全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (3) : 355 - 362
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 10 - 14; 修回日期 : 2009 - 01 - 20
基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( 30671429 ) ; 重庆市自然科学基金项目 ( 9266 ) ; 重庆市 ‘十一五 ’科技攻关项目
(10376) ; 农业部公益性行业 (农业 ) 科研专项经费项目 ( nyhyzx072007) ; 西南大学博士基金项目 ( SWUB2008042)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: zhuliquan@ swu1edu1cn; wxj@ swu1edu1cn)
甘蓝自交不亲和决定因子的体外表达和相互作用的
检测
杨　洋 1 , 高启国 1 , 宋　明 1 , 牛　义 1 , 汤青林 1 , 朱利泉 23 , 王小佳 13
(1 西南大学园艺园林学院 , 重庆市蔬菜学重点实验室 , 重庆 400716; 2 西南大学植物生理生化实验室 , 重庆 400716)
摘 　要 : S位点受体激酶 ( SRK) 和 S位点富含半胱氨酸蛋白 /S位点蛋白 11 ( SCR /SP11) 分别为甘
蓝自交不亲和 ( self2incompatibility, SI) 信号传导的雌雄决定因子。为了深入研究两者的作用机理和进行人
工调控 , 本研究以结球甘蓝 ZQ为材料 , 利用 pET·NusA融合蛋白表达系统 , 将包含 SRK胞外域和跨膜域
的 mSRK蛋白和 SCR蛋白在大肠杆菌 BL21中融合表达 , 经 SDS2PAGE电泳检测表达出融合蛋白大小分别
约为 116 kD和 74 kD。进一步将两融合蛋白进行体外相互作用的检测 , 结果表明 mSRK与 SCR蛋白能够相
互结合形成稳定的复合体 , 这为下一步实现 SRK2SCR复合体聚合与解离的人为调控提供了技术平台。
关键词 : 结球甘蓝 ; 自交不亲和 ; S位点受体激酶 ( SRK) ; S位点富含半胱氨酸蛋白 ( SCR) ; 原核表达
中图分类号 : S 63511　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0320355208
In vitro Study on the In teraction s Between D eterm inan t Factors of Self2
incom pa tib ility in B rassica o le racea L. var. capita ta L.
YANG Yang1 , GAO Q i2guo1 , SONG M ing1 , N IU Yi1 , TANG Q ing2lin1 , ZHU L i2quan23 , and WANG Xiao2
jia13
(1 Chongqing Key Labora tory of O lericu lture, College of Horticulture and L andscape A rchitecture, Sou thw est U niversity, Chongqing
400716, Ch ina; 2 Plan t Physiology and B iochem istry Laboratory, Southw est U niversity, Chongqing 400716, China)
Abstract: Self2incompatibility of B rassica oleracea L. var. capita ta L. is determ ined by the female de2
term inant S2locus recep tor kinase ( SRK) and the male determ inant S2locus cysteine rich p rotein /S2locus p ro2
tein 11 ( SCR /SP11). For further study on mechanism and reagent control of the interaction between the de2
term inant factors, extracellular and transmember domains of SRK ( named as mSRK) and open reading frame
of SCR were amp lified from B rassica oleracea L. ‘ZQ’. Then fusion p rotein of mSRK about 116 kD and SCR2
orf about 74 kD were exp ressed in E. coli BL21 by the pET·NusA fusion exp ression system and separated by
SDS2PAGE electrophoresis. After SCR2orf was incubated with mSRK for 2 hours, the interaction between the
two p roteins was analyzed; The result shows that mSRK and SCR could combine with each other and form a
stable comp lex.
Key words: B rassica oleracea L. var. capita ta L. ; self2incompatibility; S2locus recep tor kinase
( SRK) ; S2locus cysteine2rich p rotein ( SCR) ; p rokaryotic exp ression
甘蓝的自交不亲和信号传导是由 S位点受体激酶 ( SRK) 和 S位点富含半胱氨酸蛋白 ( SCR) 或
者被称为 S位点蛋白 11 ( SP11 ) 间的相互作用而引起的。自从 SRK蛋白于 1991 年由 Stein等
(1991) 在 SLG同源基因克隆子中筛选出来以后 , 甘蓝自交不亲和信号传导的图谱就逐渐展开。目前
园 　　艺 　　学 　　报 36卷
研究表明 SRK位于柱头细胞的质膜内 , 作为自交不亲和信号传导的雌性决定因子 (Cui et al. , 2000;
Takasaki et al. , 2000; Silva et al. , 2001) , 决定柱头特异的 S基因型并传递自交不亲和信号。 SCR /
SP11分别由 Schopfer等 (1999) 和 Suzuki等 (1999) 在花粉壁上鉴定分离出来 , 为 PCP家族中具有
亲水性和碱性的小分子量蛋白。通过突变体分析、序列比对、转基因 ( Schopfer et al. , 1999) 和授粉
试验 ( Shiba et al. , 2001) 等一系列的证据表明它就是惟一的雄性决定因子。
同一等位 S基因型的 SRK与 SCR相互作用是诱发自交不亲和信号传导途径的第一步 ( Franklin2
Tong & Franklin, 2000; Kao & McCubbin, 2000; Goring, 2000)。Kachroo等 ( 2001) 通过对 SRK和
SCR标记的内源蛋白 eSRK62FLAG和 SCR62myc2H is6相互作用的研究 , 展示了 SCR是特异性地与同类
S型 SRK的胞外域相结合。Shimosato等 ( 2007) 也证明 SP11与同型 SRK高度亲和 , 并且 SP11与
SRK结合后会导致 SRK自磷酸化 , 从而引发下游信号传导。这是首要的关键性的一步 , 决定了整个
自交不亲和信号传导途径的启动。通过建立一个蛋白质间相互作用平台 , 进行蛋白质间相互作用机理
的研究 , 有利于有针对性地对目的蛋白进行人工调控 , 对控制整个自交不亲和信号传导途径 , 深入探
索自交不亲和信号传导系统的理论以及简化留种有重要意义。
本研究中以高度自交不亲和型结球甘蓝 ZQ为材料 , 通过对自交不亲和信号传导中的雌雄决定因
子的克隆和体外表达 , 建立适用于 pET4311a2mSRK与 pET4311a2SCR2orf相互作用的体系 , 为深入研
究 SRK与 SCR相互作用的机理 , 进一步推测 SRK与 SCR体内表达与作用方式 , 实现 SRK2SCR复合
体聚合与解离的人为调控提供理论和技术基础。
1　材料与方法
111　材料
试验于 2007年 9月 —2008年 12月在西南大学重庆市蔬菜重点实验室进行。结球甘蓝高度自交不
亲和材料 ZQ由西南大学蔬菜实验室十字花科研究组提供。大肠杆菌 ( Escherich ia coli) X12BLUE菌株
和 BL21 (DE3) 菌株及 pET24311a原核表达载体 , 均由本室保存。RNA提取试剂盒 , 高保真酶 , T4
连接酶 , DL2000核酸分子标准 , 高分子量蛋白标准 , EcoRⅠ, N otⅠ购自宝生物工程 (大连 ) 有限
公司 ; 质粒提取试剂盒为 OMEGA产品 ; MagneH isTM蛋白纯化系统购自 Promega; 各种生化试剂均购
自上海生工生物工程技术服务有限公司 ; 引物合成和测序送上海英骏生物技术有限公司完成。
112　方法
11211　m SR K ( SRK胞外域 +跨膜域 ) 与 SCR 2orf基因的引物设计 　
在 NCB I上收集得到编码芸薹属 SRK胞外域和跨膜域基因的序列 m SRK, 用 vector NTI进行序列
分析 , 针对 m SR K序列的保守区域用 p rimer p rem ier 510设计引物对 : m SR K2F: GAATTCCTCGTCT2
TCGTTGTCATGATTC; m SR K2R: GCGGCCGCACCTTAAACACTAACTCCAACAATCAAAC; SCR 2orf 根据
SCR 编 码 框 序 列 设 计 引 物 对 SCR 2F: GAATTC GTAGAAGCTTGCATCTGTAGCGAAT; SCR 2R:
GCGGCCGCCTAGCAAATGTTTCGTTTAGCATGG。引物所带下划线序列分别表示 EcoRⅠ和 N otⅠ酶切位
点。
11212　m SR K与 SCR 2orf基因的 RT2PCR　
收集甘蓝 ZQ开花前 1～2 d的花柱和开花当日的花药 , 提取柱头和花粉的总 RNA。以反转录的
柱头 cDNA 为模板 , m SR K的 PCR用 TaKaRa pyrobest DNA polymerase标准体系 , 按以下参数进行
touchdown PCR扩增 , 94 ℃预变性 5 m in; 先进行 10个循环 (94 ℃, 45 s; 58 ℃, 45 s, 每个循环下
降 1 ℃; 72 ℃, 1 m in) ; 再 20个循环 (94 ℃, 45 s; 48 ℃, 45 s; 72 ℃, 1 m in) ; 最后 72 ℃延伸
10 m in。以反转录的花粉 cDNA为模板 , 用宝生物 (大连 ) 有限公司高保真酶标准体系和标准反应参
数扩增 SCR 2orf基因 , 退火温度为 48 ℃。PCR产物经 1%琼脂糖电泳后 , 分别回收 m SR K与 SCR 2orf
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　3期 杨 　洋等 : 甘蓝自交不亲和决定因子的体外表达和相互作用的检测 　
基因的目的片段 , 加 A反应后与 pMD182T载体 16 ℃连接 , 转化宿主菌 X12blue, 经菌液 PCR和酶切
鉴定后挑选正确的克隆送至上海英骏生物技术有限公司测序。
11213　原核表达载体的构建与诱导表达 　
琼脂糖凝胶电泳回收表达载体 pET4311a和 T2A克隆阳性质粒双酶切产物 , 16 ℃连接过夜 , 转化
X12blue感受态菌株 , 经酶切和菌液 PCR鉴定后 , 送菌测序验证。再将正确构建的 pET4311a2mSRK,
pET4311a2SCR2orf质粒转化至 BL21感受态菌株 , 菌液 PCR鉴定。
pET4311a2mSRK, pET4311a2SCR2orf表达条件采用正交 L9 (34 ) 方案设计 (表 1) , 蛋白质电泳
定量分析确定最佳的表达条件。
11214　原核表达 pET4311a2mSRK与 pET4311a2SCR2orf相互作用检测 　
由 11213中确定的最佳培养参数培养含有 pET4311a2SCR2orf的 BL21 (DE3) , 按 MagneH isTM蛋白
纯化试剂盒说明纯化 pET4311a2SCR2orf表达产物。参照免疫共沉淀法鉴定相互作用蛋白质原理 , 诱
导表达蛋白 pET4311a2SCR2orf作为诱饵蛋白 , 以优化的诱导条件表达 pET4311a2mSRK作为靶蛋白 ,
靶蛋白和诱饵蛋白的制备 , N i+ 剩余的假阳性检测以及两者相互作用的检测方法引用高启国等
(2008) 的报道 , 蛋白提取液稍有改动。蛋白提取液的组成 : 30 mmol·L - 1 Tris2HCl pH 715, 75
mmol·L - 1 NaCl, 1% Triton X2100, 10%丙三醇 , 5 mmol·L - 1抗坏血酸 , 215 mmol·L - 1偏重亚硫酸
钾 , 1 mmol·L - 1 PMSF, 10μg·mL - 1亮肽素 , 10μg·mL - 1抑肽酶 , 1μg·mL - 1胃蛋白酶抑制剂。
2　结果与分析
211　m SR K与 SCR 2orf基因克隆、序列测定及其编码蛋白软件分析
分别以甘蓝 ZQ 开花前 1～2 d的花柱 , 开花当日的花药 cDNA 为模板 , 用引物对 mSRK2F和
mSRK2R; SCR2F和 SCR2R进行扩增 , 经 1%琼脂糖凝胶电泳检测 , 扩增得到的 m SR K和 SCR 2orf片段
与预期目标大小一致 (图 1, 图 2) , 回收测序分别获得 1 319 bp和 211 bp的目的基因。
Exspay在线分析结果表明 : 甘蓝 ZQ的 m SR K基因共编码 434个氨基酸 , 包含了 SRK蛋白 B2Lec2
tin结构域 , SLG结构域 , PAN_APPLE结构域 , 覆盖了 SRK蛋白的胞外域和跨膜域 , 预测编码的蛋
白大小为 4913 kD。而 SCR 2orf基因共编码 64个氨基酸 , 包含了 SCR蛋白信号肽 C端的 3个氨基酸
VEA和成熟肽 , 其中包含在不同 S型 SCR蛋白家族中保守的 8个半胱氨酸和 1个甘氨酸 , 预测编码
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园 　　艺 　　学 　　报 36卷
蛋白大小为 718 kD。由甘蓝 ZQ材料扩增出的 m SR K和 SCR序列经 Clustal X 1181与来源于 NCB I的
m SRK和 SCR各序列进行亲缘关系比对 (图 3, 图 4) , 结果表明 ZQ材料与甘蓝的 S28单元型完全一
致 , 其次与油菜的 S54单元型亲缘关系很近。
212　原核表达载体的构建
按照前述方法构建 pET4311a2mSRK, pET4311a2SCR2orf原核表达载体 , 酶切鉴定电泳结果 (图
5, 图 6) 和菌液 PCR鉴定 (未附图 ) 都能得到目的片段 , 表达质粒送至英骏公司测序 , 分析插入位
点和方向正确 , 表明载体构建成功。
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　3期 杨 　洋等 : 甘蓝自交不亲和决定因子的体外表达和相互作用的检测 　
213　 IPTG诱导 pET4311a2m SRK, pET4311a2SCR2orf的表达及纯化
通过对原核表达工程菌 BL21的表达条件进行正交设计优化 , 起始诱导的 OD值控制在 0190～
1100之间 , 重复 3次 , 得到的电泳图经 B io2rad Quantity One软件对表达蛋白的定量分析 (表 1) , 最
终确定 pET4311a2mSRK最佳诱导条件为 : 温度 25 ℃; IPTG 011 mmol·L - 1 ; 时间 1 h。pET4311a2
SCR2orf最佳诱导条件为 : 温度 28 ℃; IPTG 110 mmol·L - 1 ; 时间 4 h。
表 1　 IPTG诱导原核表达蛋白定量分析结果
Table 1　Ana lysis the result of IPTG induction cond ition
样品
Samp le
编号
No.
A
温度 /℃
Temperature
B
浓度 / (mmol·L - 1 )
Concentration
C
时间 / h
Time
校正相对光强度 /%Adjusted volume
pET4311a2mSRK pET4311a2SCR2orf
1 25 (1) 011 (1) 1 (1) 311233 3 10155
2 25 (1) 015 (2) 2 (2) 18195 1112
3 25 (1) 110 (3) 4 (3) 17199 11152
4 28 (2) 011 (1) 40 (3) 13137 14129
5 28 (2) 015 (2) 1 (1) 3122 7131
6 28 (2) 110 (3) 2 (2) 8129 12128
7 37 (3) 011 (1) 2 (2) 1165 10188
8 37 (3) 015 (2) 4 (3) 2176 8161
9 37 (3) 110 (3) 1 (1) 2154 12125
pET4311a2mSRK k1 22172 15141 12133
k2 8130 8131 9163
k3 12131 9163 11137
F 121293 3 0135 0104
pET4311a2SCR2orf k1 11109 11191 10104
k2 11129 9104 11145
k3 10158 12102 11148
F 0107 3105 0141
　　注 : k1、k2、k3分别为在水平 1、2、3下校正相对光强度的平均值 ; F: 方差分析中的 F检验值。3 3 : 差异极显著。
Note: k1, k2, k3 are the adjusted volume obtained at level 1, 2, 3, respectively; F is the F2value obtained from analysis of variance;3 3 : highly significant difference.
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表达出的 pET4311a2mSRK融合蛋白大小约为 116 kD (图 7) ; 表达出的 pET4311a2SCR2orf融合蛋
白大小约为 74 kD (图 8) , 与预期蛋白大小一致。
214　pET4311a2m SRK, pET4311a2SCR2orf融合蛋白的纯化及相互作用检测
将纯化出的 pET4311a2SCR2orf融合蛋白与 pET4311a2mSRK诱导蛋白 , 以及两蛋白孵育结果进行
SDS2PAGE电泳 , 结果见图 9。
图 9　pET4311a2m SRK, pET4311a2SCR2orf融合蛋白的纯化及相互作用检测电泳图谱
M; 高分子蛋白标准 ( TaKaRa) ; 1: 阴性对照 ( SRK未诱导与 SCR诱饵蛋白孵育 ) ;
2: pET4311a2mSRK, pET4311a2SCR2orf融合蛋白相互作用 ; 3: N i +剩余检测 ;
4: pET4311a2mSRK融合蛋白的诱导 ; 5: pET4311a2SCR融合蛋白纯化。
F ig. 9　SD S2PAGE ana lysis of the pur if ica tion and con jo in tness of two refusion prote in
M: Protein marker H ( TaKaRa) ; 1: Negetive control ( non2induced pET4311a2mSRK p rotein incubated with
purified pET4311a2SCR2orf) ; 2: Conjoint of two refusion p rotein; 3: Test of the rest N i+ as control;
4: Induction of pET4311a2mSRK; 5: Purification of pET4311a2SCR2orf.
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　3期 杨 　洋等 : 甘蓝自交不亲和决定因子的体外表达和相互作用的检测 　
泳道 1为阴性对照 ; 泳道 3为 N i+剩余检测对照 ; 对照显示诱饵蛋白 pET4311a2SCR2orf与小分子
杂蛋白结合 , 但无靶蛋白 pET4311a2mSRK的结合。泳道 4为 pET4311a2mSRK融合蛋白的诱导 ; 泳道
5为纯化后的 pET4311a2SCR2orf融合蛋白 ; 两蛋白孵育结果 (泳道 2) 既含有 pET4311a2mSRK融合
蛋白条带又含有 pET4311a2SCR2orf融合蛋白条带 , 表明体外表达的两蛋白能相互结合形成稳定的复
合体与 N i+一同被洗脱。
3　讨论
311　目的蛋白互作平台的构建及分析
目前的研究普遍认为 SRK的 S区域 (胞外域 ) 是与 SCR相互作用的区域 , 并且参与不同 S单元
型的识别 ( Kachroo et al. , 2001; Takayama et al. , 2001)。另外 Shimosato等 (2007) 的研究表明含有
SRK的胞外域和跨膜域的 mSRK的瞬间表达与 SCR /SP11有高度的亲和性 , 而仅含有 SRK的胞外域
的 eSRK和 SCR /SP11无亲和性。由前述研究可以确定 SRK可以与同基因型的 SCR相互结合 , 但相互
作用的方式和作用位点还未最终确定。本试验克隆的 SRK基因序列包含了 S结构域 (胞外域 ) 和跨
膜域的编码序列 , 表达出的 mSRK融合蛋白经 SDS2PAGE电泳检测能与 SCR /SP11相互结合 , 充分满
足进一步进行相互作用机理的研究和人为调控两者解离和聚合的需要。另外在相互作用的研究中 , 我
们虽然对靶蛋白 mSRK进行了超声波破碎 , 但为了保证有足够能参与相互作用的蛋白量 , 在孵育前并
未洗涤 , 因此在阴性对照和 N i+剩余检测以及相互作用检测中有少量小分子杂蛋白与诱饵蛋白相结
合 , 但不影响对诱饵蛋白和靶蛋白结合的判断。
312　高可溶性表达的策略
原核表达载体 pET4311a是 Novage公司的 pET·NusA融合系统载体 , NusA蛋白被确认为具有最
高的可溶性 , 溶解性的增加有利于蛋白的活性表达。本试验首先确定了 mSRK、SCR原核表达的最佳
条件。在 25 ℃时 SRK蛋白可溶性表达最高 , 说明低温能降低 SRK蛋白的合成速率 , 改变多肽折叠的
动力学 , 从而导致正确折叠的蛋白增加。
313　利用 H is标签的原核表达蛋白互作检测系统与其他蛋白互作检测系统的比较
酵母双杂交系统能检测到蛋白质与蛋白质瞬间的相互作用 , 但不能确认蛋白质间的作用方式 , 在
本方法中相互作用产物经过了 3次以上的清洗纯化 , 在最终检测中仍能检测到 SCR与 mSRK蛋白条
带 , 说明在反复的清洗过程中并没有洗掉与 SCR结合的 mSRK, 因此两者的相互作用并非瞬间发生而
应该是相互结合形成了稳定的复合体。与免疫共沉淀法鉴定蛋白质相互作用相比 , 本方法不需要制备
抗体 , 既简化了实验操作又避免了因抗体特异性不强可能带来的假阳性结果。
314　构建 SRK与 SCR蛋白相互作用平台
由于 SCR与 SRK是共同进化 , 而 SCR又是属于高度极性配基 , 因此仅在极性压力下可以同义突
变的位点对特异地识别相当关键。通过再进一步的位点突变 , 表达目标蛋白检测 SRK与 SCR是否还
能相互结合 , 可以推测出参与蛋白间相互作用的区域甚至是氨基酸位点。因此我们在下一步蛋白相互
作用的机理研究和人为调控中 , 将对 mSRK和 SCR蛋白中重要区域的保守的半胱氨酸或关键位点进
行定点突变 , 或选择影响非共价键或者二硫键的化学药剂与两蛋白共孵育。
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购书者请通过邮局汇款至北京中关村南大街 12号中国农科院蔬菜花卉所 《园艺学报 》编辑部 , 邮编 100081。
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