全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (3) : 341 - 346
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 08 - 26; 修回日期 : 2008 - 12 - 15
基金项目 : 成都市龙泉驿区农发委重点项目3 E2mail: 5787huangyun@ sina1com1cn; Tel: 083522886205
桃黄化病病原植原体的鉴定及 16S rDNA序列分析
黄　云 13 , 王　靖 1 , 赵艳琴 2 , 何　苗 1
(1四川农业大学植物病理系 , 四川雅安 625014; 2 内蒙古民族大学植保系 , 内蒙古通辽 028043)
摘 　要 : 对四川省成都市龙泉驿区桃植原体黄化病病原进行了研究。经 DAP I荧光染色 , 在荧光显微镜
下观察到病叶叶脉韧皮部存在荧光点 ; 在透射电镜下病叶韧皮部存在植原体菌体 , 其大小为 40～650 nm, 平
均大小 350 nm, 单位膜厚度 10～16 nm。利用植原体 16S rDNA通用引物对桃植原体黄化病患病植株提取的
DNA进行 nested2PCR扩增 , 获得 115 kb的特异片段 , 同时构建了 16S rDNA系统进化树。桃黄化病植原体序列
与油桃黄化 NecY2In1 (nectarine yellows) 病原同源性最高。从而探明了桃黄化病病原为植原体及其分类地位。
关键词 : 桃 ; 桃黄化病 ; 植原体 ; 病原形态 ; 系统发育 ; 16S rDNA
中图分类号 : S 66211　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0320341206
The Iden tif ica tion and Sequence Ana lysis of 16S R ibosoma l D NA of the Phy2
toplasm a sp. A ssoc ia ted w ith Peach Y ellow D isea se
HUANG Yun13 , WANG J ing1 , ZHAO Yan2qin2 , and HE M iao1
( 1D epartm ent of P lant Pa thology, S ichuan A gricu ltura l U niversity, Yapian, S ichuan 625014, Ch ina; 2D epartm en t of P lant Protec2
tion, InnerM ongolia U niversity for the N ationa lities, Tongliao, InnerM ongolia 028043, China )
Abstract: The phytop lasma associated with peach yellow disease occurred in Longquanyi D istrict in Si2
chuan Province was studied. The specific fluorescence dots for the pathogen were observed in phloem cells of
leaf veins under a fluorescence m icroscope by staining with 4, 62diam idino222phenylindole diacetate. Phyto2
p lasma2like particles were also found in the same tissues under a transm ission electronic m icroscope. Its diam2
eter was 40 - 650 nm , 350 nm on average and the thickness of the unit membrane of the pathogen was 10 - 16
nm. The 16S rDNA about 115 kb was amp lified by nested2PCR with universal p rimers for Phytoplasm a using
the total DNA extracted from diseased peach as the temp lates. A phylogenetic tree was constructed based on
the sequences of 16S rDNA. The result showed that Phytoplasm a associated with peach yellow disease was
closely related to nectarine yellows (NecY2In1).
Key words: peach; peach yellow disease; Phytoplasm a; morphology; phylogenetics; 16S rDNA
近年来桃黄化病的危害日趋严重 , 导致树势衰弱 , 产量和品质下降。引起桃黄化病的原因有两
种 , 一是缺铁所引起的生理性黄化病 , 二是由植原体所致的侵染性病害。自 1967年日本学者 Doi在
桑树萎缩病的病树韧皮部组织中发现了与动物病原支原体相似的细菌 (原称类菌原体 , MLO; 现称
植原体 ) 以来 , 迄今 , 全世界报道的由植原体自然导致的植物病害有 700余种 , 我国报道了 70多种
(李永 等 , 2005)。由于植原体存在于寄主植物韧皮部 , 菌体大小为 80～1 000 nm, 无细胞壁 , 不能
人工培养等特点 , 在诊断和鉴定上存在诸多困难。近 10年来 , DAP I荧光显微技术和透射电镜技术被
广泛应用于植原体病害的检测和植原体分布的研究 , 植原体 16S rDNA序列分析已广泛用于植原体的
系统发育、分类和鉴定 (Lee et al. , 1998; Subandiyah et al. , 2000; 蔡红 等 , 2002, 2005; 葛泉卿
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园 　　艺 　　学 　　报 36卷
等 , 2005; 张华明 等 , 2005)。作者采用 DAP I荧光显微技术、透射电镜观察桃植原体黄化病病原的
形态特征 , 并从分子水平证明国内桃黄化病的病原是植原体 ; 对植原体 16S rDNA进行序列测定 , 并
将其与已知的植原体序列共同构建系统发育树 , 以探明桃黄化病植原体与已知植原体种类的关系。
1　材料与方法
111　供试材料
2007年 3月 , 从四川省成都市龙泉驿区的 4个重病果园采桃黄化病病叶 , 每个果园随机选取重
病桃树 50株 , 每株从东南西北中 5个方位各采叶片 25片 , 无病桃叶采自四川农业大学果园 , 采后置
于冰壶内并迅速带回实验室。阳性对照枣疯病 ( Jujube witches’2broom ) 材料采自重庆市奉节县。
PCR扩增反应试剂为宝生物工程 (大连 ) 有限公司产品。
112　桃黄化病叶中植原体观察
11211　荧光显微镜观察 　将病叶叶柄和叶脉固定于 5%戊二醛缓冲液中 , 4 ℃保存备用。切片经 011
mol·L - 1磷酸缓冲液 (pH 710) 冲洗 3次 ; 用 110μg·mL - 1的 4, 6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚 (4, 62
diam idino222phenylindole, DAP I) 溶液染色 10～15 m in; 用 N ikon280 i荧光显微镜检测 , 阻断滤光片波
长为 420 nm (王秀伶 等 , 1999)。
11212　透射电镜观察　剪取 115 mm ×215 mm叶脉 , 样品制备按徐柏森等 (2006) 的方法改进 , 经戊二
醛和锇酸双固定 , 系列丙酮梯度脱水 , 渗透 , 包埋和切片 , 染色后用 H2600透射电镜观察、拍照。
113　桃黄化病叶中植原体的分子检测
11311　总 DNA的提取 　分别取 3 g桃树植原体黄化病株及健康植株的叶脉 , 参照 Lee等 ( 1993)、
Neimark和 Kirkpatrick (1993) 的方法提取 DNA。然后于 - 20 ℃冰箱中保存备用。
11312　16S rDNA的 PCR扩增 　根据植原体的 16S rDNA保守区序列 , 参照 Lee等 (1993) 的序列合
成植原体检测特异引物。PCR引物对分别为 R16mF2 (5′2 CATGCAAGTCGAACGGA 23′) 和 R16mR2
(5′2CTTAACCCCAATCATCGAC 23′) , 由宝生物工程 (大连 ) 有限公司合成。以枣疯病病株总 DNA
为阳性对照 , 桃健康株总 DNA为阴性对照 , 以超纯水为空白对照。PCR反应体系为 50μL, 其中 10
×buffer (无 MgCl2 ) 5μL, 0125 mol·L - 1MgCl2 5μL, 10 mmol 4 ×dNTP 8μL, 模板 DNA 20 ng, 10
pmol引物各 2μL, Taq DNA聚合酶 015μL, 灭菌去离子水 2515μL。PCR扩增条件为 : 变性 94 ℃ 4
m in, 复性 50 ℃ 1 m in, 延伸 72 ℃ 2 m in; 然后变性 94 ℃ 115 m in, 复性 50 ℃ 115 m in, 延伸 72 ℃
215 m in, 35次循环 ; 变性 94 ℃ 0175 m in, 复性 50 ℃ 1125 m in, 延伸 72 ℃ 215 m in; 最后 72 ℃保温
10 m in, 4 ℃保存备用。取 5μL PCR产物进行 1%的琼脂糖凝胶 (加 0105μL·mL - 1 Goldview核酸染
料 ) 电泳 , 紫外检测仪 254 nm波长下观察并拍照。
11313　16S rDNA的 nested2PCR扩增 　根据 Gunderson和 Lee ( 1996) 的方法合成 nested2PCR引物 ,
引物对分别为 R16F2n (5′2 GAAACGACTGCTAAGACTGG23′) 和 R16R2n ( 5′2TGACGGGCGGTGTGTA2
CAAACCCCG23′)。将 PCR扩增中获得的 PCR产物稀释 30倍后分别作为 DNA模板进行 nested2PCR反
应 : 95 ℃预变性 5 m in; 95 ℃ 30 s, 57 ℃ 1 m in, 72 ℃ 1 m in, 40次循环 ; 最后 72 ℃延伸 10 m in。
114　16S rD NA核苷酸序列同源性比较
11411　DNA序列测定 　PCR产物纯化及测序由宝生物工程 (大连 ) 有限公司完成。核苷酸序列
GenBank登录号为 lcl1211083。
11412　DNA序列及其系统演化分析 　用 CLUSTAL X 118软件对所测定的桃黄化病核苷酸序列与已知
的不同种植原体及桃黄化组不同株系序列进行比对 ( alignment) , 并运用 Mega 210进行序列分析 , 采
用 Neighbor Joining方法构建系统进化树 , 对所构建系统发育树进行自举检验 ( bootstrap ) , 重复 1 000
次 , 获得分支的支持率。分析过程中选择 D iaporthe vaccin ii为外群 (outgroup)。
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　3期 黄 　云等 : 桃黄化病病原植原体的鉴定及 16S rDNA序列分析 　
2　结果与分析
211　桃黄化病叶中植原体观察
21111　荧光显微镜观察 　经 DAP I荧光染色后 , 在荧光显微镜下表现黄化的桃叶片叶柄和叶脉横纵
切片中观察到特异的白色荧光点和成云片状的荧光带 (在图 1黑白照片中白色荧光点和成云片状的
荧光带显示为黑色 ) , 荧光存在于韧皮部的薄壁细胞、筛管和伴胞中。在枣疯病的组织切片中也观察
到了同样的荧光带 , 而在桃树的健康组织切片中未见 (图 1)。
21112　透射电镜观察 　仅在桃树韧皮部发现植原体 , 存在于韧皮部薄壁细胞、筛管细胞及伴胞中 ,
伴胞中数量极少 , 多集中在筛管细胞的筛板附近。叶脉筛管细胞中存在有近球形、椭圆形、哑铃形和
丝状体以及大量 100 nm以下形状不规则的植原体。桃黄化植原体大小 40～650 nm (图 2)。
　　植原体存在电子云密度高低两种 (图 3, 图 4)。从电镜照片中可以清晰看到植原体两暗一明的双膜
结构 (图 3) , 膜间距约为 12～22 nm, 内、外膜厚度 10～16 nm。在健康叶中未见植原体的存在。
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212　桃黄化病样中植原体 16S rD NA的 PCR和 nested2PCR检测
桃树黄化病病树、枣疯病病树和无病桃树叶脉 , 各样品总 DNA提取液琼脂糖凝胶电泳结果 , 均
出现一条明显的亮带 , 小分子量的 DNA及 RNA弥散带极少。说明 DNA提取液纯度较高。
　　采用 Lee 等 ( 1993) 设计的植原体通
用引物对 R16mF2 /R16mR2对桃黄化病病株
的总 DNA进行 PCR检测。但桃黄化病病株
组织和健康组织总 DNA中未能扩增出特异
条带。
将桃黄化病病株的 PCR产物稀释 30倍
后作为模板 , 用通用引物对 R16F2n /R16R2
为引物 , 进行 nested2PCR扩增。结果显示 :
龙泉驿区 4个样品均扩增出 115 kb的 DNA
条带 (图 5 ) , 该 DNA 片 段 与 Lee 等
(1993) 报道的相符 , 并且该片段与阳性对
照枣疯病所扩增出来的条带大小一致 , 而健
康对照和空白对照都未扩增出特异性扩增
带。
图 5　nested2PCR扩增结果
1: 空白对照 ; 2: 健康桃树 ; 3: 枣疯病 ; 4: 天鹅林桃树黄化病 ;
5: 联合村桃树黄化病 ; 6: 苹果村桃树黄化病 ;
7: 花果村桃树黄化病 ; M: DNA标量 V。
F ig. 5　The agarous gel electrophoresis of nested2PCR product
1: B lank check; 2: Health peach; 3: Jujube witchespi2broom;
4 - 7: Peach yellow disease occurred in Swan Woods, Unite V illage,
App le V illage and Huaguo V illage; M: Marker V.
213　桃黄化病植原体与相关植原体核苷酸序列的比较
回收 PCR产物 , 纯化后利用 nested2PCR引物为测序引物进行序列测定 , 获得 1 211 bp的桃黄化
病植原体 16S rDNA扩增片段序列。用 BLAST在 GenBank中搜索同源序列 , 结果发现 : 桃黄化病植原
体与植原体序列枣疯病 JWB ( jujube witchespi2broom; GenBank登录号为 AY197661) , 桃黄化病 PY2In
(peach yellows; GenBank登录号为 AY197660) 及油桃黄化病 NecY2In1 ( nectarine yellows; GenBank
登录号为 AY332659) 高度同源。将这 4种植原体的 16S rDNA核苷酸序列进行比对 , 桃黄化病植原
体与 JWB植原体有 1个核苷酸的差异 , 与 PY2In植原体有 2个核苷酸的差异 , 而与 NecY2In1植原体
也仅有 3个核苷酸的差异。桃黄化病植原体与 JWB、PY2In及 NecY2In1的序列相似性均高达 99%。
214　桃黄化病植原体系统树构建与分析
采用 Clustal X 118对序列片段进行比对 , 运用 Mega 210进行序列分析 , 利用 Neighbor Joining方
法构建进化树后结果表明 : 桃黄化病植原体序列与油桃黄化 NecY2In1 ( nectarine yellows; GenBank登
录号为 AY332659) 病原同源性最高 , 可能为同一种病菌。图 6中每一分支上自举支持率较小的原因
可能是序列较短 , 但不影响结果可靠性。
图 6　用 16S rD NA序列构建的最大简约树
分支上数值为自举支持率。
F ig. 6　Phylogenetic tree ba sed on 16S rD NA sequences
Bootstrap values are shown on branches.
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　3期 黄 　云等 : 桃黄化病病原植原体的鉴定及 16S rDNA序列分析 　
3　讨论
311　桃黄化病叶中植原体观察
DAP I荧光染色法可用于枣疯病 (王秀伶 等 , 1999) 和泡桐丛枝病 (袁巧平 等 , 1994) 的植原
体的检测。用该法观察四川省成都市龙泉驿区桃黄化病发现韧皮部存在大量特异荧光点和荧光带 , 而
在健康对照中未见。这说明在黄叶桃树的韧皮部存在大量的植原体 , 也证明 DAP I可用于桃植原体黄
化病的病原初步诊断。桃黄叶植原体寄生在桃树韧皮部的薄壁细胞、筛管细胞和伴胞中。这一结果与
金开璇等 (1989) 关于泡桐丛枝病植原体的报道一致。
透射电镜下观察到植原体具有多型性 , 大多以近球形和椭圆形为主 , 还有哑铃形、丝状体和大量
100 nm以下不规则形态的植原体 , 这与徐均焕和朱家新 (1998) 报道的桑萎缩植原体的形态一致。
本试验中该植原体存在电子云密度高低两种 , 可能是植原体所处的生长期不同所致 , 在徐均焕和朱家
新 (1998) 报道的桑萎缩植原体中也存在这样的结构。电子云密度高的形成一个实心的近球体 ; 电
子云密度低的又分为两种 , 一种是仅有外膜及少量内容物的空泡型植原体 , 另一种是中间低而外围电
子云密度高的不均匀型的植原体。桃黄化植原体大小在 40～650 nm之间 , 多在 300 nm左右 , 这与孙
福生等 (1993) 报道的 80～800 nm的泡桐丛枝病植原体相接近 , 但与冷怀琼等 (1998) 报道的桃黄
化植原体平均为 600 nm的结果不一致 , 这可能是因采样的时期不同而致。桃黄叶植原体单位膜厚度
为 10～16 nm , 这一结果与罗大全等 (2001) 对海南槟榔黄化的报道 9～13 nm接近。
312　桃黄化病中植原体的分子检测及 16S rD NA核苷酸序列同源性比较
利用植原体 16S rDNA 通用引物对患桃黄化病植株的总 DNA进行了 nested2PCR扩增 , 获得了
1 211 bp的 DNA片段 , 并进行核苷酸序列分析 , 从分子水平上证明了龙泉驿桃黄化病的病原为植原
体。
单一 PCR的灵敏度易受植物组织提取液的影响 , 从而造成扩增的特征带不明显或混有杂带 , 因
此在试验中 , 采用了 nested2PCR进行病原的检测。nested2PCR包括 2次 PCR扩增 , 第 2对引物为 1
对嵌套式引物 , 可大大提高扩增产物的特异性及检测的灵敏度。
目前国际上普遍接受的植原体分类系统是根据 16S rDNA 限制性片段长度多态性分析 ( RFLP)
和核糖体蛋白质基因序列分析建立的。由于 16S rRNA在进化中高度保守 , 其序列分析可作为植原体
等原核生物系统发育及分类研究的标准方法 (L im & Sears, 1989; Seemuller et al. , 1998)。
本研究中桃黄化病植原体序列与油桃黄化 NecY2In1 ( nectarine yellows; GenBank 登录号为
AY332659) 病原同源性最高 , 可能为同一种病菌。但所构建的系统进化树中每一分枝上的自举支持
率较小 , 可能是序列较短所致 , 但结果的可靠性不会受到影响。
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