全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2010, 37 (1) : 103 - 108
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 07 - 11; 修回日期 : 2009 - 11 - 18
基金项目 : 国家科技支撑计划项目 (2007BAD36B07, 2008BAD92B03) ; 河北省自然科学基金项目 (C2007000452)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: kjliu@hebau1edu1cn)
利用枣离体叶片直接再生完整植株
王　娜 1, 2 , 刘孟军 13 , 秦子禹 3
(1 河北农业大学中国枣研究中心 , 河北保定 071001; 2 河北科技师范学院园艺园林系 , 河北秦皇岛 066600; 3 河北科
技师范学院生命科技学院 , 河北秦皇岛 066600)
摘 　要 : 以冬枣组培苗叶片为材料进行离体再生培养 , 通过对再生条件的系统研究 , 实现了离体叶片
直接再生不定芽并获得完整植株。试验结果表明 : 麦芽糖为离体叶片直接再生的适宜碳源 ; AgNO3可显著
提高叶片不定芽再生率和出芽数 , 在 TDZ 110 mg·L - 1 +AgNO3 110 mg·L - 1的条件下 , 不定芽直接再生率
高达 9713% , 出芽数达 1414个。但麦芽糖不适宜继续作为不定芽伸长培养的碳源 , 再生的不定芽需在 MS
+ 蔗糖 40 g·L - 1 + 琼脂 4 g·L - 1 +BA 110 mg·L - 1 + IBA 015 mg·L - 1的培养基上进行增殖 , 增殖系数为
312。在 IBA110 mg·L - 1条件下 , 生根率达 8713%。
关键词 : 枣 ; 叶片 ; 离体 ; 直接再生 ; 不定芽
中图分类号 : S 66511　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2010) 0120103206
D irect Plan t Regenera tion from in V itro L eaves of Ch inese Jujube
WANG Na1, 2 , L IU Meng2jun13 , and Q IN Zi2yu3
(1 R esearch Cen ter of Chinese Ju jube, A gricu ltura l U niversity of Hebei, B aoding, Hebei 071001, Ch ina; 2D epartm en t of Horticu l2
tu re and L andscape A rchitecture Science, Hebei N orm al U niversity of Science and Technology, Q inhuangdao, Hebei 066600, Ch i2
na; 3 College of L ife Science and Technology, Hebei N orm al U niversity of Science and Technology, Q inhuangdao, Hebei 066600,
Ch ina)
Abstract: A system of comp lete p lantlet regeneration directly from in vitro leaf of Chinese jujube ( Z iz2
iphus ju juba M ill. ‘Dongzao’) was established after investgating p roper culture conditions. Carbon source
p lays a key role on direct shoot inducement from in vitro leaf and maltose is the p roper carbon source. AgNO3
could significantly imp rove the shoot regeneration rate and increase the shoot numbers. Under the medium of
MS supp lemented with TDZ 110 mg·L - 1 + AgNO3 110 mg·L - 1 , the highest shoot regeneration rate
(9713% ) and shoot numbers (1414) were obtained. But maltose was not suitable for the subsequent shoot
growth. Regenerated shoots were growed and p roliferated on medium ofMS + sucrose 40 g·L - 1 + agar 4 g·
L - 1 +BA 110 mg·L - 1 + IBA 015 mg·L - 1 with multip lication coefficient of 312. The comp lete p lantlets
were obtained after the shoots were rooted on MS medium p lus IBA 110 mg·L - 1 with rooting rate of 8713%.
Key words: Z iziphus ju juba; leaf; in vitro; direct regeneration; adventitious shoot
枣树 ( Z iziphus ju juba M ill. ) 的离体培养研究起步较晚 , 到目前为止以枣离体叶片为外植体进行
再生不定芽的研究仅在几个品种上有过报道 (何振艳 等 , 2002; 尹美强 等 , 2005; 王国平 等 ,
2006)。但已有的枣树叶片不定芽再生体系都属于间接发生方式 , 即先由叶片诱导出愈伤组织 , 再由
愈伤组织诱导出不定芽 , 包括愈伤组织的诱导和愈伤组织的分化两个诱导步骤。该方式再生不定芽的
时间长 , 而且外植体在诱导过程中易发生无性系变异 , 这些都会给将来利用叶盘法进行基因转化带来
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园 　　艺 　　学 　　报 37卷
不利影响 (张俊娥 等 , 2003)。因此 , 不经过愈伤组织的直接再生不定芽体系具有明显的优越性 , 而
枣离体叶片直接再生不定芽还未见报道。本试验中对枣叶片直接再生不定芽的主要影响因素进行了较
系统的研究 , 旨在建立一个高效的枣叶片直接再生体系 , 为枣叶盘法基因转化奠定基础。
1　材料与方法
111　材料及其基本培养条件
试验材料取自河北农业大学中国枣研究中心干果种质资源与分子辅助育种实验室 , 为继代 5年的
黄骅冬枣 , 组培苗离体叶片 , 继代方式采用双芽或三芽继代 , 继代培养基为 MS +BA 110 mg·L - 1 +
IBA 015 mg·L - 1。
选取生长健壮、继代 20 d左右的冬枣组培苗中上部叶片 , 用已灭菌剪刀垂直叶脉剪切数刀 , 正
面向上接种于各诱导培养基上 (周瑞金和刘孟军 , 2006) (图 1, A)。
所有培养基 pH 518～610, 培养温度均为 (25 ±2) ℃, 光照强度 2 000 lx, 光周期 (14 h光照 /10
h黑暗 ) (暗培养除外 )。
112　离体叶片直接再生不定芽
碳源试验 : 培养基为 MS +碳源 +琼脂 3 g·L - 1 +BA 015 mg·L - 1或 TDZ 015 mg·L - 1 , 碳源种
类设蔗糖、果糖、葡萄糖和麦芽糖 4个处理 , 浓度均为 20 g·L - 1 , 暗培养。每处理接种 30片叶 , 重
复 3次。25 d后统计各处理的不定芽再生率和出芽数。
BA浓度试验 : 培养基为 MS +麦芽糖 20 g·L - 1 +琼脂 3 g·L - 1 +BA。BA浓度设 0、011、015、
110、210、410 mg·L - 1 5个处理 , 暗培养。接种数和重复数同上。
TDZ浓度试验 : 培养基为 MS +麦芽糖 20 g·L - 1 +琼脂 3 g·L - 1 + TDZ。TDZ浓度设 0、011、
015、110、210、410 mg·L - 1 5个处理 , 暗培养。接种数和重复数同上。
AgNO3浓度试验 : 培养基为 MS +琼脂 3 g·L - 1 +麦芽糖 20 g·L - 1 + (BA 110 mg·L - 1或 TDZ
110 mg·L - 1 ) +AgNO3。AgNO3浓度设 0、011、015、110、210、410 mg·L - 1 5个处理 , 暗培养。接
种数与重复数同上。
113　不定芽生长
碳源试验 : 将长度 2 cm左右的再生不定芽转接到 MS +碳源 +琼脂 4 g·L - 1 +的无植物生长调节
剂固体培养基上 , 碳源分别为蔗糖和麦芽糖 , 浓度均为 30 g·L - 1 , 观察不定芽生长状况。
不定芽增殖试验 : 将不定芽转接到 MS +蔗糖 30 g·L - 1 +琼脂 4 g·L - 1附加不同 BA和 IBA的固
体培养基上 (表 5)。30 d后调查不定芽生长高度及增殖系数。
114　不定芽生根
将继代 25 d不定芽接种到 1 /2MS +蔗糖 20 g·L - 1 +琼脂 4 g·L - 1 + IBA 110 mg·L - 1培养基上暗
培养生根。
115　数据统计与分析
不定芽再生率 ( % ) =产生不定芽的外植体数 /接种外植体总数 ×100; 每片叶出芽数 =产生的不
定芽总数 /接种外植体总数。
数据采用 DPS统计软件单因素方差分析中的邓肯氏新复极差法进行方差分析 , 显著水平为 0105。
2　结果与分析
211　不同因素对枣叶片直接不定芽诱导的影响
21111　碳源 　无论以 BA还是 TDZ进行诱导 , 在以蔗糖、果糖、葡萄糖为碳源时 , 叶片均无明显反
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应 , 接种 20 d时切口无变化 ; 而以麦芽糖为碳源时 , 叶片切口处均无愈伤组织出现 , 均以直接再生
方式发生不定芽 , 但不定芽的诱导率较低 , 每片叶的不定芽数也较少 , 只有 1～2个 (表 1)。
相对其它 3种碳源 , 麦芽糖有利于枣叶片不定芽的产生 , 因此本试验在以下处理中均采用麦芽糖
为碳源进行不定芽的诱导。
表 1　碳源种类对枣离体叶片直接不定芽诱导的影响
Table 1　The effect of carbon source on d irect shoot inducem en t
from leaves of Ch inese jujube in vitro
BA /
(mg·L - 1 )
TDZ/
(mg·L - 1 )
碳源
Carbon source
每片叶的出芽数
Shoot number per leaf
不定芽诱导率 /%
Shoot inducement rate
015 0 蔗糖 Sucrose 0 0 b
015 0 果糖 Fructose 0 0 b
015 0 葡萄糖 Glucose 0 0 b
015 0 麦芽糖 Maltose 115 816 a
0 015 蔗糖 Sucrose 0 0 b
0 015 果糖 Fructose 0 0 b
0 015 葡萄糖 Glucose 0 0 b
0 015 麦芽糖 Maltose 111 619 a
　　注 : 不同字母表示差异达显著水平 ( P < 0105)。下同。
Note: The different letters indicated significant difference at 0105 level1 The same below1
21112　BA　由表 2可以看出 , 不同浓度 BA对冬枣叶片不定芽的诱导效果存在显著差异。当 BA浓
度低时 (011 mg·L - 1 ) , 叶片不定芽诱导率也低 ; 当 BA浓度为 110 mg·L - 1时 , 叶片不定芽诱导率
最高 , 为 1017% ; 当 BA浓度为 410 mg·L - 1 , 叶片切口处褐化 , 不定芽诱导率降为 311% , 说明过
高的 BA浓度对叶片产生了伤害作用。其次 , 在 BA各浓度下叶片均未产生愈伤组织 , 且再生的不定
芽数较少 , 平均只有 1～2个。
表 2　BA浓度对枣离体叶片直接不定芽诱导的影响
Table 2　The effect of BA concen tra tion on d irect shoot inducem en t
from leaves of Ch inese jujube in vitro
BA /
(mg·L - 1 )
愈伤组织情况
Callus conditions
每片叶的出芽数
Shoot number per leaf
不定芽诱导率 / %
Shoot inducement rate
0 - 0 0 d
011 - 015 214 c
015 - 111 619 b
110 - 113 1017 a
210 - 114 710 b
410 - 116 311 c
　　注 : 培养基以麦芽糖为碳源。下同。“ - ”代表无愈伤组织产生。
Note: Maltose was the carbon source in media1 The same below1“ - ”means no calli induced.
21113　TDZ　由表 3可以看出 , 随着 TDZ浓度增加不定芽诱导率也随之增高。TDZ浓度为 110 mg·
L - 1时 , 叶片不定芽诱导率最高 , 为 1519% , 出芽数也最多 , 达 118个 ; 但当 TDZ浓度再升高至 210
mg·L - 1 , 叶片切口逐渐产生淡黄色的愈伤组织 , 无直接不定芽发生 , 且随浓度增加愈伤组织发生量
也增加。可见 , 高浓度 TDZ ( > 110 mg·L - 1 ) 利于枣叶片愈伤组织的发生 , 而低浓度 TDZ利于不定
芽发生 , 该现象与在非洲紫罗兰叶片再生中的研究结果 (M ithila et al. , 2003) 一致。
因此认为 , 利用 TDZ进行枣叶片直接不定芽诱导时应将浓度控制在 110 mg·L - 1以下。
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表 3　TD Z浓度对叶片直接不定芽诱导的影响
Table 3　The effect of TD Z concen tra tion on d irect shoot inducem en t from leaves
TDZ/
(mg·L - 1 )
愈伤组织情况
Callus conditions
每片叶的出芽数
Shoot number per leaf
不定芽诱导率 /%
Shoot inducement rate
0 - 0 0 d
011 - 111 414 c
015 - 115 816 b
110 - 118 1519 a
210 + - 0 d
410 + + - 0 d
　　注 : ‘ - ’代表无愈伤组织产生 , ‘ + ’代表有愈伤组织产生 , 且 ‘ + ’越多愈伤组织越多。
Note: ‘ - ’means no calli induced; ‘ + ’means calli induced, and more‘ + ’more calli.
21114　AgNO3 　如表 4所示 , AgNO3对冬枣叶片不定芽诱导具有十分显著的促进作用。无论以 BA110
mg·L - 1还是以 TDZ 110 mg·L - 1诱导 , 添加 AgNO3后不定芽的诱导率均显著提高 , 且每片叶上的出
芽数也明显增加。在一定浓度范围内 , 不定芽诱导率与叶片出芽数均随 AgNO3浓度的升高而增加 , 当
AgNO3为 110 mg·L - 1时 , TDZ或 BA 作用下的叶片不定芽诱导率均达到最高 , 分别为 9713%和
9011% , 出芽数也最多 , 分别为 1414个和 1216个 (图 1, B～D ) ; 当 AgNO3浓度大于 210 mg·L - 1
时 , 叶片不定芽诱导率和出芽数均开始下降 , 再生的不定芽开始出现水渍状 , 严重时所有再生芽均成
为玻璃化苗 , 无法继代 , 失去利用价值。
表 4　AgNO 3 对叶片直接不定芽诱导的影响
Table 4　The effect of AgNO 3 on d irect shoot inducem en t from leaves
BA /
(mg·L - 1 )
TDZ/
(mg·L - 1 )
AgNO3 /
(mg·L - 1 )
每片叶的出芽数
Shoot number per leaf
不定芽诱导率 /%
Shoot inducement rate
110 0 0 0 0 e
110 0 011 116 2414 d
110 0 015 719 6118 c
110 0 110 1216 9011 a
110 0 210 818 7116 b
110 0 410 614 5916 c
0 110 0 0 0 e
0 110 011 210 2719 d
0 110 015 1115 6519 c
0 110 110 1414 9713 a
0 110 210 1212 8315 b
0 110 410 1015 6611 c
可见 , 在 AgNO3 110 mg·L - 1作用下 , BA 110 mg·L - 1和 TDZ 110 mg·L - 1均能诱导枣离体叶片
直接再生不定芽 , 以 TDZ 110 mg·L - 1 +AgNO3 110 mg·L - 1再生率最高 , 达 9713%。
212　不同因素对叶片不定芽伸长的影响
21211　碳源 　试验结果表明 , 不定芽在不同碳源的培养基中生长情况不同。无论不定芽是由 BA诱
导还是由 TDZ诱导而来 , 如继续在麦芽糖为碳源的培养基中进行培养 , 不定芽均逐渐变为水渍状 ,
不能伸长 , 而在蔗糖为碳源的培养基中不定芽可保持正常苗状态 , 伸长情况良好 (图 1, E)。可见麦
芽糖虽有利于不定芽诱导 , 却不利于不定芽生长。因此 , 当叶片完成不定芽诱导后应及时将碳源改为
蔗糖。
21212　植物生长调节剂 　如表 5所示 , 枣叶片直接再生的不定芽在不同植物生长调节剂组合下生长
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情况不同。在 MS +蔗糖 30 g·L - 1 +琼脂 4 g·L - 1 +BA 110 mg·L - 1 + IBA 015 mg·L - 1的固体培养
基上生长状况最好 , 接种一个月后不定芽高度达 516 cm, 将伸长的不定芽剪切成双芽茎段进行增殖
培养 , 增殖系数最高 , 达 312。因此 , 本试验采用添加 BA 110 mg·L - 1和 IBA 015 mg·L - 1的培养基
进行再生不定芽伸长和增殖培养。
表 5　不同植物生长调节剂组合对不定芽伸长和增殖的影响
Table 5　The effect of com position of horm one on shoot grow ing and prolifera tion
植物生长调节剂组合 / (mg·L - 1 )
Composition of hormone
不定芽高度 / cm
Height of shoot
增殖系数
Proliferation modulus
MS +BA 015 + IBA 011 213 114 c
MS +BA 110 + IBA 015 516 312 a
MS +BA 210 + IBA 015 314 217 b
213　不定芽生根
再生不定芽可在 1 /2MS +蔗糖 20 g·L - 1 +琼脂 4 g·L - 1 + IBA 110 mg·L - 1的固体培养基上进行
生根 , 生根率达 8713% (图 1, F)。
图 1　枣离体叶片直接再生不定芽及植株再生
A: 离体叶片初始诱导状 ; B～D: 叶片直接再生不定芽 ; E: 不定芽伸长生长 ; F: 不定芽生根。
F ig. 1　D irect shoot developm en t from leaves in vitro and plan tlet regenera tion
A: Initial leaves in vitro of Chinese jujube; B - D: D irect shoot regeneration from leaves;
E: Adventitious shoot growing; F: Adventitious shoot rooting.
3　讨论
在以往关于枣叶片再生不定芽的报道中 , 都存在再生率低或出芽数少的问题。如在骏枣叶片不定
芽再生体系研究中 , 叶片从愈伤组织再生不定芽的比率最高才达 3815% , 平均每片叶片出芽数仅 119
个 (王国平 等 , 2006) ; 在梨枣、酸枣、沾化冬枣的叶片再生体系中 , 不定芽再生率也仅有 40% ～
50% (孙清荣 等 , 2000; 陈宗礼 等 , 2002; 何振艳 等 , 2002) ; 虽然有的报道中不定芽再生率达
80% ～90% , 但出芽数最多为 416 个 (胡桂兵 等 , 2000; 尹美强 等 , 2005; 周瑞金和刘孟军 ,
2006)。本研究建立的枣叶片直接再生不定芽体系 , 不仅再生率高达 9713% , 平均出芽数更是高达
1414。
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大多数研究结果表明 , 植物生长调节剂是成功诱导不定芽的决定因素 , 也是影响不定芽高频率发
生的主要因素 , 而碳源在组织培养中主要起维持外植体渗透压和提供发育能源的作用。但本研究发现
碳源种类对能否诱导叶片直接再生不定芽起着关键的作用。以往关于枣叶片再生不定芽的报道中均以
蔗糖为碳源 , 且都是先产生愈伤组织再发生不定芽。本研究发现如果将蔗糖改为麦芽糖 , 叶片则直接
发生不定芽 , 该现象在枣及其它物种再生研究中都未见报道 , 至于麦芽糖在枣叶片再生过程中的作用
机理尚有待进一步研究。需要指出的是 , 麦芽糖只在器官分化时起关键作用 , 一旦外植体完成形态建
成就不再适用了 , 主要表现在当叶片完成不定芽分化后 , 如继续使用麦芽糖为碳源 , 再生植株均呈现
严重水渍状 , 不能继续发育而死亡。本试验在不定芽伸长阶段将碳源更换为蔗糖 , 才能使其正常生
长。
本研究建立的枣叶片直接再生不定芽体系未经愈伤组织这一过程 , 既可简化操作步骤 , 缩短不定
芽再生时间 , 节省人力物力 , 又可在一定程度上避免出现无性系变异 , 保持品种原有优良品性 , 有望
成为今后枣叶盘法遗传转化的良好体系。
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