全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (3) : 441 - 446
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 08 - 18; 修回日期 : 2009 - 01 - 213 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: gdwang@ njau1edu1cn )
致谢 : 感谢广东省农业科学院花卉研究所朱根发研究员对本研究提供的帮助。
杂交兰 ‘韩国桃花 ’×蕙兰种间杂交种子无菌萌发
特征研究
陈瑶瑶 , 张　燕 , 张　琛 , 王广东 3
(南京农业大学园艺学院 , 南京 210095)
摘 　要 : 以大花蕙兰和墨兰杂交育成的品种 ‘韩国桃花 ’为母本 , 再与蕙兰进行种间远缘杂交 , 取其
不同成熟度的种子进行无菌播种 , 研究了杂交种子萌发、原球茎和根状茎的增殖与分化特征。结果表明 :
授粉后 240 d的种胚具有较好的萌发能力 , 在所试的 4种培养基中 , 以 1 /2MS添加 62BA 015 mg·L - 1和 NAA
210 mg·L - 1的处理萌发效果较好 ; 萌发的种子可以通过原球茎和根状茎两条途径增殖 ; 1 /2MS培养基添加
62BA 015 mg·L - 1和 NAA 210 mg·L - 1适于原球茎增殖 , 培养 30 d后增殖系数可达 4125; 而 NAA 015
mg·L - 1和 110 mg·L - 1适宜原球茎的发育和植株再生 ; 根状茎的增殖以 NAA∶62BA为 2∶1较适宜 , 培养
40 d后增殖系数可达 610以上 ; 当 NAA浓度为 110 mg·L - 1时 , 根状茎发育及植株再生效果佳 , 培养 70 d后
超过 80%的根状茎茎端分化成苗。杂交后代通过原球茎和根状茎均可获得再生植株 , 且形态无明显差别。
关键词 : 兰 ; 蕙兰 ; 种间杂交 ; 原球茎 ; 根状茎 ; 植株再生
中图分类号 : S 682131　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0320441206
A Study on A septic Seed Germ ina tion of In terspec if ic Hybr id Between
C ym bidium hybrida ×C. sinense and C. faberi
CHEN Yao2yao, ZHANG Yan, ZHANG Chen, and WANG Guang2dong3
(College of Horticulture, N an jing A gricu ltura l U niversity, N an jing 210095, Ch ina)
Abstract: An asep tic seed germ ination p rotocol for interspecific hybrid between Cym bid ium hybrida ×C.
sinense and C. faberi was established. The results showed that seed germ ination rate related to its’mature de2
gree and seed harvested 240 days after pollination germ inated well. The suitable medium for hybrid seed ger2
m ination was half strength MS basal medium supp lemented with 015 mg·L - 1 62BA and 210 mg·L - 1 NAA.
Germ inated seeds can be multip lied in vitro via 2 pathways: PLB s and rhizomes. The op timal medium for p ro2
liferation of PLB swas half strength MS medium ( solid / liquid) supp lemented with 015 mg·L - 1 62BA and 210
mg·L - 1 NAA, and p roliferation coefficient could reach to 4125 after 30 days culture. The development and
p lantlet regeneration of PLB s can be highly enhanced on medium containing 110 mg·L - 1 62BA and 015, 110
mg·L - 1 NAA. On the other hand, when rhizomes developed from PLB s were cultured on the medium contai2
ning 015 mg·L - 1 62BA and 110 mg·L - 1 NAA for 40 days, the highest p roliferation coefficient reached to
6167, and subsequently more than 80% of the apex of rhizomes developed into shoots within 70 days culture
on the medium containing 110 mg·L - 1 62BA and 015 mg·L - 1 NAA.
Key words: Cym bid ium; Cym bid ium fabderi; interspecific hybridization; p rotocorm2like bodies; rhizo2
me; p lant regeneration
兰科花卉中兰属 (Cym bid ium ) 的种间远缘杂交常存在亲和障碍 , 且种间杂种胚通常发育较差 ,
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园 　　艺 　　学 　　报 36卷
杂交种子萌发困难 , 成苗率低。此外杂种胚的萌发差异较大 , 直接影响了兰属种间远缘的杂交育种。
深入探讨不同类型兰属植物种间杂交种子的萌发与后代生长特性 , 将为进一步开展兰属新品种培育提
供基础。近年来 , 国内已经有部分兰属种间杂交研究的报道 (张志胜 等 , 2001; 朱根发 等 , 2004,
2005) , 但对于兰属多亲本杂交及其杂种胚培养技术尚无深入的研究。
作者以大花蕙兰 (Cym bid ium hybrida) 与墨兰 (C. sinense) 杂交选育成的杂交兰品种 ‘韩国桃
花 ’ (C. hybrida ×C. sinense) 为母本 , 以蕙兰 ( C. fabderi) 为父本进行杂交 , 并对不同发育阶段
的杂种胚进行离体培养 , 探讨远缘杂种胚萌发及杂交后代增殖和植株再生特征 , 并获得杂交后代群
体 , 为筛选具有多亲本特征的优良株系提供基础 , 也为合理利用兰属种质资源 , 培育更多优良新品种
提供参考。
1　材料与方法
111　材料及其无菌播种
以引进杂交兰品种 ‘韩国桃花 ’ (大花蕙兰 ×墨兰 ) 为母本 , 蕙兰为父本 , 于 2006年 3月在南
京农业大学园艺学院兰花种质资源圃中进行杂交授粉。授粉后 90、120和 240 d取蒴果 , 表面灭菌 ,
在无菌状态下剖开 , 将种子分成 4份 , 均匀散播于 4种培养基 (表 1) 上 , 比较不同培养基条件下不
同胚龄杂交种子萌发的差异。
112　原球茎增殖及再生
将培养 150 d形成的原球茎接种到 1 /2MS + 62BA 015 mg·L - 1 + NAA ( 015、110、115、210、
215) mg·L - 1的培养基上 , 固、液体培养基交替周期为 15 d, 每个培养皿接种原球茎 015 g左右 ,
Parafilm封口 , 3次重复。原球茎植株再生试验以 1 /2MS为基本培养基 , 分别附加 62BA 110 mg·L - 1 +
NAA (011、015、110、210、310 mg·L - 1 ) , 3次重复 (蔗糖 3% , 无活性炭 )。
113　根状茎增殖及分化
在原球茎伸长形成的根状茎中选择生长状态相近的 , 在无菌条件下分割成长约 510 mm的切段 ,
接种到 1 /2MS 添加 NAA ( 0、 015 mg ·L - 1 )、 62BA 015 mg ·L - 1 + NAA ( 0、 015、 110、 115
mg·L - 1 ) 和 62BA 110 mg·L - 1 + NAA ( 015、110、115、210 mg·L - 1 ) 共 10个处理的培养基上 ,
进行根状茎增殖试验 , 每个处理重复 3次。根状茎再生试验切取根状茎顶端 110 cm, 接种于 1 /2MS +
62BA 110 mg·L - 1 +NAA (011、015、110、210 mg·L - 1 ) 及无植物生长调节剂的 1 /2MS培养基上
共 5个处理 , 每个处理重复 3次 (蔗糖 3% , 活性炭 0105% , GA3 0101 mg·L - 1 ) , 进行分化培养。
以上试验所用培养基除注明外均添加蔗糖 2%、椰子汁 100 mL ·L - 1 , 活性炭 011%和琼脂粉
016% , pH 514, 光照 1 000 lx, 光周期 16 h, 25 ℃。
114　结果统计与数据分析
无菌播种以每个处理萌发获得的原球茎数表示萌发效率 ; 原球茎增殖和植株再生情况分别以接种
后 30和 40 d统计的增殖系数和再生率表示 [增殖系数 =增殖后鲜样质量 /接种时鲜样质量 ; 再生率
( % ) =成苗数 /接种原球茎数 ×100 ]; 根状茎增殖和植株再生情况分别以根状茎接种后 40、70 d的增
殖系数和根状茎萌发率表示 [增殖系数 =增殖后根状茎数 /接种根状茎数 ; 再生率 ( % ) =成苗
数 /接种根状茎段数 ×100 ]。试验结果均采用 SPSS软件进行计算 , 以邓肯氏新复极差法测验差
异显著性。
2　结果与分析
211　不同胚龄种子萌发差异及不同培养基对杂交种子萌发的影响
不同胚龄的韩国桃花 ×蕙兰杂交种子在 4种萌发培养基上的萌发情况如表 1所示 , 胚龄 90和 120
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d时均无萌发能力 , 而胚龄达到 240 d的种子在 4种培养基上培养 120 d后均萌发 , 以 1 /2MS + 62BA
015 mg·L - 1 +NAA 210 mg·L - 1较为适宜。
种子接种 20 d后开始膨胀 , 约 60 d膨大形成白色球形胚 (图版 , A ) , 继续培养形成白色原球茎
(图版 , B、C) , 光下可转成绿色原球茎。接种 120 d后 , 其余各组均有萌发 , 种子萌发的时间前后
可相差约半年。萌发的原球茎其顶端分生组织不断分裂、伸长形成根状茎 , 此时还可以观察到根状茎
的表面布满根毛状物 (图版 , D)。
另外 , 1 /2MS培养基优于 Hyponex 1 (花宝 1号 ) 培养基 (表 1) , 这可能是由于 MS培养基含有
全部植物生长必需的矿质元素 , 而 Hyponex 1只含有 N、P、K元素。无论是在 Hyponex 1还是 1 /2MS
培养基 , 添加植物生长调节剂均优于不添加的。
表 1　不同培养基对杂交后代种子萌发形成原球茎数量的影响
Table 1　Effects of d ifferen t sow ing per iod and m ed ium on the hybr id seed germ ina tion
培养基
Medium
62BA /
(mg·L - 1 )
NAA /
(mg·L - 1 )
种子成熟度 / d Days after pollination
90 120 240
Hyponex 1 0 0 0 0 24
Hyponex 1 015 210 0 0 59
1 /2MS 0 0 0 0 101
1 /2MS 015 210 0 0 203
图版说明 : 杂交兰与蕙兰种间杂交种子的无菌萌发与植株再生
A. 种子萌发初期形成的原球胚 ; B. 单个原球茎 ; C. 原球茎团 ; D. 原球茎发育成根状茎 ; E. 液体培养条件下原球茎增殖 ; F. 固体条
件下原球茎增殖 ; G. 原球茎分化成苗 ; H. 由原球茎萌发的单个植株 ; I. 根状茎的增殖 ; J. 根状茎增殖中二级分支的形成 ; K. 根状茎
茎端的萌发 ; L. 根状茎再生植株。
Explana tion of pla tes: A septic seed germ ina tion and plan tlet regenera tion of in terspec if ic hybr id between Cym bidium hybrida ×C.
sinense and C. faberi
A. Protocorm2like bodies ( PLB s) formation from the hybrid seed; B. Single PLB; C. Clump of PLB s; D. Rhizomes developed from PLB s;
E. Proliferation of PLB s in liquid culture condition; F. Proliferation of PLB s in solid culture condition; G. Shoots differentiation from PLB s;
H. Single p lantlet from PLB; I. Rhizome p roliferation on Petri dish; J. Secondary branches formation of rhizome; K. Shoots developed from rhizo2
me; L. Plantlets regeneration from rhizomes.
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212　植物生长调节剂对原球茎增殖与植株再生的影响
如表 2所示 , 当 62BA浓度为 015 mg·L - 1时 , 随着 NAA浓度的提高 , 原球茎的增殖系数也显著
提高 , 并以 210 mg·L - 1最佳 , 培养 30 d达到 4125。原球茎在液体培养基培养 2周后 , 其周围出现新
的突起 (图版 , E) , 而后转至固体培养基上 , 突起进一步增大、转绿并发育形成新的原球茎 (图版 ,
F)。各处理差异显著性分析表明 , 1 /2MS培养基中添加 62BA 015 mg·L - 1和 NAA 210 mg·L - 1较适
宜原球茎的增殖。
表 2　62BA和 NAA对杂交后代原球茎增殖的影响
Table 2　Effects of 62BA and NAA com b ina tion on the PL Bs prolifera tion after 30 days culture
62BA /
(mg·L - 1 )
NAA /
(mg·L - 1 )
接种鲜样质量 / g
Fresh weight of PLB s
30 d后鲜样质量 / g
Fresh weight of PLB s
after 30 d culture
增殖系数
Proliferation
coefficient
生长状况
Growth status
015 015 01497 11753 2153cd 差 Worse
015 110 01513 11977 2185bcd 一般 O rdinary
015 115 01503 21127 3123bc 一般 O rdinary
015 210 01510 21680 4125a 好 Good
015 215 01513 21220 3133b 一般 O rdinary
　　注 : 不同字母代表在 0105水平差异显著。下同。
Note: D ifferent letters within columns indicate significant difference by Duncanpis multip le range test at 5% level. The same below.
将原球茎转至不同分化培养基上 , 经过 40 d培养 , 陆续分化出根和芽 , 形成完整植株 , 当 62BA
浓度为 110 mg·L - 1时 , NAA浓度以 015和 110 mg·L - 1原球茎成苗率最高 , 可达到 90%以上 (表
3) , 且再生植株生长健壮 (图版 , G、H)。
表 3　62BA和 NAA对杂交后代原球茎分化的影响
Table 3　Effects of 62BA and NAA com b ina tion on the PL Bs d ifferen tia tion after 40 days culture
62BA /
(mg·L - 1 )
NAA /
(mg·L - 1 )
平均原球茎数
Average number of PLB s
平均再生苗数
Average number of
p lantlet regenerated from PLB s
再生率 /%
Percentage of
regenerated p lants
110 011 1013 710 6716b
110 015 1010 910 9010a
110 110 1017 917 9016a
110 210 917 610 6119b
110 310 1110 510 4419c
213　植物生长调节剂对杂交兰根状茎增殖和植株再生的影响
根状茎经过 40 d的培养后 , 在无植物生长调节剂或者仅添加 62BA或 NAA的培养基上培养虽然
能增殖但是生长速度较慢。同时加入 62BA 和 NAA 可以促进根状茎的增殖 (图版 , I)。62BA 015
mg·L - 1 +NAA 110 mg·L - 1以及 62BA 110 mg·L - 1 + NAA 210 mg·L - 1 , 即 62BA∶NAA为 1∶2时 ,
根状茎的增殖系数显著高于其它组合 , 分别达到 6167和 6140 (表 4) , 但后者根状茎增殖呈不正常的
簇生型。在 62BA为 015 mg·L - 1 , NAA 110 mg·L - 1条件下 , 新生根状茎呈白色芽点状 , 随着培养时
间延长 , 芽点伸长、变粗 , 向外延伸为一级根状茎 , 在一级根状茎的节处形成新的二级根状茎 (图
版 , J)。
将根状茎茎端转入 5种 1 /2MS培养基上进行植株再生培养 , 70 d后观察发现 , 培养基中 , 62BA
110 mg·L - 1 + NAA 110 mg·L - 1的组合根状茎茎端成苗率最高 ( 8218% ) , 长势最好 , 植株芽生长
速度一致 , 芽体饱满、粗壮、生长速度快 (表 5; 图版 , K、L)。
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表 4　62BA和 NAA组合对杂交后代根状茎增殖的影响
Table 4　Effects of 62BA and NAA com b ina tion on the rh izom e prolifera tion after 40 days culture
62BA /
(mg·L - 1 )
NAA /
(mg·L - 1 )
根状茎段数
Number of
rhizomes
70 d后根状茎数
Number of rhizomes
after 70 d culture
增殖系数
Proliferation coefficient
0 0 10 1310 0130ef
0 015 10 1816 0187e
015 015 10 4410 3140c
015 110 10 7617 6167a
015 115 10 5810 4180b
015 0 10 3517 2157d
110 0 10 1113 0113f
110 110 10 3410 2140d
110 115 10 4717 3177c
110 210 10 7410 6140a
表 5　62BA和 NAA组合对根状茎茎端发育和植株再生的影响
Table 5　Effects of 62BA and NAA com b ina tion on plan tlet regenera tion from the rh izom es after 70 days culture
62BA /
(mg·L - 1 )
NAA /
(mg·L - 1 )
接种根状茎数
Average number of
rhizomes with apex
平均成苗数
Average number of p lantlet
developed from rhizomes
再生率 /%
Percentage of
regenerated p lants
单株平均根数
Average number of
roots per p lantlet
0 0 1010 117 1617c 018
110 011 1017 617 6217b 112
110 015 917 710 7216ab 116
110 110 1117 917 8218a 118
110 210 1017 413 4111b 214
3　讨论
兰属花卉杂交后代种子的萌发和生长特征常因杂交组合不同而异 (张志胜 等 , 2001)。通常热
带附生兰杂交种子易于萌发 , 萌发后形成原球茎 , 成苗快 (Chang et al. , 2005) , 温带地生兰杂交种
子萌发困难 , 萌发后一般形成根状茎 , 成苗难 ( Shimasaki & Uemoto, 1990) , 二者杂交后代萌发及生
长特征因亲本及组合不同而异 (Oguratsujita & Okubo, 2006)。在本试验中 , 以大花蕙兰与墨兰的杂
交品种 ‘韩国桃花 ’ (C. hybrida ×C. sinense) 为母本 , 再与蕙兰 (C. faberi) 杂交获得杂交种子 ,
在离体条件下 , 其形态发生经历了原球茎到根状茎的完整过程。杂种胚遗传了两种类型兰花萌发的特
点 , 即先形成原球茎 , 再形成根状茎 , 这与曾宋君等 (1998) 在墨兰与象牙白、西藏虎头兰杂交所
得的胚萌发过程以及朱根发等 ( 2004, 2005) 报道的建兰与纹瓣兰种间杂种胚萌发过程部分相似 ,
因此对其后代的增殖可在原球茎和根状茎两个阶段进行。对于兰属杂交后代的增殖与分化 , 植物生长
调节剂具有重要作用 , 关于兰科植物原球茎的增殖和分化条件 , 在多种兰科花卉上已有报道 (朱根
发 等 , 2004; da Silva et al. , 2006)。本试验研究表明 , NAA有利于原球茎增殖 , 62BA能促进原球
茎的发生与分化 , 这与朱根发等 ( 2004) 关于墨兰与大花蕙兰种间杂种原球茎增殖研究结果不同 ,
而与 Oguratsujita和 Okubo (2006) 关于附生兰 (C. Sleep ing Beauty) ×墨兰的原球茎分化结果相同。
原球茎的增殖与分化在细胞分裂素和生长素的浓度配比与地生兰根状茎相似 , 由此表明以 ‘韩国桃
花 ’为母本 , 蕙兰为父本的种间远缘杂交 , 获得的原球茎对外源植物生长调节剂的吸收水平同亲本
中的地生兰更为相近。
对根状茎增殖和发育条件的研究表明 , 62BA与 NAA影响着根状茎增殖及绿芽分化 , 生长素 /细
胞分裂素的比值高 , 促进根状茎的增殖 , 比值低促进根状茎的分化 , 这与前人研究报道结果
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( Shimasaki & Uemoto, 1990; Paek Yeung. , 1991; Chang & Chang, 2000a, 2000b; 石乐娟 等 ,
2006) 一致。但不同兰属花卉所要求的适宜生长调节剂配比不同 , Chen等 ( 2005) 研究发现 NAA
110 mg·L - 1能有效促进蕙兰根状茎增殖 , 62BA 210 ～510 mg·L - 1附加 NAA 015或 110 mg·L - 1的组
合对根状茎芽分化有利。本试验中发现 , 62BA和 NAA的不同比例对于根状茎的形态和增殖速度具有
明显的影响。NAA刺激根状茎的分支和生长 , BA则抑制根状茎生长和分支数目。这与对春兰、建兰
等的研究报道 ( Paek & Yeung, 1991; 石乐娟 等 , 2006) 相似。此外 , 植株再生的结果表明原球茎
和根状茎转接到适当的分化培养基中均可成苗 , 而且再生形成的小植株在形态上无明显差别。
兰属多亲本种间杂交在兰花新品种培育中具有广阔的应用前景。本研究建立了杂交兰 ‘韩国桃花’
与蕙兰杂交种子的无菌播种、原球茎和根状茎增殖及植株再生体系 , 并获得了一定数量的杂交后代群
体 , 为进一步筛选株型适中且抗逆性强的新种质提供了基础。同时初步明确了来源于附生兰与地生兰杂
交种子的萌发和增殖特征 , 为今后开展兰属多亲本杂交育种以及优良株系的快速繁殖提供了参考。
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