全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（12）：2342–2348 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–05–10；修回日期：2011–10–25
基金项目：国家自然科学基金项目（30900115，31070275）；中央高校基本科研业务费专项基金项目（DL09BA08）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：lyhshen@126.com）
羽衣甘蓝 ARC1 的基因分离、表达及与 SRK 相
互作用的分析
蓝兴国，杨 佳，赵 昕，李玉花*
（东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040）
摘 要：以羽衣甘蓝（Brassica oleracea var. acephala）自交不亲和系（S13-bS13-b）为试验材料，利用
RT-PCR 的方法分离其 ARC1 基因 cDNA 序列（命名为 BoARC1，GenBank 登录号为 EU344909）。BoARC1
cDNA 序列中含有 1 个 1 992 bp 的开放读码框（ORF），编码 1 个含有 663 个氨基酸的蛋白质。羽衣甘蓝
BoARC1 与油菜 BnARC1 的氨基酸序列具有 94%的一致性；Southern 杂交结果显示 BoARC1 在基因组中
只存在单一拷贝；Northern 杂交结果显示 BoARC1 特异性地在柱头组织中表达；在酵母双杂交试验分析中，
BoARC1 能够与 SRK3、SRK13-b 和 SRK910 的胞内激酶域发生相互作用。
关键词：羽衣甘蓝；自交不亲和；ARC1；相互作用
中图分类号：S 681.9 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）12-2342-07

Isolation，Expression of ARC1 from Ornamental Kale and Interaction
Analysis Between ARC1 and SRK
LAN Xing-guo，YANG Jia，ZHAO Xin，and LI Yu-hua*
（College of Life Sciences，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China）
Abstract：The ARC1 cDNA sequence was isolated from stigma of ornamental kale（Brassica oleracea
var. acephala）S13-bS13-b homozygotes using RT-PCR techniques，named BoARC1（GenBank accession No.
EU344909）. The BoARC1 cDNA sequence had an ORF of 1 992 bp，encoding a 663-aa protein. The
deduced amino acid sequence of isolated BoARC1 shared 94% identity with Brassica napus ARC1.
Southern blot analysis showed that there was a single copy of BoARC1 gene in genome. Northern blot
analysis showed that BoARC1 mRNA only expressed in the stigma. The yeast two-hybrid analysis
indicated that the BoARC1 interacted with SRK3，SRK13-b and SRK910.
Key words：Brassica oleracea var. acephala；self-incompatibility；ARC1；interaction

自交不亲和性（Self-incompatibility，SI）是显花植物采取的一种避免自交，促进种内遗传多样
性的机制（Franklin-Tong，2008）。芸薹属植物 SI 反应是由花粉外壁蛋白 SCR（S-locus cysteine-rich
protein）/SP11（S-locus protein 11）与柱头乳突细胞膜 SRK（S-locus receptor kinase）受体特异性相
互作用引起的（Kachroo et al.，2001；Takayama et al.，2001；杨洋 等，2009）。SCR/SP11 配体是一

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个低相对分子质量并富含半胱氨酸的分泌蛋白，决定花粉的 SI（Schopfer et al.，1999；Takayama et
al.，2000）。
SRK 受体具有 3 个结构域：胞外域、跨膜结构域和胞内激酶域，控制柱头乳突细胞的 SI（Goring
& Rothstein，1992；Takasaki et al.，2000）。当花粉落到柱头表面之后，花粉 SI 信号分子 SCR/SP11
转运到柱头乳突细胞的表面，被受体 SRK 的胞外域识别，并引起 SRK 胞内域的磷酸化，通过下游
的信号传递来完成 SI 反应（Cabrillac et al.，2001；王艳红 等，2009；Ivanov et al.，2010；Tantikanjana
et al.，2010）。
利用酵母双杂交系统筛选 SRK 相互作用的蛋白，获得了 ARC1（armadillo repeat-containing
protein 1）、激酶相关的蛋白磷酸酶（kinase associated protein phosphatase）、硫氧还蛋白、钙调蛋白
（calmodulin）和分选连接蛋白（sorting nexin）（Bower et al.，1996；Gu et al.，1998；Vanoosthuyse
et al.，2003）。其中，ARC1 作为 S 位点受体激酶（SRK）的下游底物，在自交不亲和信号传递过程
中起着正调控因子的作用。转入 ARC1 反义基因的植株具有部分打破 SI 的现象（Stone et al.，1999）。
此外，在体外泛素化试验中，ARC1 具有 E3 泛素连接酶的活性；而且在自交授粉过程中，柱头内
蛋白质泛素化的水平特异性地增高（Stone et al.，2003；蓝兴国 等，2009，2010）。因此认为，
ARC1 利用其 E3 泛素连接酶的活性，将其下游底物通过泛素/26S 蛋白酶体途径降解从而引起 SI
反应。
本研究中以羽衣甘蓝自交不亲和系（S13-bS13-b）为研究试材，分离了 ARC1（BoARC1）基因。
对 BoARC1 进行序列及基因组拷贝数的分析，通过 Northern 杂交检测 BoARC1 mRNA 的表达模式，
利用酵母双杂交系统检测 BoARC1 与 SRK 胞内激酶域间的相互作用，从而为深入探讨 SI 的分子机
制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料及其 BoARC1 cDNA 的分离
将羽衣甘蓝自交不亲和系（S13-bS13-b）于 2008 年 6 月—2009 年 5 月种植于东北林业大学花卉生
物工程研究所。
采集开花当天的柱头，利用 CTAB 法提取柱头总 RNA（蓝兴国 等，2009）。
RNA 反转录采用 AMV 反转录酶（TaKaRa）和锚定引物 Oligo (dT)18，反转录的程序为 42 ℃孵
育 30 min，99 ℃变性 5 min 和 4 ℃孵育 5 min。根据油菜 BnARC1 的 5′和 3′末端编码区（Gu et al.，
1998）设计 BoARC1 特异性引物 1（5′-TGTTCATTGATGTTCTACCC-3′）和引物 2（5′-GTTCTCTATC
ATAAGACC-3′），进行 BoARC1 编码区序列的扩增。
PCR 以反转录的第 1 条链作为模板，利用 LA Taq DNA 聚合酶（TaKaRa）进行反应，扩增条件
为 94 ℃变性 30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min，共 35 个循环，72 ℃延伸 7 min。PCR 产物用
MagExtractor-PCR & Gel Clean up（东洋纺）回收，与 pGEM-T 载体连接，转化到 Top10 菌株中，
挑选阳性克隆，进行 DNA 序列测定。
1.2 BoARC1 的 Southern 杂交分析
提取叶片组织基因组 DNA（6 ~ 7 µg），分别用 EcoRⅠ、XbaⅠ、SalⅠ限制性内切酶进行消化
后，用 0.7%琼脂糖凝胶电泳分离；然后将 DNA 片段转移到 HybondTM-N 尼龙膜上；探针是以获得
的 BoARC1 编码区序列设计的引物 1（5′-GGTTACGACCTCAAAACAGG-3′）和引物 2（5′-TCC
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GGTCCAAATCACACAAC-3′），扩增片段长度为 308 bp，用地高辛标记；凝胶在变性液（0.5 mol · L-1
NaOH 和 1.5 mol · L-1 NaCl）中处理后，65 ℃水浴锅中过夜杂交；杂交后用 2% SSC 和 0.1% SDS
的溶液在室温下洗膜两次，每次 5 min；再用 0.1% SSC 和 0.1% SDS 溶液在 65 ℃洗 30 min，进行 X
光片显影。
1.3 BoARC1 的 Northern 杂交分析
提取根、茎、叶、花瓣、花药和不同发育阶段柱头的总 RNA（15 µg），用 0.7%琼脂糖凝胶电泳
分离；然后将 RNA 片段转移到 HybondTM-N 尼龙膜上；探针与 Sourthern 杂交探针相同；尼龙膜在
65 ℃水浴锅中过夜杂交；杂交后用 2% SSC 和 0.1% SDS 的溶液在室温下洗膜两次，每次 5 min；再
用 0.1% SSC 和 0.1% SDS 溶液在 65 ℃洗 30 min，进行 X 光片显影。
1.4 BoARC1 与 SRK 的酵母双杂交分析
将 BoARC1、BnARC1（Gu et al.，1998）全长编码区 cDNA 连接到 pGADT7 酵母表达载体中，
构建AD-BoARC1、AD-BnARC1质粒，利用的引物为BO1（5′-GGAATTCCATATGGCCACTGATTCAG
CAATGTTC-3′）和 BO2（5′-CAGAATTCTTATCTCTGTGTTTTCTGGTCGC-3′）；BN1（5′-GGAATTCCA
TATGGCCACTGATTCAGCAATGTTC-3′）和 BN2（5′-CAGAATTCTTATCTCTGTGTGTTCTGGTCGC-
3′）。
另一方面，将编码甘蓝 SRK3（Delorme et al.，1995）、羽衣甘蓝 SRK13-b（蓝兴国 等，2010）、
油菜 SRK910（Goring et al.，1992）激酶结构域的 cDNA 分别连接到酵母表达载体 pGBDT7 中，构
建 BD-SRK3、BD-SRK13-b、BD-SRK910，利用的引物为 SRK3-1（5′-CGGAATTCAAAAGAAAACAAAA
GCGAGC-3′）和 SRK3-2（5′-CGGGATCCTTACCGGGCATCGATGAATGAGC-3′）；SRK13-b-1（5′-CATG
CCCATGGAGAAAAGGAAACAAAATCGAGC-3′）和 SRK13-b-2（5′-CGGGATCCTTACCGGGCATCGA
TGACTGAGC-3′）；SRK910-1（5′-CATGCCCATGGAGAAAAGGAAACAAAAGCGAGC-3′）和SRK910-2
（5′-CGGGATCCCTACCGGGCATCGATGTCTGA-3′）。
酵母双杂交系统参照 Clontech 公司的 GAL4 Two-Hybrid System 3 系统的说明书，使用的酵母菌
株为 Y187，采用醋酸锂转化法进行酵母的转化，利用滤纸转移法检测 β–半乳糖苷酶的分泌，将附
着有酵母克隆的滤纸在液氮速冻后，放在浸有 Z-buffer/X-β-Gal 的滤纸上，在室温孵育 2 h 内，显蓝
色为阳性结果。
2 结果与分析
2.1 BoARC1 基因的克隆与序列分析
利用已知油菜 BnARC1 基因的序列设计引物，通过 RT-PCR 的方法从羽衣甘蓝的柱头组织中获
得 ARC1（BoARC1）的 cDNA 序列，GenBank 收录号为 EU344909。
BoARC1 的 cDNA 序列含有一个 1 992 bp 的开放读码框（ORF），编码一个含有 663 个氨基酸的
蛋白质。通过氨基酸序列比对分析显示，BoARC1 的序列与油菜 BnARC1 的序列具有 94%的一致性
（图 1）。




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图 2 BoARC1 的 Sourthern 杂交分析
Fig. 2 Sourthern blot analysis of BoARC1





















图 1 羽衣甘蓝 BoARC1 与油菜 BnARC1 氨基酸序列比对
不一致的氨基酸序列比对用灰色背景显示，“-”代表空位。
Fig. 1 Alignment of predicted amino acid sequences between BoARC1 and BnARC1
Different residues are shaded gray.“-”are introduced to optimize the alignment.

2.2 BoARC1 的 Sourthern 杂交分析
为了分析 BoARC1 在羽衣甘蓝基因组中的
拷贝数，将其基因组 DNA 经 EcoRⅠ、XbaⅠ、
SalⅠ限制性内切酶酶切消化，用 BoARC1 探针
进行杂交，结果显示只有单一的条带（图 2），
这说明 BoARC1 可能在基因组中只存在单一的
拷贝。而且，在获得的 BoARC1 序列中不存在
EcoRⅠ、XbaⅠ、SalⅠ限制性内切酶酶切位点，
这进一步确定 BoARC1 在基因组中只存在单一
的拷贝。
2.3 BoARC1 的表达分析
为了分析 BoARC1 在植物组织中的表达情况，分别提取各组织中的总 RNA，利用 Northern 杂交
的方法进行检测。结果表明，BoARC1 在根、茎、叶、花瓣、花药中没有表达，只在柱头中有表达，
在柱头发育的早期阶段（1 ~ 4 mm、4 ~ 6 mm 花蕾内的柱头）表达量较低，在柱头接近成熟阶段（6 ~
8 mm、8 ~ 10 mm 花蕾内的柱头和接近开花的花蕾）表达量增高（图 3）。
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图 3 BoARC1 的表达分析
1：0 ~ 4 mm 花蕾；2：4 ~ 6 mm 花蕾；3：6 ~ 8 mm 花蕾；4：8 ~ 10 mm 花蕾；5：接近开花的花蕾。
Fig. 3 Expression analysis of BoARC1
The stage numbers correspond to different bud sizes. 1：0–4 mm；2：4–6 mm；3：6–8 mm；
4：8–10 mm；5：Approaching the flowering period.
2.4 BoARC1 与 SRK 相互作用的分析
将 BoARC1、BnARC1 的编码区序列构建到 pGADT7 载体中，获得 AD-BoARC1 和 AD-BnARC1
质粒；把羽衣甘蓝 SRK13-b、甘蓝 SRK3、油菜 SRK910 的编码胞内域的序列构建到 pGBDT7 载体中，
获得 BD-SRK13-b、BD-SRK3、BD-SRK910 质粒。为了分析 BoARC1 与 SRK 胞内域的相互作用，将
获得的质粒相应地共转化到 Y187 酵母菌株。结果表明，共转化的酵母菌株能够在双缺陷（-leu-trp）
培养基中正常的生长，并且通过 X--gal 显色检验成蓝色（图 4），这说明 BoARC1、BnARC1 分别
与 SRK13-b、SRK3、SRK910 的胞内域存在相互作用。

图 4 利用酵母双杂交检测 ARC1 与 SRK 的相互作用
pGADT7-T 和 pGBDT7-53 质粒、pGADT7-T 和 pGBDT7-Lam 质粒分别共转化到酵母细胞中，作为阳性和阴性对照。
Fig. 4 Interaction analysis between ARC1 and SRK in the yeast two-hybrid system
Combinations of pGADT7-T and pGBDT7-53，pGADT7-T and pGBDT7-Lam
were the positive and negative controls，respectively.
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3 讨论
羽衣甘蓝是我国北方秋冬季节深受人们喜爱的一种观赏和食用植物。由于大部分羽衣甘蓝栽培
品种具有 SI，在育种过程中受到了人们的关注并且得到了应用。在本研究中，为了进一步探讨 SI 的分
子机制，作者从具有较强 SI 的羽衣甘蓝自交不亲和系（S13-bS13-b）中分离出 BoARC1 基因。BoARC1
在羽衣甘蓝的基因组中只存在单一的拷贝；氨基酸序列比对分析显示 BoARC1 与油菜 BnARC1 具有
较高（94%）的一致性；并且 BoARC1 主要在柱头组织内特异性地表达，而且在柱头接近成熟期时
表达量较高，这种表达的时空性是与 SI 反应相关的；此外，酵母双杂交试验分析显示 BoARC1 能
够与不同 S 单倍型的 SRK 胞内域进行相互作用，这说明 BoARC1 作为 SRK 下游的底物参与 SI 的反
应。
芸薹属植物 SI 反应发生在授粉过程中多个阶段，如花粉水合、花粉代谢的激活、花粉管的形成、
花粉管穿入柱头乳突细胞壁等（Heslop-Harrison，1975），这暗示 SI 信号转导的网路可能是复杂的。
在反向遗传学研究中发现，BnARC1 的反义转基因植株表型没有发生变化，但有打破 SI 的现象。因
此认为，ARC1 在 SI 信号传递过程中起着正向调控因子的作用。此外，在体外的生化分析中，BnARC1
具有 E3 泛素连接酶的活性，而且在自交授粉过程中蛋白质泛素化水平增加，因此推测 SI 反应是
ARC1 将其下游底物泛素化通过 26S 蛋白酶体途径降解引起的。最近发现，一个蛋白囊泡转运和分
泌复合体的成分 Exo70A1 作为 ARC1 下游的一个底物参与到 SI 反应中（Samuel et al.，2009；Chong
et al.，2010）。Exo70A1 能够被 ARC1 泛素化；在转基因试验中，过量表达 Exo70A1 的植株具有部
分打破 SI 的现象；Exo70A1 功能丧失的植株干扰了亲和花粉管的生长。
目前，虽然在 SI 信号转导途径中取得了一些进展，但对于 ARC1 介导 SI 反应的机制还存在许
多问题，如 ARC1-Exo70A1 信号途径不能完全打破 SI，这就暗示着 SI 信号网络还存在其它分支的
可能。本研究中分离和鉴定出羽衣甘蓝 BoARC1 基因，并且认为 BoARC1 作为 SRK 下游的底物参
与 SI。这为下一步筛选 BoARC1 相互作用的蛋白，通过功能获得和功能丧失的转基因试验来阐释
SI 的分子机制奠定了基础。

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