扩增序列与桃 SFB1
基因（AB252414）核苷酸序列同源性高达 99.67%（图 3），而大小为 1 064 bp 的扩增序列与桃 SFB2
基因（AB252416）核苷酸序列同源性高达 99.62%（图 4）。此外，序列比较发现‘中油 5 号’的 SFB1
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基因与扁桃的 SFBk（AB252408）的核苷酸序列同源性高达 99.43%，氨基酸序列比较显示出两基因
仅在 C 端存在很大的差异，而核苷酸序列比较发现桃 SFB1 基因在 C 端存在一段大小为 155 bp 的插
入片段，该片段的插入使得 SFB1基因翻译异常（图 5）。‘中油 5 号’的 SFB2基因和李 SFBa（AB252410）
基因的核苷酸序列同源性也高达 98.49%，氨基酸序列比较显示桃 SFB2 基因缺失了 C 端的变区 V2、
HVa 和 HVb（图 5），核苷酸序列比较发现桃 SFB2 基因序列中存在一段 5 bp 的插入片段，该片段的
插入导致 C 端序列的不能正常翻译（图 5）。因此，桃 SFB1 和 SFB2 基因序列的异常翻译是导致‘中
油 5 号’呈现出自交亲和的原因所在。
图 3 ‘中油 5 号’SFB1 与桃 SFB1、扁桃 SFBk 基因核苷酸序列的比对结果
Pd：扁桃；Pp：桃；PpSFB1：‘中油 5 号’SFB1 基因。
Fig. 3 Alignment of nucleotide sequences of SFB1 from‘Zhongyou 5’and other Prunus species
Pd：P. dulcis；Pp：P. Persica；PpSFB1：SFB1 gene of‘Zhongyou 5’.

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图 4 ‘中油 5 号’SFB2 与桃 SFB2、李 SFBa 基因核苷酸序列的比对结果
Ps：李；Pp：桃；PpSFB2：‘中油 5 号’SFB2 基因。
Fig. 4 Alignment of nucleotide sequences of SFB from‘Zhongyou 5’and other Prunus species
Ps：P. salicina；Pp：P. Persica；PpSFB2：SFB2 gene of‘Zhongyou 5’.

2.3 ‘中油 5 号’自交后代中 S 基因的遗传特性
分别用引物对 PSF-C1/PSF-C5 和 PsSFB-F/PsSFB-R 对‘中油 5 号’和其 28 粒自交后代种子进
行 PCR 扩增，扩增结果显示出后代群体具有 3 种不同的 S 基因型，分别为 S1S1、S1S2(m)和 S2(m)S2(m)
（图 6，图 7），且分离比为 8︰13︰7，与预期的比例 1︰2︰1 没有显著的差异（χ2 = 0.214 < χ20.05,2 =
5.991），符合孟德尔遗传规律，进一步说明桃 S1 单元型和 S2(m)单元型均表现出自交亲和性。此外，
扩增结果显示出花粉 SFB1 和 SFB2 基因始终分别与它们自身的花柱 S-RNase 基因共同分布在后代的
任一个体中，表明桃 SFB1 与 S1-RNase 以及 SFB2 与 S2(m)-RNase 都是连锁遗传至后代个体。

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图 5 ‘中油 5 号’与李属其它物种 SFB 的氨基酸序列比对结果
黑框中为蔷薇科李属 SFB 基因结构的 F-box motif、两个变区（V1、V2）和两个高变区（HVa、HVb）。
Pd：扁桃；Ps：李；Pp：桃；PpSFB1：‘中油 5 号’SFB1 基因；PpSFB2：‘中油 5 号’SFB2 基因。
Fig. 5 Alignment of the deduced amino-acid sequences of SFB from peach and other Prunus species
F-box motif，two variable（V1 and V2），and two hypervariable（HVa and HVb）regions are boxed.
Pd：P. dulcis；Ps：P. salicina；Pp：P. Persica；
PpSFB1：SFB1 gene of‘Zhongyou 5’；PpSFB2：SFB2 gene of‘Zhongyou 5’.



图 6 ‘中油 5 号’及其自交后代 S-RNase 基因等位特异 PCR 扩增产物的电泳图
M：Marker；1：‘中油 5 号’；2 ~ 29：‘中油 5 号’的自交后代。
Fig. 6 Electrophoresis pattern of PCR amplification of genomic DNA with S-RNase gene allelic-specific primers on peach cultivars
M：Marker；1：‘Zhongyou 5’；2–29：The selfprogeny of‘Zhongyou 5’.
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图 7 ‘中油 5 号’及其自交后代 SFB 基因等位特异 PCR 扩增产物的电泳图
M：Marker；1：‘中油 5 号’；2 ~ 29：‘中油 5 号’的自交后代。
Fig. 7 Electrophoresis pattern of PCR amplification of genomic DNA with SFB gene allelic-specific primers on peach cultivars
M：Marker；1：‘Zhongyou 5’；2–29：The selfprogeny of‘Zhongyou 5’.

3 讨论
本研究中利用等位基因 PCR 技术从桃品种‘中油 5 号’及其自交后代个体中分别克隆出了 S1-
RNase、S2(m)-RNase、SFB1 和 SFB2 基因片段，发现 SFB1 与 S1-RNase 以及 SFB2 与 S2(m)-RNase 都能
稳定的连锁遗传至后代个体中，且都符合双因素遗传的孟德尔规律，从而确定了该自交亲和品种的
S 基因型为 S1S2(m)。序列分析显示出桃的两个 S-RNase 基因具有典型的李属 S-RNase 基因结构特征，
含有全部的 5 个保守区（C1、C2、C3、RC4 和 C5）和 1 个相对高变区（RHV）结构（图 2）。同时，
桃 SFB1 和 SFB2 基因也都具有典型的李属 SFB 基因结构特征。然而，155 bp 的碱基插入使得 SFB1
基因 C 端氨基酸序列翻译异常并提前终止翻译，而 5 bp 碱基的插入也同样致使 SFB2 基因翻译的提
前终止（Tao et al.，2007）。由于这两个 SFB 基因都只能形成短截蛋白，导致它们都不能被自身的花
柱 S-RNase 所识别，从而致使含有这两个基因的桃品种均表现出自交亲和。同样的变异类型也存在
于其它李属物种中，如含有 SFBc 基因的杏品种（Vilanova et al.，2006）、含有 SFB3′、SFB4′或 SFB5′
的甜樱桃品种（Ushijima et al.，2004；Sonneveld et al.，2005；Marchese et al.，2007）和含有 SFBf
的扁桃品种（Ushijima et al.，2004）等都因 SFB 基因翻译的提前终止而表现出自交亲和性。
序列间比较发现，桃 S1-RNase 基因与扁桃 Sk-RNase 基因以及桃 S2(m)-RNase 基因与李 Sa-RNase
基因的氨基酸和核苷酸序列间的同源性极高，即使是位于相对高变区（RHV）中的内含子序列间的
同源性也同样很高。RHV 是一个正向选择区域，该区域中核苷酸序列的插入、缺失以及碱基替换的
频率很高（Ishimizu et al.，1998），是花柱 S-RNase 识别自身花粉 SFB 基因的关键位点之一（Wünsh
& Hormaza，2004）。该区域序列间的高保守性充分说明李属植物 S-RNase 基因的进化在物种分化之
前（Ushijima et al.，1998；Igic & Kohn，2001）。因核苷酸片段的插入，桃 SFB1 和 SFB2 基因 C 端
序列均翻译异常，对这两个基因氨基酸和核苷酸序列进行比较，发现它们分别与扁桃 SFBk 和李 SFBa
存在极高的同源性。充分说明李属植物 SFB 基因的进化同样是在物种分化之前（Ikeda et al.，2004）。
在此研究基础上，对‘中油 5 号’自交后代个体的 S 基因型进行了检测，发现后代群体中存在
3 种不同的 S 基因型，分别为 S1S1、S1S2(m)和 S2(m)S2(m)（图 6，图 7），且分离比为 8︰13︰7，与预期
的比例 1︰2︰1 差异不显著（χ2 = 0.214 < χ20.05,2 = 5.991）。基因型为 S1S1 和 S2(m)S2(m)的纯合体的存在，
说明了桃 S1 单元型和 S2 单元型中的花柱 S-RNase 都不能够正常识别自身的花粉 SFB 基因。Deshaies
（1999）认为 F-box 蛋白的 C 端部分为一受体，能够合并目标蛋白成为 SCF 复合体，而李属 SFB
基因含有的两个高变区参与决定等位基因的特异性（Ushijima et al.，2003；Ikeda et al.，2004）。因
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此，C 端序列（包括 HVb）（图 5）结构异常的桃 SFB1 基因以及缺失 V2、HVa 和 HVb 结构的桃 SFB2
基因均丧失原有的基因特异性，导致其不能被自身花柱 S-RNase 所识别，最终使‘中油 5 号’以及
含有这两个基因的桃品种都表现出自交亲和性。
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