全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（10）：1999–2004 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–04–09；修回日期：2011–08–31
基金项目：国家自然科学基金项目（31160403）；公益性行业（农业）科研专项（200903020）；国家‘863’计划子课题（2006AA100109）；
云南省科技创新强省计划项目（2007C0004Z）；国家科技支撑计划子课题（2006BAD01A1805）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：kxtang@hotmail.com）
致谢德国汉诺威大学 Thomas Debener 教授及 Helgard Kaufmann 博士给予的指导。
野蔷薇（Rosa multiflora）抗白粉病基因 RmMlo
的克隆与表达分析
邱显钦 1,2，包满珠 1，张 颢 1,2，蹇洪英 2，王其刚 2，晏慧君 2，张 婷 2，
唐开学 2,*
（1 华中农业大学园艺林学学院，教育部园艺植物生物学重点实验室，武汉 430070；2 云南省农业科学院花卉研究所，
云南省花卉育种重点实验室，昆明 650205）
摘 要：以野蔷薇（Rosa multiflora）为试材，采用 RT-PCR 和 RACE 方法从叶片中获得了一个 Mlo
同源基因的 cDNA 全长，命名为 RmMlo，GenBank 登录号为 JF 310747。序列分析结果表明，RmMlo 基因
cDNA 全长为 1 993 bp，包含 49 bp 的 5′非编码区、243 bp 的 3′非编码区和一个长度为 1 700 bp 编码 567
个氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列分析显示其蛋白质的 C 末端具有两个保守的 MLO 模体。序列比对和
系统进化分析表明，RmMlo 与拟南芥等双子叶植物的 Mlo 亲缘关系较近，相似性达 90%以上。半定量
RT-PCR 分析表明，RmMlo 在感病叶片中的表达量最高，在根中不表达，其表达模式与拟南芥的 AtMlo 有
一定差别。
关键词：野蔷薇；月季；白粉病；Mlo 基因；克隆；组织特异性表达
中图分类号：S 685.12 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）10-1999-06

Cloning and Expression Analysis of Resistance Powdery Mildew Gene
RmMlo in Rosa multiflora
QIU Xian-qin1,2，BAO Man-zhu1，ZHANG Hao1,2，JIAN Hong-ying2，WANG Qi-gang2，YAN Hui-jun2，
ZHANG Ting2，and TANG Kai-xue2,*
（1College of Horticulture and Forestry，Huazhong Agricultural University，Key Laboratory of Horticultural Plant Biology，
Ministry of Education，Wuhan 430070，China；2Flower Research Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，
Yunnan Flower Breeding Key Lab，Kunming 650205，China）
Abstract：In this research，a full-length cDNA sequence of Mlo gene，named RmMlo（GenBank
accession No. JF310747）was obtained from leaves of Rosa multiflora by RT-PCR and RACE. Sequence
analysis indicated that RmMlo was 1 993 bp in full length containing a 5′-untranslated region（5′-UTR）of
49 bp，a 3′-UTR of 243 bp，and an opening reading frame（ORF）of 1 700 bp encoding 567 amino acids.
Subsequently，amino acid sequence analysis revealed that RmMlo had two conserved MLO motifs in the
protein C-terminal. Sequence alignment and phylogenetic analysis showed that RmMlo shared more than

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90% homology with Mlo from Arabidopsis thaliana and other dicotyledon. Finally，semiquantitative
RT-PCR analysis indicated that RmMlo showed the highest expression abundance in infected leaves and no
expression in root，which was different from the expression pattern of AtMlo.
Key words：Rosa multiflora；rose；powdery mildew；Mlo；clone；tissue-specific expression

由白粉病菌（Podosphera pannosa，Pp）引起的白粉病害（Powdery mildew）是切花月季生产的
第一大病害。目前生产中主要通过反复施用化学药剂来预防和控制，不仅增加了生产成本，还造成
了环境的污染和破坏。因此，从现有的月季种质资源中发掘白粉病抗性性状及其相关基因，培育抗
白粉病的月季品种是今后遗传育种的主要方向之一（Linde & Debener，2003；唐开学 等，2008）。
最早在大麦（Hordeum vulgare）中发现的 Mlo 基因，是一类新型的抗病性基因（Wolter et al.，
1993）。对大麦的 Mlo 基因进行物理诱变，获得的突变体含有隐性 mlo 基因赋予了大麦对白粉病的
广谱抗病性（Joergensen，1992）。后续研究得出 Mlo 基因是一类单基因控制的隐性抗病基因，具有
非小种专化的持久的抗性（Büschges et al.，1997）。目前已鉴定出 83 个编码植物 MLO 同源蛋白基
因，包括：拟南芥（15）；水稻（12）；大麦（2）；小麦（3）；玉米（9）；番茄（1）；芜菁（1）；辣
椒（1）；百脉根（1）；豌豆（1）；高粱（2）；葡萄（8）；毛果杨（6）；江南卷柏（1）；烟草（1）；
北美云杉（1）和琴叶拟南芥（8）（Ralph，2005；邬晓勇 等，2010；陈玲，2011）。
本研究中通过 RT-PCR 和 RACE 技术获得了野蔷薇（Rosa multiflora）RmMlo 基因 cDNA 全长
序列，并对该基因的组织特异性进行了分析，旨在为进一步研究月季 RmMlo 基因的功能，探讨该基
因如何参与月季抗病的调控机制提供理论依据和基础数据，为今后利用基因工程技术培育抗白粉病
的月季新品种提供候选基因。
1 材料与方法
1.1 材料
2009 年 4 月在云南省农业科学院花卉研究所基地采集野蔷薇健康幼叶、花瓣、花蕾和根，以及
感染白粉病的叶片，感染黑斑病的叶片和刀伤叶片，置于液氮中速冻，存于–80 ℃冰箱保存备用。
RNA 提取、合成 cDNA 及克隆等所用药品均购自 TaKaRa 公司，采用 CTAB 法（Kaufmann et al.，
2010）提取上述 7 种组织的总 RNA。而后利用 M-MLV 反转录酶按照说明书合成第一链 cDNA。
1.2 野蔷薇 Mlo 基因 cDNA 全长的获得
根据 GenBank 上已有的植物 Mlo 同源基因和本课题组前期已测得的部分月季基因组序列，设计
引物 forward 5′-AAAACACCAACATGGGCAGT-3′和 reverse 5′-CAGCTGAAATGCATTCTGGA-3′，以
健康叶片 cDNA 第一链为模板进行 PCR 扩增。扩增条件为：95 ℃预变性 5 min，94 ℃ 变性 45 s，
55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共 35 个循环，最后 72 ℃后延伸 10 min。凝胶回收与预期片段
大小一致（1 000 bp 左右）的泳带，回收产物连接到载体 PMD18-T 上并转化大肠杆菌 DH10B，通
过蓝白斑筛选及质粒酶切鉴定阳性克隆后，委托 Invitrogen 公司进行测序。
根据所得的 cDNA 中间序列分别设计特异引物，3′端引物序列：outer 5′-AACCATGATGGGGATG
AGGA-3′，inner 5′-GGGGATGAGGATCCAGGAAA-3′；5′端引物序列：outer 5′-GCCGGAAACTGAA
GACAGAAT-3′，inner 5′-TGTTAGGAGCAAGGACAGGAA-3′。按照 RACE 试剂盒 FirstChoice®RLM-
RACE Kit（part No. AM1700）说明书进行 cDNA 前端和末端快速扩增。凝胶回收、产物克隆及序列
测序如上所述。
10 期 邱显钦等：野蔷薇（Rosa multiflora）抗白粉病基因 RmMlo 的克隆与表达分析 2001

1.3 蛋白质序列比对及系统发生分析
将得到的野蔷薇 RmMlo 基因的 cDNA 序列和开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）编码的
氨基酸序列在 GenBank 数据库中进行 BLAST 分析。用 Clustal W 程序（Ralph，2005）将 RmMlo
推导的氨基酸序列同 GenBank 上 MLO 同源蛋白序列 BrMLO（芜菁 Brassica rapa，AY967409）、
LjMLO（百脉根 Lotus japonicus，AY967410）、LeMLO（番茄 Lycopersicon esculentum，AY967408）、
CaMLO（辣椒 Capsicum annuum，AY934528）、AtMLO2（拟南芥 Arabidopsis thaliana，AF369563）、
AtMLO6（AF369567）、AtMLO12（AF369573）、OsMLO2（水稻 Oryza sativa，AF384030）、ZmMLO1
（玉米 Zea mays，AX029312）、TaMLO1（小麦 Triticum aestivum，AX063298）和 HvMLO（大麦
Hordeum vulgare，Z83834）进行多重比较。利用 MEGA 4.0.2 软件，选择连接近邻算法 NJ（Neighbour
joining）构建系统进化树（Saitou & Nei，1987）。
1.4 半定量 RT-PCR 表达分析
用半定量 RT-PCR 技术检测 RmMlo 基因在野蔷薇 7 种组织中的表达水平和组织特异性。上下游
引物分别为 forward 5′-AGCAGTGAAAAGTTGGCATC-3′和 reverse 5′-TTTCTGCAAATGCTCAAAC
A-3′，通过 GenBank 上月季 Actin 基因的 EST 序列设计内参引物，Actin-F 5′-CGAGGAAGATCTG
GCATCA-3′和 Actin-R 5′-AGGAGCTGCTCTTGGCAGT-3′。扩增条件为：94 ℃预变性 3 min，95 ℃
变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共 30 个循环，最后 72 ℃后延伸 10 min。扩增产物经
0.8 %琼脂糖凝胶电泳，EB 染色后经凝胶成像系统成像，用软件 AlphaEaseFC 4.0 分析该表达丰度
和组织特异性。以 RmMlo 和 Actin 的平均积分光密度值（MOD）的比值作为表达水平的直观指标，
3 次重复，数据经正反切变换后用 SPSS 13.0 进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 RmMlo 基因全长 cDNA 序列的获得
利用 RT-PCR 和 RACE 技术（图 1），通过多次扩增、产物克隆和测序等手段，从野蔷薇中克隆
获得了 RmMlo 基因全长 cDNA，全长为 1 993 bp，包括 49 bp 的 5′-UTR，243 bp 的 3′-UTR 和 1 700 bp
的 ORF，其 ORF 编码一个含 567 个氨基酸的蛋白质。通过 BLAST 比对和同源性分析表明，该基因
与拟南芥 AtMlo 基因家族的同源性最高，命名为 RmMlo，GenBank 登录号为 JF310747。
图 1 RmMlo 基因的 PCR 扩增电泳图
M1，M2：Wide range DNA marker；A：RmMlo 特异片段扩增产物；B：5′RACE 扩增产物；C：3′RACE 扩增产物。
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis analysis of RmMlo gene fragments
M1，M2：Wide range DNA marker；A：Amplification product of RmMlo gene fragment；
B：Amplification product of 5′RACE；C：Amplification product of 3′RACE.
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2.2 RmMlo 基因编码氨基酸的同源性分析
利用 Bioedit 软件辅助手工校对，对 RmMlo 基因和其他植物同类基因进行同源性比对分析。结
果发现，该基因的 C 末端结构域与其他植物均存在两个高度保守的 MLO 模体（图 2，motif 1、2）。
通过 NCBI 网上序列 BLAST 分析，RmMlo 基因编码氨基酸与已知其他植物的 MLO 蛋白氨基酸序列
具有很高的同源性，其中与双子叶植物拟南芥、芜菁等的亲缘关系更近，相似性达 90%以上；与单
子叶植物水稻、玉米等的相似性也达 80%以上。
图 2 RmMlo 基因所编码氨基酸 C 末端结构域 BLAST 分析及 MLO 模体
Fig. 2 Alignment of the C-terminal domain of the predicted amino acid sequence of RmMlo with the most similar
sequences identified in BLAST and MLO-motifs which were marked in the box
在多重比对的基础上，为进一步了解 RmMlo 基因与其他植物同类基因之间的进化关系，用上述
12 个 MLO 的氨基酸序列构建了系统进化树。结果（图 3）表明，该 12 个序列可明显分为两大类，
双子叶和单子叶类，说明该基因的进化符合植物学的分类，具有明显的种属特征。
图 3 野蔷薇 MLO 与其他物种 MLO 氨基酸序列的系统进化分析
Fig. 3 Phylogenetic analysis of MLO in R. multiflora with other MLO proteins from other species
10 期 邱显钦等：野蔷薇（Rosa multiflora）抗白粉病基因 RmMlo 的克隆与表达分析 2003

2.3 半定量 RT-PCR 表达分析
用半定量 RT-PCR 技术检测 RmMlo 基因在野蔷薇 7 种不同组织中的表达水平和表达的组织特异
性，以月季的 Actin 基因作内参。结果（图 4）显示，RmMlo 基因在健康叶片、感病叶片、刀伤叶
片、花和花瓣中均有表达，在根中不表达。其表达水平为感白粉病叶片 > 感黑斑病叶片 > 刀伤叶
片 > 花瓣 > 花 > 叶片 > 根（图 5）。



图 4 RmMlo 基因在野蔷薇 7 种组织中表达的半定量 RT-PCR 分析
A：叶片；B：感染白粉病叶片；C：感染黑斑病叶片；D：花；E：根；F：花瓣；G：刀伤叶片。
Fig. 4 Expression analysis of RmMlo in seven tissues of Rosa multiflora by semiquantitative RT-PCR with Actin as control
A：Leaf；B：Leaf infected by powder mildew；C：Leaf infected by black spot；
D：Flower；E：Root；F：Petal；G：Cut leaf.

图 5 RmMlo 基因在野蔷薇 7 种组织中的表达丰度
A：叶片；B：感染白粉病叶片；C：感染黑斑病叶片；D：花；E：根；F：花瓣；G：刀伤叶片。
Fig. 5 Expression abundance of RmMlo in seven tissues of Rosa multiflora
A：Leaf；B：Leaf infected by powder mildew；C：Leaf infected by black spot；
D：Flower；E：Root；F：Petal；G：Cut leaf.
3 讨论
本研究中通过 RT-PCR 和 RACE 方法从野蔷薇叶片中成功分离出 Mlo 的同源基因 RmMlo，该基
因编码的蛋白质具有 MLO 家族保守存在的所有功能位点和特征多肽序列（Ralph，2005）。基因序
列同源性分析发现，Mlo 编码区保守性很强，不同科植物间核苷酸水平上的同源性大于 60%，氨基
酸水平上的同源性达 80%，可以用作植物进化研究的候选基因。本研究中以包括野蔷薇在内的 10
个物种的 12 个 MLO 蛋白氨基酸序列构建了系统进化树，结果发现，Mlo 基因的进化具有明显的种
属特征，RmMlo 与拟南芥、芜菁、百脉根和辣椒等双子叶植物的同源关系更近，与单子叶植物水稻、
玉米、小麦和大麦的亲缘关系较远，这与植物学传统分类系统一致。
半定量 RT-PCR 分析表明，RmMlo 基因在野蔷薇的健康叶片、感病叶片、刀伤叶片、花和花瓣
2004 园 艺 学 报 38 卷
中表达，在根中不表达，且在感病叶片中表达量最高。其表达模式同拟南芥的 AtMlo 基因存在一定
的差异，在拟南芥中，AtMlo 基因在花序、茎、叶片、芽和根中均有表达（Chen et al.，2006）。这
种差异一方面可能源于 Mlo 同源基因在被子植物不同辐射类群中本身的功能分化，另一方面也可能
是因为多年木本植物与草本植物在抗性进化调控方面本身存在着差异。
为进一步研究 RmMlo 基因的结构和功能，项目组正在计划构建该基因的高表达载体和沉默基因
载体，进而转化高抗和高感月季材料验证其生物学功能，为今后培育抗白粉病月季新品种提供可操
作基因。

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