全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（7）：1263–1270 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–01–11；修回日期：2012–05–30
基金项目：国家自然科学基金项目（30871681，31101526）；江苏省科技基础设施建设计划项目（BM2008008）
* 共同第一作者
** 通信作者 Author for correspondence（E-mail：gaozhihong@njau.edu.cn）
桃 PpPGIP1 启动子的分离与功能分析
王秀云 1,*，张计育 1,3,*，古咸彬 1，高志红 1,**，章 镇 1，俞明亮 2，张妤艳 2
（1 南京农业大学园艺学院，南京 210095；2江苏省农业科学院园艺研究所，南京 210014；3 江苏省中国科学院植物
研究所，南京 210014）
摘 要：通过染色体步移法分离桃[Prunus persica（L.）Batch]PpPGIP1 上游启动子序列，利用生物
信息学方法对其功能进行初步预测；构建该启动子植物表达载体并通过农杆菌介导法转化烟草，研究不
同激素诱导条件下 GUS 蛋白瞬时表达情况；并利用实时荧光定量 RT-PCR 技术分析了 PpPGIP1 在水杨酸
（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、脱落酸（ABA）和 1–氨基环丙烷–1–羧酸（ACC）诱导下的表达特性，
获得了长度为 1 018 bp 的桃 PpPGIP1 启动子序列。该序列与梅和中国李 PGIP 启动子序列的同源性分别
为 90%和 89%；该启动子序列含有 SA、MeJA、ABA 和 ETH 诱导调控相关的抗病与胁迫顺式作用元件；
ABA 和 ACC 可以诱导 PpPGIP1 启动子调控 GUS 基因的表达；实时荧光定量 RT-PCR 分析结果表明：SA、
MeJA、ABA 和 ACC 都可以诱导桃叶片中 PpPGIP1 的表达。PpPGIP1 可能参与 SA、MeJA、ABA 和 ETH
的信号转导，在桃抵抗病原菌和逆境胁迫方面起着非常重要的作用。
关键词：桃；PpPGIP1 启动子；调控元件；表达特性；表达载体构建
中图分类号：S 662.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）07-1263-08

Isolation and Functional Analysis of PpPGIP1 Promoter in Peach
WANG Xiu-yun1,*，ZHANG Ji-yu1,3,*，GU Xian-bin1，GAO Zhi-hong1,**，ZHANG Zhen1，YU
Ming-liang2，and ZHANG Yu-yan2
（1College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China；2Institute of Horticulture，Jiangsu
Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China；3Institute of Botany，Jiangsu Province and the Chinese Academy
of Sciences，Nanjing 210014，China）
Abstract：Promoter sequence of PpPGIP1 gene in peach[Prunus persica（L.）Batch]was isolated
through the chromosome walking method，and its function was preliminary forecasted by means of
bioinformatics method. The plant expression vector of the promoter was constructed and transformed into
tobacco through the Agrobacterium-mediated technique. Expression characteristics of PpPGIP1 gene
induced by salicylic acid（SA），methyl jasmonate（MeJA），abscisic acid（ABA）and 1-aminocyclopropane-
1-carboxylate（ACC）were also analyzed using real-time RT-PCR. The promoter sequence of PpPGIP1
gene with 1 018 bp length was obtained and its homology with that of Prunus mume and Prunus salicina
were 90% and 89%，respectively. The promoter contains important cis-acting elements related to resisting
pathogens and adversity stress and induced by SA，MeJA，ABA and ETH. The expression of GUS gene

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could be regulated by PpPGIP1 promoter with the induction of ABA and ACC. The results of real-time
RT-PCR indicate that the expression of PpPGIP1 gene could be induced by SA，MeJA，ABA and ACC in
the leaves of peach. Thus，PpPGIP1 gene may be involved in the signal transduction pathway of SA，
MeJA，ABA and ETH，and play an important role in the condition of resisting pathogens and adversity
stress in peach.
Key words：peach；PpPGIP1 promoter；regulatory element；expression characteristic；construction
of expression vector

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（polygalacturonase inhibiting protein，PGIP）是存在于多种植物中
的一种富含亮氨酸的细胞壁结合蛋白，它能与病原真菌入侵过程中分泌的第一个细胞壁降解酶——
内切多聚半乳糖醛酸酶（endo-PG）专一性地结合，形成一种复合物，从而降低了 endo-PG 的活性。
PGIP 与 endo-PG 结合的同时会造成大量寡聚半乳糖醛酸的积累，该物质的积累能有效激活植物体内
相关防御基因的表达，增强植物的抗病性（Gomathi & Gnanamanickam，2004；Liang et al.，2005；
李钊 等，2011）。因此，PGIP 是植物发病早期的重要抗病蛋白，研究其表达调控机制对 PGIP 在分
子抗病育种上的应用具有重要意义。
启动子是 DNA 分子与 RNA 聚合酶特异结合的部位，是最重要的一种转录调节因子，对于基因
的表达非常重要。PGIP 是诱导表达型基因，受病原菌（Alida，2010；Zhang et al.，2010）、创伤（Devoto
et al.，1998）、水杨酸（Liang et al.，2005）等诱导表达。Hu 等（2012）研究表明在水杨酸和脱落酸
的诱导下，桑树 PGIP 的 mRNA 表达水平显著升高。在外源激素（水杨酸、茉莉酸甲酯和脱落酸）
的刺激下，辣椒 PGIP 的表达量均有不同程度升高，且在不同的时间点达到高峰，随之表达量下降
（王秀菊，2011）。目前研究认为，在植物体内存在两个主要的植物防卫反应信号途径：水杨酸依赖
途径和茉莉酸乙烯途径，不同的 PGIP，其表达可能受不同的信号传递途径调节，或者存在信号交
叉调节（李广平，2006）。
国内外关于 PGIP 克隆的报道很多（Devoto et al.，1998；Liang et al.，2005；李广平，2006；古
英洪 等，2008；谌悦 等，2009），但关于该基因上游启动子区的克隆却很少，迄今仅局限于菜豆
（Devoto et al.，1998）、中国李（李广平 等，2009）和梅（李广平 等，2010）PGIP 启动子的克隆
与研究。
‘南京白沙’桃是重要的抗流胶病种质，多年的流胶病田间抗性调查均表现为高抗。本试验中
通过对‘南京白沙’桃 PpPGIP1 启动子的克隆及其顺式作用元件分析，揭示 PpPGIP1 的转录调控
机制，构建了该启动子的双元表达载体，通过农杆菌介导法转化模式植物烟草，进一步研究 PpPGIP1
的调控模式。为了检测 PpPGIP1 启动子中顺式作用元件在 PpPGIP1 调控中的作用，选取几个与顺
式作用元件相关的激素进行 PpPGIP1 的诱导表达。
1 材料与方法
1.1 植物材料与菌株
试验于2010年5月至2011年9月在南京农业大学园艺学院果树生物技术实验室完成。桃[Prunus
persica（L.）Batch]品种‘南京白沙’材料由江苏省农业科学院园艺研究所提供。烟草（Nicotiana
tabacum）‘K326’无菌组培苗由南京农业大学果树生物技术实验室保存。pMD19SimpleT 载体购自
TaKaRa 公司；大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105
7 期 王秀云等：桃 PpPGIP1 启动子的分离与功能分析 1265

和植物双元表达载体 YH4215 由本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 桃 PpPGIP1启动子的克隆
桃 PpPGIP1 启动子的克隆采用染色体步行法，具体步骤参考李广平等（2009）的方法和 BD
Genome Walker™ Universal Kit User Manual 说明书。两条基因特异引物分别为 NGSP1：5′-CTCAAGT
GTTTCAAGATACGGCAAGTCAC-3′；NGSP2：5′-CTCTGGGTTCCATGAGGACAAGACGTAG-3′。
1.2.2 PpPGIP1启动子序列分析
序列同源性分析采用GenBank在线比对工具BLASTn（Altschul et al.，1997. http：//blast. ncbi. nlm.
nih. gov/）完成，启动子序列调控元件分析利用植物顺势调控元件数据库 PlantCare（Lescot et al.，
2002. http：//bio informatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/）和 PLACE（Higo et al.，1999.
http：// www. dna. affrc. go. jp/PLACE/signalscan.html）完成。
1.2.3 PpPGIP1启动子功能分析
根据已克隆的 PpPGIP1 启动子序列，在其两端设计一对含有 EcoR /Ⅰ NcoⅠ酶切位点的引物
pgipF1（5′-GCCGGAATTCATTATATAAAATGACCCTATTG-3′）和 pgipR1（5′-CCATGGCATTTTGT
GGGTTTTGGATAAG-3′）。经 PCR 扩增，连接到 pMD19SimpleT 载体内测序，鉴定正确后，经
EcoRⅠ/NcoⅠ双酶切。酶切后的连接、转化大肠杆菌及鉴定、转化农杆菌及鉴定和农杆菌介导转化
烟草等参考王庆菊等（2010）的方法。转化 35S 启动子作为阳性对照，共培养的培养基中分别添加
0.1 mmol · L-1 SA、0.01 mmol · L-1 ABA、0.02 mmol · L-1 MeJA 和 0.01 mmol · L-1 ACC 诱导表达。共
培养 3 d 后对材料进行 X-Gluc 染色（37 ℃，12 h），再用 80%的乙醇脱色至叶片透明，在显微镜下
观察共培养的材料有无蓝色出现。
1.2.4 表达特性分析
取树体不同部位粗度相近（约 0.5 cm）具有饱满芽的 1 年生枝条，剥除花芽，留叶芽，然后剪
成 20 cm 的长茎段，放于培养瓶中加水培养，每天换水，直至展叶。分别用 0.1 mmol · L-1 SA（水
杨酸）、0.01 mmol · L-1 ABA（脱落酸）、0.02 mmol · L-1 MeJA（茉莉酸甲酯）和 0.01 mmol · L-1 ACC
（1–氨基环丙烷–1–羧酸）喷洒于叶片表面，喷清水作为对照，每个处理 4 个茎段，重复 3 次，
分别于 0、3、6、12 和 24 h 时取叶片迅速置于液氮中冷冻后，–70 ℃保存备用。
叶片总 RNA 的提取参考蔡斌华等（2008）的方法，总 RNA 中 DNA 的消化及 cDNA 第一链的
合成根据说明书（TaKaRa）的方法进行。将合成的 cDNA 第一链稀释 10 倍后，于–20 ℃保存。
实时荧光定量 RT-PCR 分析使用 ABI7300 分析仪。以桃 ACTIN 基因为内参基因，内参基因的引
物序列与 Tong 等（2009）报道的一致。根据已克隆的桃 PpPGIP1 序列设计特异引物：Bpgipf1：
TCAATAACCTCACAGGCTCCATCC；Bpgipr1：AGAAGTCTACGGTGCTGAAGTCC。为确保扩增
产物的唯一性和准确性，分别进行内参基因和目的基因的普通 PCR 反应，并对其目的片段进行回收、
克隆，随机挑取 3 个阳性克隆进行测序。实时荧光定量 RT-PCR 反应体系、程序和数据分析参考张
计育等（2011）的方法。
2 结果与分析
2.1 桃 PpPGIP1 上游启动子序列克隆
以构建的核基因组酶解 DNA 片段文库为模板，经过两轮 PCR 后，从桃的 EcoRⅤ酶切体系中扩
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图 1 桃 PpPGIP1 启动子的 PCR 扩增
M：DNA 分子量标准；1：PCR 扩增产物。
Fig.1 PCR production of PpPGIP1 promoter from P. persica
M：DNA marker；1：PCR production PpPGIP1.
增到 1 条大于 1 000 bp 的目的片段（图 1）。将
该片段进行克隆、测序，结果显示，获得的片
段实际长度为 1 216 bp。序列经过分析整理后，
以 ATG 为起始位点，得到桃 PpPGIP1 上游长
度为 1 018 bp 的 DNA 序列（GenBank 登录号：
HQ453973）。在 GenBank 数据库中利用在线比
对工具 BLASTn 进行同源性比对，发现所克隆
的序列与同为李属的梅的 PGIP基因启动子（登
录号：DQ364056.1）和中国李的 PGIP 基因启
动子（登录号：DQ364055.1）的一致性分别达
到 90%和 89%，而且 E 值（Expect value，期望
值）都为 0。
2.2 PpPGIP1 启动子序列分析及顺式元件预测
在顺式作用元件数据库 PLACE 和 PlantCare 中分析所克隆到的启动子序列（表 1），发现其中含
有大多数高等植物启动子具有的保守元件（TATA-box 和 CAAT-box）和一些与抗逆密切相关的诱导

表 1 应用 PLACE 和 PlantCARE 在线预测的 PpPGIP1 启动子区顺式作用元件特性
Table 1 Cis-acting regulatory elements characteristic of PpPGIP1 promoter sequences by PLACE and PlantCARE
调控序列
Regulatory sequence
序列
Sequence
特性
Characteristic
ABRE CACGTG 脱落酸反应元件 Cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness
ABRERATCAL MACGYGB 脱落酸响应、结合钙离子的顺式作用元件 Ca2+-responsive cis-acting element
ARE TGGTTT 厌氧诱导所需的顺式调控元件 Cis-acting regulatory element essential for anaerobic induction
Box 4 ATTAAT 光调控元件 Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness
Box I TTTCAAA 光调控元件 Light responsive element
CAAT-box CAAT 启动子和增强子区调控元件 Common cis-acting element in promoter and enhancer regions
DOFCOREZM AAAG 防御与胁迫响应元件 Cis-acting element involved in defense and stress responsiveness
G-Box CACGT(T/G) 光顺式作用调控元件 Cis-acting regulatory element involved in light responsiveness
GC-motif CCCCCG 缺氧诱导增强元件 Enhancer-like element involved in anoxic specific inducibility
GT1CONSENSUS GRWAAW 调控抗病基因 PR-1a 表达，影响水杨酸诱导的基因表达 Regulate PR-1a，SA-induced
GT1-motif GGTTAA 光响应元件 Light responsive element
I-box atGATAAGGTC 部分光响应元件 Part of a light responsive element
MYB2CONSENSUSAT YAACKG 脱落酸信号转录激活因子 Transcriptional activators in abscisic acid signaling
MYBCORE CNGTTR 调节类黄酮（一类植保素）生物合成 Regulation of flavonoid biosynthesis
O2-site GATGATGTGG 醇溶蛋白代谢应答元件Cis-acting regulatory element involved in zein metabolism regulation
Sp1 CC(G/A)CCC 光响应元件 Light responsive element
T/GBOXATPIN2 AACGTG 茉莉酸甲酯诱导顺式作用元件 Cis-acting element involved in MeJA induction
TATA-box TATA 转录起始–30 核心启动子元件 Core promoter element around–30 of transcription start
TC-rich repeats ATTTTCTTCA 防御与胁迫响应元件 Cis-acting element involved in defense and stress responsiveness
WBBOXPCWRKY1 TTTGACY 防御与胁迫响应元件 Cis-acting element involved in defense and stress responsiveness
WBOXATNPR1 TTGAC 调控抗病基因 NPR1 表达，影响水杨酸诱导的基因表达 Regulate NPR1，SA-induced
WBOXNTERF3 TGACY 参与乙烯诱导的 ERF3 基因的激活 Involved in activation of ERF3 gene by ethylene
WRKY710S TGAC W-box 核心区，赤霉素信号抑制因子 Core of W-box，transcriptional repressor of GA signal
chs-CMA2b ATTGCAACTCAA 部分光响应元件 Part of a light responsive element
Circadian CAANNNNATC 昼夜节律控制元件 Cis-acting regulatory element involved in circadian control

7 期 王秀云等：桃 PpPGIP1 启动子的分离与功能分析 1267

型作用元件，其中包括影响水杨酸诱导基因表达的调控元件 GT1CONSENSUS 和 WBOXATNPR1；
脱落酸响应元件 ABRE、ABRERATCAL 和 MYB2CONSENSUSAT；茉莉酸甲酯诱导顺式作用元件
T/GBOXATPIN2；参与乙烯诱导的 ERF3 基因激活元件 WBOXNTERF3 等。说明克隆到的序列符合
真核基因启动子的基本结构特征，并且可能在抗病、防御方面起到一定的作用。
2.3 桃 PpPGIP1 启动子在烟草中的调控作用分析
通过 EcoR /Ⅰ NcoⅠ双酶切和 T4 DNA 连接酶的连接作用，将 PpPGIP1 启动子成功连接到植物
双元表达载体 YH4215 中，同时用含有 35S 启动子的 YH4215 载体作为阳性对照。农杆菌介导转化
烟草叶片，共培养培养基中分别添加 ABA、SA、MeJA 和 ACC，以检测这些激素是否能诱导差异
调控表达，共培养 3 d 后进行 GUS 基因的瞬时表达检测。检测结果如图 2 所示，阳性对照以及共培
养基中分别添加 ABA 和 ACC 的叶片检测到 GUS 表达活性，而没添加任何激素和添加 SA 和 MeJA
的叶片没有检测到 GUS 表达活性。并且，添加 MeJA 的叶片用 X-Gluc 染色后变褐发黑，其原因还
有待于进一步研究。


图 2 转 PpPGIP1 启动子的烟草叶片 GUS 瞬时表达检测
A ~ F 分别是阳性对照，不添加激素，添加 ABA、SA、ACC 和 MeJA。
Fig. 2 Transient expression of GUS in tobacco leaf blocks transformed PpPGIP1 promoter
A–F were positive control，hormone free，ABA，SA，ACC and MeJA，respectively.

2.4 桃 PpPGIP1 在 SA、MeJA、ACC 和 ABA 诱导条件下表达特性分析
PpPGIP1 启动子中含有与 SA、MeJA、ACC 和 ABA 有关的顺式作用元件，为了研究这些调控
元件对 PpPGIP1 的调控特性及其在 PpPGIP1 信号转导中的作用，利用实时荧光定量 RT-PCR 分析
了 H2O（对照）、SA、MeJA、ACC 和 ABA 处理后的桃叶片中 PpPGIP1 的表达特性（图 3）。在 H2O
处理后的 24 h 内，PpPGIP1 的表达量几乎没有变化；SA 处理 6 h 后表达量达到最大，为处理前的
2.8 倍，随后表达量降低；MeJA 处理后 6 h 表达量最大，为处理前的 3.9 倍，随后表达量下降；ACC
处理后 3 h 表达量最大，为处理前的 9.9 倍，随后表达量下降；而 ABA 处理后表达量出现上下波动
的情况，3 h 时表达量迅速下降，6 h 时上升到处理前的 1.5 倍，但 12 h 时又低于处理前，24 h 时再
次上升，达到处理前的 1.9 倍，出现 PpPGIP1 表达量上下波动的原因有待进一步研究。
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图 3 实时荧光定量 RT-PCR 分析 SA、MeJA、ACC 和 ABA 处理后叶部 PpPGIP1 的表达
Fig. 3 Expression of PpPGIP1 after treated by SA，MeJA，ACC and ABA in leaf using qRT-PCR
3 讨论
基因上游启动子的功能分析对于弄清楚基因的作用机制具有非常重要的作用。本研究分离了桃
PpPGIP1 上游的启动子序列，该序列含有多个与激素诱导调控有关顺式作用元件，说明 PpPGIP1
的表达可能受这些激素诱导，而且这些调控元件多以多拷贝形式存在。研究表明，多拷贝调控元件
可能参与基因的增强表达（Nishiuchi et al.，2004），说明桃 PpPGIP1 上游调控序列可能具有增强防
御响应调控作用。另外 PpPGIP1 上游启动子区域还有多个光响应元件、缺氧胁迫响应元件等，这些
植物相关顺式作用元件的存在预示 PpPGIP1 启动子区域能够响应多种信号，其表达可能受多种作用
因子共同调节。
植物体内存在两个主要的植物防卫反应信号途径：水杨酸依赖途径和茉莉酸乙烯途径（李广平，
2006）。不同的PGIP基因，其表达受不同的信号传递途径调节（Ferrari et al.，2003）。本研究中PpPGIP1
受 SA、MeJA 和 ACC 诱导表达，说明 PpPGIP1 可能参与这两条防卫反应信号途径。另外，许多研
究表明，水杨酸和茉莉酸乙烯诱导抗病性的信号转导通道之间存在着交叉，NPR1 是两种信号传导
途径之间的交叉点之一，与某些 WRKY 转录因子及 NPR4 一起，在调节和平衡 SA 和茉莉酸信号传
导途径中起关键作用（张红志和蔡新忠，2005；李敏 等，2007）。而 PpPGIP1 启动子顺式作用元件
中包含调控 NPR1 表达的 WBOXATNPR1 以及 WRKY 转录因子结合位点 WBBOXPCWRKY1，这说
明 PpPGIP1 可能受这两条防卫反应信号途径交叉调节。
在未添加激素诱导时，PpPGIP1 启动子不能启动 GUS 基因表达，而添加 ACC 和 ABA 诱导后
出现 GUS 表达现象，说明 PpPGIP1 启动子的调控可能受这两种激素诱导。ACC 可以诱导 PpPGIP1
表达，同样可以诱导 GUS 表达，说明乙烯可以直接调控 PpPGIP1 表达，因此 PpPGIP1 启动子中乙
烯相关调控元件 WBOXNTERF3 在 PpPGIP1 转录调控功能中可能具有重要的作用。然而，在启动
子区域中含有 SA 作用元件，SA 可以诱导 PpPGIP1 表达，但是 SA 未能诱导 GUS 表达，说明 SA
不能直接诱导 PpPGIP1，可能是通过其它途径来诱导 PpPGIP1 表达。研究认为 SA 并不是长距离信
号，要诱导产生系统获得抗性（systemic acquired resistance，SAR），必须要在信号传导下游有一个
长距离信号分子协同作用，SA 可能通过与 NO、H2O2 的相互交织来形成信号转导网络（Chen et al.，
1993；李广平，2006）。
7 期 王秀云等：桃 PpPGIP1 启动子的分离与功能分析 1269

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